Download caso clínico: tinción de gram en sangre periférica para el estudio de

MICROBIOLOGÍA
CASO CLÍNICO: TINCIÓN DE GRAM EN
SANGRE PERIFÉRICA PARA EL ESTUDIO
DE FIEBRE DE ORIGEN DESCONOCIDO
Margaret Ordóñez Smith de Danies*, Gustavo Garnica Quintero**, Emily Danies Ordóñez***,
Jorge Mario Rodríguez Fernández****.
RESUMEN
P
aciente femenina de 21 años con cuadro clínico
de fiebre persistente por mes y medio asociado a
fractura de cráneo secundaria a accidente automovilístico. Consultó tres centros de salud sin poder esclarecer el factor etiológico, a pesar de hacerle múltiples
hemocultivos para gérmenes aerobios que bajo los estándares de Bacteriología, todos fueron negativos. Además se realizaron varios estudios diagnósticos y manejo
de múltiples tratamientos.
El médico tratante asegura un mal pronóstico oscilando entre 3 a 5 días fallecía. Se realiza un hemocultivo
modificado para bacterias anaerobias estrictas, facultativas, aerobias y hongos, y a la vez se hace un frotis de
sangre periférica de sangre total para la tinción de Gram.
Se observan a 100X estructuras de hongos y bacterias,
iniciándose el mismo día tratamiento antimicótico. A los
dos días siguientes se confirma el crecimiento de Serra-
* Microbióloga y Bacterióloga de la Universidad de Los Andes,
Especialización en Microbiología e Inmunología de la Universidad
Federal de Río de Janeiro, Brasil, Master en Microbiología de la
Pontificia Universidad Javeriana y Doctorado en Biología de la
Atlantic International University, EU. Directora Instituto de Microbiología Colombiano Ltda. [email protected]
** Médico, Neurólogo y Neurocirujano de la Pontificia Universidad Javeriana y Nancy-Université de Francia, fallecido el 26 de
agosto de 2005.
*** Médica General de la Pontificia Universidad Javeriana. Asistente de investigación en NYU -Universidad de New York, Langone Medical Center, EU [email protected]
**** Médico General de la Pontificia Universidad Javeriana. Científico asistente en investigación NYSPI- Columbia University Medical Center NY. EU [email protected]
4
tia marcescens y a los 10 días de Candida albicans. La
paciente al finalizar el tratamiento tiene resolución completa del cuadro clínico.
Dada la simplicidad, facilidad, rapidez y efectividad
de esta técnica diagnóstica económica, se desea resaltar
la utilidad de realizarla en escenarios clínicos con casos
de fiebre de origen desconocido como lo puede ser las
unidades de cuidado intensivo, salas de urgencia y hospitalización.
Palabras clave: Fiebre de origen desconocido, Frotis de Gram, Sepsis bacteriana, Candidemia.
TRABAJO ORIGINAL
INTRODUCCIÓN
El objetivo de presentar esta nueva técnica de “Frotis de Gram en sangre total para septicemias y bacteremias”, es dar a conocer un análisis muy sencillo, rápido,
útil, económico y valioso en el cual después de 5 a 10
minutos permite dar un diagnóstico en los casos de una
bacteremia o septicemia. Considerando el manejo en
equipo con el cuerpo médico, permite informar cuál es
el germen causal y de esta manera iniciar tratamiento
empírico, ahorrando días de estancia hospitalaria, evitando el uso indiscriminado de antibióticos de amplio
espectro y obteniendo economía por parte de medicamentos y exámenes de diagnóstico prolongados (1).
En las sepsis siempre se debe de esperar mínimo
dos a tres días porque no es factible que todos los laboratorios tengan un equipo costoso para que les informe en 48 a 60 horas el tipo de germen. El reporte del
Gram de los hemocultivos positivos es de gran ayuda,
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con la nueva técnica no exige tiempo de espera para
obtener el crecimiento del cultivo para dar un informe
inicial (2, 3).
Dentro de las guías prácticas de los laboratorios clínicos no se realiza un Gram o frotis directo de la sangre
total (4). En los únicos casos que usamos sangre seca
es cuando se busca parásitos con la gota gruesa o para
ver la morfología de las células en el frotis de sangre
periférica y se colorea con Wright (5). La propuesta es
que esta nueva técnica de colorear con Gram la sangre
total, se estandarice a nivel mundial para que todo laboratorio clínico o de Microbiología la pueda hacer, pues
no requiere de tecnología de avanzada ni de equipos
costosos.
MATERIALES Y MÉTODOS
lisina O (ASO) de 625 UI, en el cultivo de garganta está
la presencia de la Klebsiella oxytoca y Streptococcus no
hemolítico.
A los 52 días del accidente se hace un frotis de sangre periférico para colorear con Gram y se observan
blastoconidias, micelios y bacilos Gram negativos (Figuras No. 1 y 2). Inmediatamente se da el tratamiento
con Micostatin (Nistatina) 1gr/8 h. La paciente a los dos
días mejora ya no tiene fiebre y a los dos días de la
toma de los cultivos se confirma el crecimiento de Serratia marcescens y el antibiograma correspondiente
al día siguiente sensible a Netromicina. Luego a los 10
días hay la presencia de Candida albicans. La paciente
al finalizar el tratamiento tiene resolución completa del
cuadro clínico.
CASO CLÍNICO
Paciente femenina de 21 años, natural de Bello, Antioquia procedente de Bogotá quien ingresa a la Clínica
Palermo con un cuadro de 15 días de evolución consistente en fiebre de 38.5˚C con un antecedente de trauma
cráneo encefálico y hematoma subdural secundario a
accidente autovolístico (23 de junio de 1982). La paciente fue atendida inicialmente en la Clínica Nicolás de
Federman y posteriormente en el Instituto Neurológico
con varios hemocultivos negativos realizados en cada
centro de salud.
A los 15 días del accidente ingresa levemente taquicárdica, febril (38.5˚C), orientada y con examen
neurológico normal. Paraclínicos que muestran cuadro
hemático normal, líquido cefalorraquídeo (LCR): negativo, parcial de orina (PO): negativo, antígenos febriles:
negativos (a los 19 días del accidente), hemoparásitos:
negativos por 7 días consecutivos, cultivo de garganta
con Escherichia coli, hemocultivos negativos por 16
días. Tratamientos: recibe tratamiento antimicrobiano
por 2 días con gentamicina y luego 6 días con cefalexina
y cloranfenicol.
Figura No. 1. El frotis de sangre para hacer la coloración de Gram.
En la segunda hospitalización en la Clínica Palermo
(a los 23 días del accidente) continua febril 38.5˚C, de­
sorientada temporo espacialmente. Es tratada con lincomicina y cloranfenicol por 12 días.
A los 35 días del accidente continúa con la fiebre
de 38.5˚C. Se encuentra en LCR Staphylococcus (no
reportan su especie), en frotis de garganta hay Klebsiella
oxytoca, realizan otros 10 días de hemocultivos consecutivos y todos negativos. Se da por 6 días clindamicina
y sisomicina.
A los 47 días del accidente continúa con fiebre de
38.5˚C, diarrea, ictericia, proteínas séricas de 4.09 gr%,
leucocitos de 11.800 mm3, Hematocrito de 25%, Hemoglobina 8.1 g%, linfocitos atípicos 5%, antiestrepto-
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Figura No. 2. Imagen al microscopio óptico a 100X del frotis
directo de la sangre total con las blastoconidias,
micelios y bacilos Gram negativos.
5
RESULTADOS
DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS
DE LABORATORIO
tificaciones de los gérmenes se hacen de acuerdo a las
normas de Microbiología (9, 10, 11).
La técnica nueva de realizar un frotis de sangre total
o sangre periférica y colorearlo con la tinción de Gram,
nació un miércoles de junio de 1982, al presentarse el
cuadro de una paciente con fiebre de origen desconocido manejada con múltiples tratamientos antibióticos
sin mejoría manejada en prestigiosas instituciones.
Una colega solicita que: “se le haga un hemocultivo anaerobio estricto porque una familiar de 21 años
tuvo una fractura de cráneo, tiene fiebres de 38˚C 40˚C y ningún antibiótico le ha funcionado; está que
se muere porque le han realizado unos 40 o más hemocultivos desde hace mes y medio en prestigiosas
instituciones y ya le dijeron al marido que le avisara a
los parientes para el entierro porque no creían que viviría más de 3 a 5 días”. Cuando se le tomó la muestra
se realizó cultivos para anaerobios, facultativos, aerobios y hongos, y se hizo el extendido de frotis periférica de sangre recién tomada de la vena, aunque no
es una técnica estándar. La paciente estaba totalmente inconsciente, fue bastante difícil la toma de sangre
tocó de la pierna.
Gram: En el caso de fiebres altas, es muy útil el frotis
de la sangre, se puede hacer al puncionar el dedo o de
la vena cuando se van a realizar otros análisis. Y de ahí
extraer una gota para realizar un extendido como si fuese un frotis de sangre periférica. (1, 6, 7). Luego se fija
con calor o metanol y se hace la Coloración de Gram
(Violeta de Gram, Lugol de Gram, alcohol acetona y
safranina) (8) (Figura No. 1). Se observa con aceite de
inmersión a 100X las estructuras de los hongos y bacterias (Figura No. 2).
Cultivos: Inmediatamente se tomó la muestra de
sangre de la paciente, se inocularon varias gotas de
sangre en los diferentes medios de cultivo sólidos y líquidos. Y en los sólidos se hizo aislamiento con el asa
bacteriológica en forma de agotamiento. No se empleó
los medios estandarizados para hemocultivos como las
botellas de Ruiz Castañeda por no tenerlas en ese momento.
Se incuban los medios de cultivo en varios ambientes atmosféricos: aerobios (agar sangre, agar McConkey,
agar XLD, agar CLED con indicador de Andrade, agar
selectivo para Gram positivos y negativos); en facultativo el caldo tioglicolato y agar chocolate; y en la jarra
de anaerobiosis con el gas generador correspondiente el
caldo Schaedler, Medio de Carne Cocida y el agar Wilkins Chalgren y para hongos el agar Sabouraud y agar
Dermasel. A los dos días, creció en el agar chocolate
la Serratia marcescens. Pasados 10 días en el agar Sabouraud la Candida albicans (Figura No. 3). Las iden-
6
Figura No. 3. Cultivo de la Candida albicans.
Antibiograma por el método de difusión en
disco: Dicho procedimiento se realizó de acuerdo a la
estandarización de Kirby Bauer y CLSI (Clinical Laboratory Standards International) (antes NCCLS) en 3 cajas
de Petri con agar Mueller Hinton, cada caja con 8 antibióticos diferentes y dieron 23 antibióticos resistentes.
Se obtiene la sensibilidad a la netromicina. (10, 11).
DISCUSIÓN
Los diagnósticos diferenciales fueron:
• Cráneo encefálico y fractura de cráneo con posible
hematoma subdural.
• Meningitis.
• Hemoparásitos.
• Fiebre tifoidea o paratifoidea.
• Fiebre reumatoidea.
• Brucellosis.
Diagnóstico final
Septicemia por Candida albicans y Serratia marcescens.
La septicemia es una de las principales causas de
morbilidad en las unidades de terapia intensiva, se origina por bacterias, hongos o virus, los agentes causales son
las bacterias Gram negativas, las endotoxinas constituidas por lipopolisacáridos origina el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Otras reacciones similares se
deben a exotoxinas de bacterias Gram positivas, las cuales están compuestas por: peptidoglucanos, ácido lipoteicoico, lipoproteínas, ADN, glucolípidos, fragmentos de la
pared celular, enterotoxinas, proteasas, virus y levaduras
(12). Bacteremias se definen como presencia de bacte-
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rias viables en sangre, confirmada por medios de cultivos
y puede ser transitoria Ruimy R. et al. (13) afirman que
la presencia de una bacteria como el Staphylococci en
un extendido no significa que se diagnostique una bacteremia, porque puede haber cocos Gram positivos coagulasa negativo de la piel. En Estados Unidos Flayhart
D. et al., presentaron un estudio (14) en que atribuyen la
mortalidad del 20% al 50% a las bacteremias.
Estudio microbiológico
La coloración de Gram ha sido una tinción muy útil
desde hace muchos años. Appelbaum (15) describe en
orinas el Gram cuantificado y es muy preciso para poder saber el tipo de bacteria y es claro que conociendo el Gram se puede dar el tratamiento apropiado.
(15,16,17,18,19).
Tabla No. 1. Incidencia de los gérmenes aislados en los hemocultivos
de la Clínica Pediátrica Eusalud de Ordóñez Smith M. et al. 2012 (30).
Número
de casos
Porcentaje
Staphylococcus aureus
3
5.0
Staphylococcus no coagulasa
44
73.3
Streptococcus no hemolítico
1
1.6
Escherichia coli
4
6.6
Enterobacter cloacae
2
3.3
Citrobacter freundii
2
3.3
Klebsiella pneumoniae
2
3.3
Klebsiella oxytoca
2
3.3
Total
60
99.7
Bacteria
La realización de esta nueva técnica permitió esclarecer el diagnóstico de manera pronta al igual que el
inicio del tratamiento. La etiología de la resistencia de la
Serratia coincide con Bodey GP (20) que encontró con
esta bacteria en septicemias, con un patrón de resistencia antimicrobiana en pacientes de cáncer en los Estados
Unidos. En el Japón Ikegaya S. et al. (21) reportaron un
paciente de 77 años con diagnóstico de septicemia por
Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus meticilino resistente con refractariedad al tratamiento, hicieron un análisis de frotis de sangre periférica observaron
pseudohifas, inmediatamente inician antimicóticos aunque lamentablemente murió. Después de varios días en
el hemocultivo creció Candida albicans y en su autopsia
se observaron los hongos.
Desde hace varios años se sabe que la Candidemia
produce bastante morbilidad y mortalidad sobre todo
en los pacientes inmunocomprometidos (22, 23, 24,
25, 26, 27) o cuando han tomando antibióticos la flora intestinal se descompensa y comienza la diarrea, en
el estudio de gastroenteritis se encontró un 41.2% de
Candida albicans y 21.1% de Candida no albicans (28).
Nuestra paciente también presentó diarrea (en el día 47
de su accidente autovolístico) porque se le habían dado
varios antibióticos.
Elouennass M. et al. 2008 (29) en Francia estudiaron
entre el 2002 al 2005 la incidencia de las bacterias en
una unidad de cuidado intensivo y se encontró que el
49.3% eran por bacterias Gram negativas y el 46.85%
por cocos Gram positivos. La bacteria más frecuente
fue Acinetobacter baumannii (13.63%), Staphylococcus
aureus (12.6%), Staphylococcus epidermidis (12.6%),y
Pseudomonas aeruginosa (7%). En Colombia Ordóñez
Tabla No. 2. Incidencia a nivel mundial de la septicemia y las bacterias aisladas.
Fecha
Autor
País/Población
Incidencia
Porcentaje
2012
Viswanathan (31)
India
Neonatos en rural y urbano
urbano
Klebsiella pneumoniae
Gram negativos no
fermentadores
38.3
42.1
2012
Ordóñez Smith M. et al. (30)
Colombia
Staphylococcus no
coagulasa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
73.3
Clínica Pediátrica
6.0
5.0
2012
Micek S. et al. (32)
Estados Unidos
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
30.8
23.2
2012
West B. A. et al. (33)
Africa sub-Sahara
Neonatos
Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus aureus
58.0
20.4
2012
Suárez-García (34)
España
Un caso de bacteremia
Lactobacillus jensenii
2011
Shorr AF et al. (35)
Estados Unidos hospitalizados
Escherichia coli
Pseudomonas sp
55.1
17.1
2011
Serhan A. A. et al. (25)
Jordania
hospitalizados
Staph epidermidis
Gram negativos
47
35
Un caso
(Continúa)
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7
(Continuación Tabla 2)
Fecha
Autor
País/Población
Porcentaje
5
4.5
2.8
1.0
1.4
1.4
46.85
49.3
2008
Elouennass (29)
Francia
Servicio de reanimación
Gram positivas
Gram negativas
2006
Morrison (36)
Estados Unidos con cáncer
Gram positivas
(Staphylococcus)
Gram negativas (E. coli)
Hongos
42
45
13
2006
Bodey (20)
Estados Unidos con cáncer
Serratia sp
52
2005
Espino Hernández M. et al. (37)
Cuba
Neonatos
Cocos Gram Positivos
66.3
2005
Berkley (38)
Kenya Africa
Neonatos
Escherichia coli
Streptococci Grupo B
14
11
2004
Muller-Serieys (39)
Francia
Bacteremia Gram Negativas
Escherichia coli
Klebsiella spp
1998
Zamora (40)
México
Neonatos
Cocos Gram Positivos
S. M. et al. (30) realizaron un estudio en una clínica pediátrica con pacientes desde neonatos hasta 12 años
con una alta incidencia de las bacterias Gram positivas.
Tabla No. 1. Veamos cómo a nivel mundial se observa
la etiología de las septicemias en la Tabla No. 2, cinco de
los catorce autores enunciados obtuvieron más casos de
septicemia con bacterias Gram positivas y nueve de los
catorce con Gram negativas. Por lo tanto, hay gran variabilidad de etiología bacteriana por eso es importante
antes de dar el tratamiento hacer el Gram de la sangre
total.
CONCLUSIONES
De acuerdo a nuestro caso clínico y de otros autores es bastante probable tener septicemias micóticas, en
especial post-tratamientos antimicrobianos. El presente
trabajo sugiere la posibilidad de realizar un frotis de sangre total para el estudio del paciente con fiebre desconocida, posiblemente este y futuros estudios muestren
la importancia de aplicar esta técnica en urgencias y en
cuidados intensivos, lo ideal es prevenir el uso de tratamientos empíricos sin un fundamento claro que pueden
llevar a agravar la sintomatología del paciente séptico.
Asimismo, todo laboratorio clínico con o sin recursos
económicos debe tener en cuenta esta nueva técnica
como parte de los procedimientos estándares. Si se trabajan con medios tradicionales se puede sembrar con
gotas de sangre directamente y hay una probabilidad
de obtener los gérmenes. Sería importante hacer un estudio comparativo de los hemocultivos en las botellas
8
Incidencia
Candida
Cultivo mixto
Enterococcus
Staphylococcus
Bacillus
Difteroides
53.3
12.2
55
tradicionales con los medios sólidos. Los hemocultivos
son demorados y dicho tiempo puede tener implicaciones nefastas para el paciente. Siempre debemos pensar
en salvar vidas y eso se logra con un resultado oportuno
y veraz. ¿Cuántos casos no se podrán salvar por hacer
un simple frotis de sangre en un caso de fiebre elevada?
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