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MédiC3 Costo 8(2) 105·116; 1965.
Determinación de Ornitin Carbamil Transferasa en Teiidos
Normales y en Hepatitis Tóxica por Tetracloruro
de Carbono
DREs. G. JIMÉNEZ; G. MIRANDA;
1.
SOLANO
S.
y
R.
GUTIÉRREZ
S.*
Es un aforismo bien conocido de todos los que laboran en los campos
clínicos y de investigación, que no existe ninguna prueba de Laboratorio que
permita evaluar con certeza la actividad funcional del hígado en salud o en
enfermedad. La búsqueda de este tipo de prueba ha sido, por años, afán de
investigación, cuyo fruto nos permite contar hoy día con una serie grande de
pruebas que en forma más o menos específica complementan el estudio clínico
de los pacientes con hepatopatías, permitiendo afinar el diagnóstico hasta grados
nunca antes alcanzados, pero careciendo siempre de la certeza para proporcionarnos datos tales como total de masa hepática funcionante, índole y extensión de
la lesión que sufre, la fase de la enfermedad, los cambios en la distribución del
riego sanguíneo hepático, su capacidad regenerativa, etc.
De acuerdo con los trabajos de Reichard, la determinación de la actividad de la ornitín carbamil transferasa (OCT) se ha mostrado valiosa en el
diagnóstico de las enfermedades hepáticas. Igualmente este autor (1) trabaj ando
especialmente en perros, ha determinado los contenidos normales de dicha enzima
en diferentes tej idos sanos (2), con lo cual evidenció la mayor concentración
de la enzima en el tejido hepático en comparación con la concentración en otros
órganos de la economía. Debido a ello, puede esperarse que la determinación
de la OCT sérica, constituya una prueba de alta especificidad para demostrar al·
teraciones de la función hepática, en forma especial la necrosis de las células,
cuando se realiza su determinación en el suero (2-3-6).
Con estas ideas en mente, el propósito del presente trabajo ha sido eva.
luar en forma experimental, la actividad de la ornitín carbamil transferasa (Oer)
en tej idos diversos de ratas adultas sanas, así como el comportamiento de la
misma enzima bajo los efectos de la intoxicación experimental por tetradoruro
de carbono, en su forma intratisular y en su nivel en el suero sanguíneo.
La ornitín carbamil transferasa (OCT), también llamada Omitín Transcarbamilasa ,es una enzima que interviene en el ciclo de formación de la urea,
descrito por Krebs y Henseleit, el cual incluye la formación intermedia de ornitina, citrulina y arginina, catalizando la reacción reversible ornitina a citrulina.
En la formación enzimática de la citrulina se ha descrito una transferencia
de un grupo carbamil "activado" al grupo amino de la ornitina y se le ha identificado como el carbamil fosfato.
•
H. C. C. C. S.
s.
ACTA MEDICA COSTARRICENSE
106
La citrulina se forma según la siguiente reacción:
Carbamil fosfato
+
~
ornitina - - - -
citrulina
+
fosfato (A)
La enzima que cataliza esta reaCClOn (OCT) ha sido purificada del
hígado de rata por Reichard y es la misma enzima descrita por Krebs con el
nombre de citrulina fosforilada.
Arsenato
CITRULINA
------~
CO 2
+
NH 3
+
ORNITINA
La reacción anterior ocurre en dos etapas:
CITRULINA
ORNITINA (B)
+
ARSENATO
--~
CARBAMIL ARSENATO
+
El carbamil arsenato es un compuesto muy inestable y sin participación
enzimática se transforma en la siguiente forma:
CARBAMIL ARSENATO
---~
CO2
+
NH 3
+
ARSENATO
La reacción B. es la inversa de la reacción A., en la cual el fosfato es
sustituído por arsenato y se cataliza por la OCT.
La actividad de OCT puede ser medida por la formación de CO2 + NH 3
durante la arsenolisis de la citrulina, por lo que existen dos métodos para su
determinación:
a.
Utilizando citrulina marcada con CH y midiendo la cantidad que se forma
con CO2 radioactivo.
b.
Valorando la cantidad de NH 3 producido a partir del DL CITRULINA,
utilizando una técnica de microdifusión.
Ambas técnicas se han considerado de igual sensibilidad.
MATERIAL Y METODO
Se hicieron dos grupos de ratas blancas, machos adultos, del tipo Wistar,
con un promedio de peso de 317 gms, que se aislaron en cajas metálicas individuales y que recibieron dieta balanceada (Purina Rat Chow) yagua ad lib.
GRUPO -
A
Constituído por 25 ratas que fueron sacrificadas en masa. Se obtuvieron
dos muestras de cada uno de los siguientes órganos: hígados, intestino delgado,
pulmón, corazón, riñón y cerebro. Además, se obtuvo suero sanguíneo por
punción intracardíaca directa, previa al sacrificio del animal.
Jiménez, Miranda, Solano & Gutiérrez:
GRUPO -
Determinación de Ornitin earbamil Transferasa
107
B
Constituído por 22 ratas a las cuales se les administró tetracloruro de
carbono a la dosis de 500 mgms, por kilo de peso, por vía intraperitoneal,
dosis previamente valorada como consistentemente productora de lesión tisular
( 4). De este grupo se sacrificaron dos ratas cada día, posteriores al día en que
se provocó la injuria experimental, obteniéndose dos muestras de cada uno de los
tejidos mencionados y sangre mediante punción cardíaca, previa al sacrificio.
Los tejidos así obtenidos, fueron de inmediato puestos en congelación
(temperatura menor de 4°C) y homogenizados bajo la técnica descrita por
Bengmark (5).
La titulación de la actividad enzimática se realizó en el sobrenadante del
centrifugado de los homogenizados, mediante la técnica de microdifusión de
NH g •
Se utilizó la técnica de microdifusión de NH a. Se le agregó a 1 mI.
de substrato conteniendo 200 micromoles de DL-CITRULINA y 500 micromoles
de buffer arsenato sodio a pH.7.5, 1 mI. de suero u homogenizado del órgano
en estudio y se incubó durante 24 horas a 37°e. Las suspensiones de intestino
e hígado se diluyeron 1: 10.
Pasado el período de incubación se agregó ácido perc1órico (0.2 mI.
4N) y se centrifugó para separar el precipitado 1 mI. del sobrenadante se transfirió a la cámara externa de una cápsula de microdifusión de Conway; en la
cámara interna se colocó 1.5. mI. de HCL. 0.01 N. Sobre el sobrenadante de la
cámara externa se agregó 3 mI. de buffer el borato de potasio (12.3 gms. H g
BOa + 80 mI. de KOH 4 N + agua dest. csp. 500 m!.) y se incubó durante
2Y2 horas a 37°e., determinándose la cantidad de amonio de la cámara interna
por nesslerización.
Se utilizó un blanco de buffer arsenato de sodio, sin citrulina, que se
trató exactamente en la misma forma descrita anteriormente para cada muestra.
La cantidad de amonio formada en el blanco fue restada del amonio formada en la incubación conteniendo citrulina. Esta diferencia mide la actividad
de OCT y sus resultados se expresan en micromoles de amonio formado a partir
decitrulina por cada 1 gm. o 1 mI. del órgano o suero sanguíneo, respectivamente. Se utilizó un standar de sulfato de amonio neutro.
RESULTADOS
El contenido de orllltm carbamil transferasa en los tejidos normales demuestra en la gráfica NQ 1.
En la Gráfica N9 2 que muestra el contenido de OCT en pulmón normal
e intoxicado se puede observar que existe un descenso apreciable de la concen_
tración enzimática al sétimo día posterior a la intoxicación, recuperando sus niveles normales al octavo día.
Las Gráficas NQ 3, 5 Y 6, no muestran alteración de OCT en el contenido
intratisular, ya que en ningún momento los niveles descienden bajo el nivel
mínimo normal.
El comportamiento de los niveles enzimáticos en corazón (Gráfica NQ 4),
permite observar un descenso de pequeña magnitud al segundo día posterior a
la inyección con recuperación completa 96 horas después de la inyección de
tetracloruro de carbono.
108
ACTA MEDICA COSTARRICENSE
Los contenidos intratisulares de la ocr en hígado (Gráfica N'I 7) nos
muestra niveles de actividad que se mantienen dentro de 10 normal durante los
dos primeros días, para iniciar luego un descenso progresivo que llega a su sima
al quinto día posterior a la intoxicación, después en forma gradual recupera la
concentración normal al octavo día.
El análisis de la Gráfica
N~
8 nos muestra los siguientes puntos de interés:
l.-Contenido de ornitín carbamil transferasa en el suero normal, con una
fluctuación de 0.10 micromoles por Y2 ce. a un máximo 0.40 micromoles
por Y2 ce. de suero sanguíneo.
Una vez provocada la intoxicación se observa un aScenso violento desde las
primeras 24 horas, ascenso que se hace progresivo alcanzando su máximo a
las 48 horas posteriores a la intoxicación por tetracloruro de carbono, iniciándose luego un descenso progresivo que lleva a límites de normalidad al
sexto día posterior a la intoxicación.
COMENTARIO Y CONCLUSIONES
Según los trabajos de Reichard, la OCT es una enzima que alcanza las
mayores concentraciones dentro de la célula hepática, en proporciones tales que
resultan de alta especificidad, para detectar el grado de compromiso del parénquima hepático. Reichard ha realizado las determinaciones de esta enzima en
homogenizados de tejidos caninos de: hígado, intestino, corazón, pulmón y riñón.
Por nuestra parte, hemos realizado las mismas determinaciones en ratas, obteniendo niveles sensiblemente iguales para intestino delgado. Los niveles homogenizados de hígado fueron menores, 10 que atribuimos a la diferencia de especie. Esta misma explicación la hacemos válida para las concentraciones más elevadas en otros tejidos en nuestro reporte.
El contenido en suero sanguíneo normal en ambas especies, resulta sensiblemente igual, hecho que es corroborado también por Vallard.
El inducir experimentalmente la necrosis de los tejidos por tetrac1oruro
de carbono, en dosis previamente establecida, se puede observar que la mayor
parte de los tejidos analizados, mantienen concentraciones enzimáticas dentro
de los límites de desviación standard.
Los descensos observados en la concentración intratisular cardíaca y puL
manar son mínimos y no parecen ser los responsables de los niveles obtenidos
en el suero, si se tiene en cuenta el contenido tisular y el peso del órgano.
El principal responsable, entonces, de la elevación de la OCT en el suero
es la necrosis celular hepática, por 10 que esta prueba adquiere una mayor selectividad para la detección de daño de dicho órgano. Esta selectividad es mayor
que la de otras pruebas enzimáticas empleadas actualmente en la clínica.
]iméntz, Miranda, Solano
oc,
Glltiérrtz:
109
Determinación de Ornitin Carbamil Transferasa
GRAFICA N" 1
ORNITIN . CARBANIL - TRANSFERASA
CONTENIDO EN TEJIDOS NORMALES
TEJIDO
Hígado
CONfENIDO
DE
+
1.215.50
389.00
359.50
215.00
Cerebro
47.00
43.00
Corazón
34.87
11.60
Riñón
34.50
27.50
Pulmón
17.28
9.30
Intestino Delgadc
BIBLIOGRAFIA
l.-REICHARD HANS.
Ornithine carbamyl transferase acttvtty in human serum In diseases of the liver and
the biliary system., J. Lab. Clin. Med. 57:78·87. 1961.
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J. Lab. Clin. Med.,
52:
ACfA MEDICA COSTARRICENSE
110
GRAFICA No. 2
ORNITIN - CARBAMIL - TRAN5FERA5A
PULMON
JO
IJAXIWO 26.58
25
20
NORMAL 17.28
15
¡;;
""
C
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lO
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MINtMO 8:00
5
8
oI A S
O E
4-
9.30
10
/1
Jimé1lez, Mirdllda, So/a1l0 & Guliérrez:
Determinación de Ornitin Carbamil Transferasa
GRAr/CA No. 3
ORNITIN - CARBAMJL - TRAN5FERA5A
R/ Ñ O N
65
MAXIMO BOnO
M
,')5
50
45
¡;
.:2
;;¿
40
NORMAL 34.50
35
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3D.
25
20
/5
MtNfUO 1.00
':1
IV
DI A S
DE ±. 27.50
111
ACTA MEDICA COSTARRICENSE
112
CRAfICA No. 4
ORNITIN - CARBAMIL - TRAN5FERA5A
CORAZON
MAXIMO 46.47
40
NORMAL 34.87
35 t-------------f-----------lr-~"--------
30
¡¡
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25
MINIMO 23.21
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OI AS
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+
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ro
11
liméller, Mirallt/II,
s.r""" (,
Gllfiirr,r:
Determinadón de Omitin Carbamil Transferasa
113
GRAFleA No. 5
ORNITIN • CARBAMIL - TRANSFERASA
CEREBRO
MAXIMO 90.00
SO
80
lO
60
l..,
ci
~
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50
NORMAL 41.110
."
JO
20
10
M/N/AlO 4.00
2
6
8
DI A S
DE +
43.00
s
/O
11
114
ACTA MEDICA COSTARRICENSE
GRAFICA No
6
ORNITIN - CARBAMIL - TRANSFERASA
INTESTINO DELGADO
600'
MAXIMO 574.50
550
5QO
450
¡¡
'"
Ó
'--
<:l.
400
NORMAL 359;50
350
300
250
200'
MINIMO 144.50
150
100
50
2
3
4
5
6
7
DI A S
DE +
215.00
B
9
10
'1
]iménez, Miranda, Solano & GIJ¡iérrez:
Determinación de Ornitin Carbamil Transferasa
GRAFleA No
1
ORNITIN - CARBAMIL - TRANSFERASA
HIGADO
'lOO
MAX/MO '604,50
1600
1500
1400
1300
NORMAL 1215.50
1200
1100
1000
11
'"o:;
900
::!:
800
MINIMO 828.50
":L
700
600
500
400
300
2
3
5
8
DI A S
DE
+
389.00
/O
"
115
ACTA MEDICA COSTARRICENSE
116
GRAfleA No. 8
ORNITIN • CARBAMIL - TRANsFERAsA
SUERO SANGUINEO
1
463
2.40
2.20
/.DO
r.80
1.60
"i
'"
~
~
~
1.40
1.20
1.00
0.80.
0.60
UAX}MO 0.40
OAO
0.20
M/N/AJO 0.10
2
3
4
5
8
DI A 5
10
11