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PARED CELULAR La mayor parte de las Bacterias posee una pared celular rígida rodeando al protoplasto. Las excepciones son los micoplasmas (dentro del dominio Bacteria) y algunas arqueas, como Thermoplasma. En el microscopio electrónico se puede observar como una capa en íntimo contacto con la membrana citoplásmica, con un espesor que oscila entre 10 y 80 nm (según especies) -frente a los 8 nm de la membrana celular- , y con una estructura más o menos compleja, según los tipos bacterianos. a) Las paredes celulares más frecuentes en Bacterias siguen dos modelos alternativos que, como veremos comparten un componente común: paredes de tipo Gram-positivo o de tipo Gram-negativo. b) Unas pocas Bacterias (como las del gén. Planctomyces) poseen paredes a base de proteínas. c) Las Arqueas poseen paredes diferentes a las de Bacterias y se pueden agrupar en diversos tipos. FUNCIONES 1) Gran rigidez, que contrarresta las fuerzas osmóticas a que está sometido el protoplasto (aguanta presiones de unas 5 a 15 atmósferas). Esta rigidez depende de: a) el grado de entrecruzamiento; b) el hecho de que el enlace ß(1 4) es muy compacto. La alternancia regular entre anillos piranósicos de NAG y de NAM genera uno de los polisacáridos más estables desde el punto de vista termodinámico, que recuerda en su “estilo” a la quitina y a la celulosa; c) la alternancia en el tetrapéptido, de aminoácidos en configuraciones D y L supone una factor adicional que confiere aún más fuerza estructural, y además permite que todas las cadenas laterales de estos aminoácidos se dispongan hacia el mismo lado, facilitando la formación de puentes de H. 2) Pero, al mismo tiempo, la estructura permite una notable flexibilidad. Ello colabora, junto con su rigidez, a soportar variaciones amplias de la tensión osmótica del protoplasto. 3) Condiciona la forma celular. Aunque la química del PG, por sí misma, no determina la forma, es su disposición espacial la responsable principal de esta forma. PAREDES DE LAS BACTERIAS Consisten en un esqueleto macromolecular rígido, llamado peptidoglucano (= mucopéptido o mureína), que en Gram-positivas se encuentra inmerso en una matriz aniónica de polímeros azucarados; y en Gram-negativas está rodeada por una membrana externa, e inmersa en un espacio periplásmico. Hans Christian Gram • • 1882 desarrolló la tinción Gram Principio: • Retención diferencial del cristal violeta durante el tratamiento con un decolante (solvente orgánico- etanol). Figure: 04-04a-01 Caption: The Gram stain. (a) Steps in the Gram stain procedure. Figure: 04-04a-02 Caption: The Gram stain. (a) Steps in the Gram stain procedure. 1 min Cristal Violeta Lavar Cristal Violeta Tinte cristal violeta (es un tinte cationico) Iodo 30 sec Lavar Iodo Decolorante -Etoh Etanol y acetona Safranina 1 min Lavar Safranina Resumen de cambios de color Resultado Aspectos importantes de la tinción gram • Pasos críticos • Preparación del Frotis • Decolorización • • Organismos Gram variable Tiempo de crecimiento del cultivo Execeso en cualquiera de los pasos puede resultar en un falso positivo Cultivos con mas de 24 horas pierden la capacidad de retener el tinte de cristal violeta Excessive Decolorization It is clear that the decolorization step is the one most likely to cause problems in the gram stain. The particular concerns in this step are listed below (reviewed in McClelland 2001) • Excessive heat during fixation. Heat fixing the cells, when done to excess, alters the cell morphology and makes the cells more easily decolorized. • Low concentration of crystal violet. Concentrations of crystal violet up to 2% can be used successfully, however low concentrations result in stained cells that are easily decolorized. The standard 0.3% solution is good, if decolorization does not generally exceed 10 seconds. • Excessive washing between steps The crystal violet stain is susceptible to wash-out with water (but not the crystal violet-iodine complex). Do not use more than a 5 second water rinse at any stage of the procedure. Insufficient iodine exposure The amount of the mordant available is important to the formation of the crystal violet - iodine complex. The lower the concentration, the easier to decolorize (0.33% - 1% commonly used). Also, QC of the reagent is important as exposure to air and elevated temperatures hasten the loss of Gram’s iodine from solution. A closed bottle (0.33% starting concentration) at room temperature will lose >50% of available iodine in 30 days, an open bottle >90%. Loss of 60% iodine results in erratic results. Prolonged decolorization 95% ethanol decolorizes more slowly, and may be recommended for inexperienced technicians while experienced workers can use the acetonealcohol mix. Skill is needed to gauge when decolorization is complete. Excessive counterstaining As the counterstain is also a basic dye, it is possible to replace the crystal violet—iodine complex in gram- positive cells with an over-exposure to the counterstain. The counterstain should not be left on the slide for more than 30 seconds. Gram Variable Verificación de la tinción gram Prueba KOH The KOH String Test is done using a drop of 3% potassium hydroxide on a glass slide. A visible loopful of cells from a single, well-isolated colony is mixed into the drop. If the mixture becomes viscous within 60 seconds of mixing (KOH-positive) then the colony is considered gramnegative. The reaction depends on the lysis of the gram-negative cell in the dilute alkali solution releasing cellular DNA to turn the suspension viscous. This method has been shown effective for food microorganisms (Powers 1995), and for Bacillus spp (Carlone et al 1983, Gregersen 1978), although it may be problematic for some anaerobes (Carlone et al 1983, but also see Halebian et al 1981). This test has the advantage of simplicity, and it can be performed on older cultures. False negative results can occur in the test by using too little inoculum or too much KOH (DNA-induced viscosity not noticeable). False positive results can occur from too heavy an inoculum (the solution will appear to gel, but not string), or inoculation with mucoid colonies. This can serve as a valuable adjunct to the tradition gram Stringing DNA Aminopeptidase Test L-alanine aminopeptidase is an enzyme localized in the bacterial cell wall which cleaves the amino acid L-alanine from various peptides. Significant activity is found almost only in Gram-negative microorganisms, all Gram-positive or Gram-variable microorganisms so far studied display no or very weak activity (Cerny 1976, Carlone et al. 1983). To perform the test, the reagent is used to make a suspension (with the bacteria). Aminopeptidase activity of the bacteria causes the release of 4-nitroaniline from the reagent, turning the suspension yellow. The test is especially useful for nonfermenters and gram-variable organisms, and is a one step test with several suppliers of kits. Results of the test are available in 5 minutes. In the test strips the substrate L-alanine-4nitroanilide is split by L-alanine aminopeptidase into L-alanine and 4-nitroaniline. The latter compound causes the bacterial suspension to turn yellow, this is regarded as evidence for the presence of L-alanine aminopeptidase Fluorescent Stains A popular combination of fluorescent stains for use in gram staining (particularly for flow-cytometry) involves the use of the fluorescent nucleic acid binding dyes hexidium iodide (HI) and SYTO 13. HI penetrates grampositive but not gram-negative organisms, but SYTO 13 penetrates both. When the dyes were used together in a single step, gram-negative organisms are green fluorescent by SYTO 13 while gram-positive organisms are red-orange fluorescent by HI which overpowers the green of SYTO 13 (Mason et al 1998). There are commercial kits available for this procedure, which requires a fluorescent microscope or a flow cytometer. Sizemore et al (1990) developed a different approach to fluorescent labeling of cells. Fluorescence-labeled wheat germ agglutinin binds specifically to N-acetylglucosamine in the outer peptidoglycan layer of gram-positive bacteria. The peptidoglycan layer of gram-negative bacteria is covered by a membrane and is not labeled by the lectin. A variant of this method has also been used to “gram stain” microorganisms in milk for direct measurement by flow cytometry. LAL-based Assay Charles River Laboratories has just released a product to be used with their PTS instrument – the PTS Gram ID (Farmer 2005). This methodology makes use of the same reaction used for the chromogenic LAL test. Gram-negative organisms, with bacterial endotoxin, initiate the LAL coagulase cascade which results in activation of the proclotting enzyme, a protease. In the LAL test, this enzyme cleaves a peptide from the horseshoe crab coagulen, resulting in a clot. It can also cleave a peptide from a synthetic substrate, yielding a chromophore (p-nitroaniline) which is yellow and can be measured photometrically at 385 nm (Iwanaga 1987). Gram-positive organisms, lacking endotoxin, do not trigger the color change in this method, while gram-negative organisms do trigger it. Results are available within 10 minutes. EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA En las bacterias Gram-positivas el peptidoglucano representa el componente mayoritario de la pared celular (50-80% en peso), mientras que en Gramnegativas supone sólo del 1 al 10%. Figure 4.45 Cell envelope structure COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO Pared Gram Positivo Peptidoglucano de una bacteria gram positiva Entrecruzamiento de tetrapéptidos Figure: 04-31a-c Caption: Manner in which the peptide and glycan units are connected in formation of the peptidoglycan sheet. (a) No interbridge in gramnegative Bacteria. (b) Glycine interbridge in Staphylococcus aureus (gram-positive). (c) Overall structure of peptidoglycan. The diagram depicts several ribbons of peptidoglycan cross-linked to one another. To visualize an entire single layer of peptidoglycan, imagine these cross-linked ribbons extending around a cylinder or sphere representing the cell as shown. G, N-acetylglucosamine; M, N-acetylmuramic acid. Tetrapéptido (entrecruzamiento) Efecto de la penicilina sobre el entrecruzamiento de los Tetrapéptidos Funciones: captación de magnesio, anclaje de la pared a la membrana, barrera de permeabilidad, son importantes antígenos de superficie con capacidad inmunogénica. Pared Gram Negativo Figure 4.49 Outer membrane Polysaccharide of LPS The Pyrogen-Test is done in two parts: the Pre- or Shamtest and the main test. According to the European pharmacopoeia, the pre test is 1 to 3 days befor the main test. A pyrogen-free isotonic sodium chloride (10 ml/kg KG) is injected and the temperature is measured. Is there no differences less then 0,6°C, the rabbits are used for the main test. For the main test, 3 animals will be injected after 90 minutes with the sample. Then, the temperature is measured 3 hours. The sample is pyrogenfree, if the sum of three animals temperature differences are less then 1.15°C Lymulus polyphemus El reactivo LAL La historia del descubrimiento del reactivo LAL comienza en 1956, cuando el doctor Frederick B. Bang reporta la muerte por coagulación intravascular en el cangrejo herradura americano Limulus polyphemus (fig. 1). Bang, junto a Jack Levin, revela en 1964 que las endotoxinas son el vector causante de la coagulación de la hemolinfa del Limulus. Cuatro años más tarde, estos investigadores comprueban que los elementos responsables de la coagulación inducida por endotoxinas son de naturaleza enzimática, y se encuentran dentro de los amebocitos, único tipo de células presentes en la hemolinfa azul de los cangrejos herraduras. El reactivo LAL es un extracto acuoso de los amebocitos, compuesto por una cascada de enzimas serino proteasas tipo tripsina capaz de reaccionar frente a pequeñas cantidades de endotoxinas. GRAM____?_____ GRAM____?_____ Bacterias peculiares • Mycobacterium- cubierta de ácido micólico • Mycoplasma- ausencia de pared celular • Formas L- pérdida de pared • Esferoplastos y Protoplastos Mycobacterium Mycobacterium Mycoplasmas Protoplastos – Esferoplastos- Formas L Son células tratadas con lisozima o penicilina en un medio isotónico, por lo que han perdido su pared celular pero se evitó que se hinchen y estallen. De las células Gram(+) se obtienen protoplastos, en cambio de las Gram(-) se obtienen esferoplastos (retienen partes de la pared celular). Los protoplastos carecen de mesosomas. Si son capaces de crecer y dividirse se denominan formas L. Algunas bacterias producen formas L espontáneamente (resistentes a los antibióticos que afectan la pared). Efecto de la penicilina a concentraciones subletales ACCION DE LA LISOZIMA PROTOPLASTOS VS ESFEROPLASTOS Formas L Formas L de Mycobacterium TABLA 4-1. Comparación de algunas características de bacterias gram-positivas y gram-negativas. Carácteristicas Gram-positivas Gran-negativas Tinción de Gram Retienen el cristal violeta y se tiñen de morado Se decoloran y toman el colorante de contraste (safranina), tiñéndose de rosa. Capa de péptido glucano Contenido en lipopolisacáridos (LPS) Gruesa (varias capas) Delgada (una capa). Virtualmente ninguna Alta Contenido en lípidos y lipoproteína Bajo (las bacterias ácido-alcohol resistentes tienen lípidos unidos al péptido glucano) Alto (debido a la presencia de membrana externa). Acidos teicoicos Presentes en muchas de ellas Ausentes. Espacio periplásmico Ausente Presente. Membrana externa Ausente Presente. Estructura de los flagelos 2 anillos en el cuerpo basal 4 anillos en el cuerpo basal. Producción de toxinas Principalmente exotoxinas Principalmente endotoxinas. Resistencia a la rotura física Alta Baja. Sensibilidad de la pared celular a la lisozima Alta Baja (requiere un tratamiento previo para desestabilizar la membrana externa). Carácteristicas Gram-positivas Gran-negativas Sensibilidad a penicilina Marcada y sulfamidas Mucho menos marcada. Sensibilidad a estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclinas Mucho menos marcada Marcada. Inhibición por colorantes básicos Marcada Mucho menos marcada. Sensibilidad a detergentes aniónicos Marcada Mucho menos marcada. Resistencia a la azida sódica Marcada Mucho menos marcada Resistencia a la desecación Alta Baja. PARED CELULAR DE LAS ARQUEAS •Aunque las Arqueas pueden comportarse como Gram positivas o como Gram negativas, no se suele aludir a esto en este dominio de procariotas, ya que sus paredes tienen poco que ver con las de Bacterias. •Exceptuando el género Thermoplasma, carente de pared celular, las demás arqueas poseen, por encima de la membrana citoplásmica, algún tipo de estructura con funciones de pared celular. Capas S En muchos casos las funciones de pared celular son ejercidas simplemente por una capa S paracristalina a base de disposición regular de subunidades idénticas de una proteína o glucoproteína (por ejemplo: Methanococcus, Methanogenium). En ciertas arqueas de ambientes extremos, esta capa S está estabilizada por factores de esos ambientes: En el halófilo obligado Halobacterium las subunidades de glucoproteína se estabilizan por altas concentraciones de ión Na+. En el termoacidófilo Sulfolobus la estabilidad la confieren los bajísimos pH. En Methanospirillum y en Methanothrix varias células, cada una con su capa S, se encuentran englobadas por una vaina común, a base de proteínas y carbohidratos, con una estructura a base de anillos paralelos. En Methanosarcina y Halococcus la capa S se encuentra rodeada de metanocondroitina, un polímero a base de N-acetil-galactosamina, glucurónico, glucosa y manosa. (Esta metanocondroitina es similar al condroitín sulfato presente en tejido conjuntivo de animales). Pseudomureina Capa S Capa S Pseudomureina Finalmente, los miembros del orden Methanobacteriales poseen una pared de pseudomureína, un extraño peptidoglucano no basado en NAM. Consiste en un esqueleto de unidades repetitivas de NAG unidas por enlace ß(13) con N-acetil-talosaminourónico (NAT, un azúcar exclusivo de estos organismos). El grupo -NH2 del NAT va unido a su vez con un tetrapéptido, pero en éste sólo participan aminoácidos de la serie L. Al igual que en la mureína de las Bacterias, las diversas cadenas se unen entre sí por enlaces peptídicos entre el aminoácido terminal (4) de un tetrapéptido y el diaminoácido (3) de otra cadena. N-acetil-talosaminourónico Figure: 04-34 Caption: Pseudopeptidoglycan and S-layers. (a) Structure of pseudopeptidoglycan, the cell wall polymer of Methanobacterium species. Note the resemblance to the structure of peptidoglycan shown in Figure 4.30, especially the peptide cross-links, in this case between N-acetyltalosaminuronic acid (NAT) residues instead of muramic acid residues. NAG, N-Acetylglucosamine.