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CLONACIÓN E INTRODUCCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO Cromosoma eucariótico Vector de clonaje (plásmido) Digestión Digestión ADN Ligasa Sitio de corte Secuencias de reconocimiento Sitio de corte ADN cromosómico Extremos cohesivos Extremos romos ADN Ligasa Vector de clonación digerido con EcoRI y PvuII pBR322 PstI ADN “Extraño” ADN Ligasa ADN Hospedador Transformación de células de E. coli ADN Hospedador Transformación de células de E. coli Selección Todas las colonias que tienen plásmidos Agar + tet Colonias con plásmidos recombinantes Agar + tet (control) Agar + tet + amp Transformación de Escherichia coli -Células competentes -Electroporación TRANSFORMACIÓN EN PLANTAS Agrobacterium invade aprovechando los cortes Transferencia a placas con agar Placas con agar, hormonas y kanamicina Las plantas, resistentes a kanamicina, contienen el gen “extraño” Regeneración de las plantas Planta transformada con el gen para la GFP (proteína verde fluorescente) TRANSFORMACIÓN EN ANIMALES BIBLIOTECAS DE ADN - Una colección de fragmentos de DNA representativa de todo el genoma de un organismo que están clonados en un vector Construcción de una biblioteca genómica Construcción de una biblioteca grnómica: digestiones parciales Construcción de una biblioteca genómica: titulación N: número de clones necesario para tener una probabilidad P de que esté presente un gen P: probabilidad de que un gen esté presente f: tamaño medio del inserto/tamaño completo del genoma en kpb BIBLIOTECAS DE ADNc 5'- conector-cebador TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAA-3' ARNm Transcriptasa reversa 5-metil dCTP dATP, dGTP, dTTP CH3 - No representan todo el genoma sino los genes que se expresan en un momento determinado en un tipo celular o tejido. - Suelen construirse en vectores de expresión que permiten rastreo mediante anticuerpos o actividad enzimática. C H3 CH 3 CH 3 CH3 XhoI TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAA-3' ADNc 5-met ARN 3'5'- ARNasa H ADN polimerasa I dNTPs CH3 C H3 3'5'- CH 3 CH3 CH 3 XhoI TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAACTCGAG-3' ADNc 5-met ADN Ada ptadores EcoR1 ADN ligasa de T4 CH 3 EcoRI 3'-G... 5'-AATTC... CH3 CH 3 CH3 CH3 ADNc 5-met ADN XhoI EcoRI TTTTTTTTTTTTGAGCTC...CTTAA-5' AAAAAAAAAAAACTCGAG...G-3' Digestión Xho 1 EcoRI 3'-G... 5'-AATTC... CH3 CH3 CH3 CH 3 ADNc 5-met ADN CH3 XhoI TTTTTTTTTTTTGAGCT-5' AAAAAAAAAAAAC-3'
