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AGRONOMÍA MESOAMERICANA 17(1): 41-45. 2006
ISSN: 1021-7444
NOTA TÉCNICA
IDENTIFICACIÓN DE VIRUS QUE AFECTAN EL LOROCO
(Fernaldia pandurata) EN EL VALLE DE ZAPOTITÁN, EL SALVADOR1
Reina Flor Guzmán de Serrano2, Francisco J. Morales3
RESUMEN
ABSTRACT
Identificación de virus que afectan el Loroco (Fernaldia pundurata) en el Valle de Zapotitán, El Salvador. El loroco (Fernaldia pandurata) es una especie hortícola de gran
valor comercial y consumo en la dieta del pueblo salvadoreño y guatemalteco. Desafortunadamente, esta especie es afectada por diversas plagas entre las que se encuentran la mosca
blanca Bemisia tabaci, áfidos y enfermedades de aparente naturaleza viral. En esta investigación se examinaron plantas de
loroco con síntomas de mosaico y deformación foliar e inflorescencias cloróticas con el fin de determinar su etiología y
posibles agentes vectores. Las muestras se examinaron mediante microscopía electrónica y serología. La observación
de las muestras en el microscopio electrónico reveló la presencia de partículas filamentosas (600-700 nm) e isométricas
(30 nm) de aparente naturaleza viral. Las pruebas serológicas
demostraron que el virus filamentoso es una especie del género Potyvirus, y el virus isométrico es una especie del género Cucumovirus. No se encontraron virus del género Begomovirus transmitidos por mosca blanca. Se concluye aquí que
este insecto actúa solamente como plaga directa del loroco,
mientras que los áfidos se comportan como plaga y posibles
vectores de los virus detectados. Este es el primer informe sobre patógenos virales del loroco.
Identification of viruses affecting “Loroco”
(Fernaldia pandurata) in the Valley of Zapotitan, El
Salvador. ‘Loroco’ (Fernaldia pandurata) is a horticultural
species of great commercial value and importance in the diet
of the Salvadoran and Guatemalan people. Unfortunately,
this crop is affected by diverse pests, such as the whitefly
Bemisia tabaci, aphids and diseases of apparent viral nature.
In this investigation, variegated and malformed plants and
inflorescences were examined by electron microscopy and
serological assays for the presence of plant viruses. In these
assays, both filamentous (600-700 nm) and isometric (30 nm)
particles were observed by electron microscopy, and the
serological tests demonstrated that the filamentous virus is a
species of the genus Potyvirus, and the isometric virus is a
species of the genus Cucumovirus. No begomoviruses
transmitted by the whitefly Bemisia tabaci were detected in
the samples analyzed. These results suggest that B. tabaci is
a direct pest of loroco, whereas aphids are both a pest and the
probable vectors of the two viruses detected. This is the first
report on plant viruses affecting loroco.
Key words: Fernaldia pandurata, Bemisia tabaci, whitefly,
potyvirus, cucumovirus, begomovirus.
Palabras clave: Fernaldia pandurata, Bemisia tabaci,
mosca blanca, potyvirus, cucumovirus, begomovirus.
INTRODUCCIÓN
El loroco (Fernaldia pandurata - Apocynaceae) es
una enredadera nativa de El Salvador y Guatemala,
1
2
3
apreciada por sus inflorescencias comestibles desde
tiempos pre-hispánicos. El cultivo del loroco representa una buena alternativa para generar ingresos, particularmente en unidades campesinas de escasos recursos,
Recibido: el 4 de octubre, 2004. Aceptado: 2 de febrero, 2006. Presentado en la L Reunión Anual del PCCMCA, El Salvador, abril del 2004.
Laboratorio de Parasitología Vegetal, Centro de Tecnología Agropecuaria y Forestal. “CENTA”. Ministerio de Agricultura y Ganadería. El
Salvador. Correo electrónico: [email protected]
Coordinador Proyecto Mosca Blanca. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). AA 6713, Cali, Colombia. Correo electrónico:
[email protected]
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donde la mano de obra familiar puede atender este cultivo en la huerta casera, con excelente rentabilidad (US
$ 1.50/m2) (Parada et al. 2002; Osorio 2002). Este cultivo tiene un buen potencial de mercadeo en fresco con
posibilidades de compra en el mercado nacional e internacional. El Ministerio de Economía de El Salvador reporta para el año 2001 un volumen de exportación de
loroco de 1 290.081,41 kg por un valor de $2
386.599,92, significando un rubro más de ingresos para el país.
El loroco ofrece tanto oportunidades económicas
como retos para el control de plagas, tales como la mosca blanca Bemisia tabaci, los áfidos, enfermedades del
suelo y de aparente naturaleza viral. El incremento de
muestras del cultivo de loroco con síntomas de virosis
que ingresan al Laboratorio de Parasitología Vegetal de
CENTA desde el año 1999, ha despertado mucha preocupación, principalmente porque ha iniciado en cultivos presentes en el Valle de Zapotitán, departamento de
La Libertad, y posteriormente se ha extendido el daño a
otras áreas del país donde se siembra este cultivo comercialmente. El Proyecto Tropical de Manejo Integrado de Mosca Blanca, coordinado por el Centro Internacional de Agricultural Tropical (CIAT) y el Centro de
Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA) de El
Salvador, iniciaron estudios tendientes a determinar la
etiología de estas aparentes infecciones virales y el posible papel de la mosca blanca B. tabaci como vectora
de los agentes causales de estas enfermedades.
Figura 1. Acarrujamiento de hoja
Se tomaron muestras foliares de loroco con síntomas aparentes de virosis (Figuras 1, 2, 3 y 4) en cultivos afectados del Valle de Zapotitán, municipio de Ciudad Arce, departamento de La Libertad, así como en el
Cantón El Porvenir, municipio de Chalchuapa, departamento de Santa Ana (Figura 5).
En la Unidad de Virología del Centro Internacional
de Agricultura Tropical (CIAT), ubicado en el municipio de Palmira, Valle del Cauca, Colombia, se procesaron muestras de hojas, cogollos y flores de loroco procedentes de dos localidades de El Salvador: El
Porvenir (Santa Ana), y Zapotitán (Cantón Tres Ceibas,
Armenia, Sonsonate), las cuales presentaban síntomas
similares a los producidos por virus, tales como moteado, ampollado, amarillamiento suave a severo en las
hojas o entre las nervaduras, deformación de brotes y
decoloración floral (flores blancas).
Inicialmente, estos tejidos se observaron al microscopio electrónico de transmisión (Marca Jeol, modelo
JEM 1010) mediante tinción negativa con solución
acuosa de acetato de uranilo al 2% (Hitchborn y Hills
1965).
Igualmente, las muestras se examinaron mediante la
prueba inmuno-enzimática (ELISA) en su modalidad indirecta de fijación del antígeno a la placa (PTA-ELISA)
Figura 2. Ampollado de la hoja.
Figura 4. Comparación de flores sanas
(verdes) y enfermas (blancas).
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MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 3. Amarillamiento y ampollado en cogollos.
Figura 5. Amarillamiento de nervaduras y
moteado de la hoja.
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para detectar la posible presencia de virus pertenecientes
a las familias Bromoviridae: género Cucumovirus, especies virus del mosaico del pepino (CMV) y virus del raquitismo del maní (PSV) (Murphy et al. 1995) y Potyviridae: género Potyvirus y la ELISA en su modalidad
indirecta de triple emparedado (TAS-ELISA) para detectar la presencia de virus de la familia Geminiviridae: género Begomovirus, especie virus del mosaico dorado del
fríjol (BGMV).
Las pruebas PTA-ELISA (Lommel et al. 1982) se
realizaron cubriendo las placas con los antígenos o
muestras maceradas en dilución aproximada de 1/10 con
la solución tampón carbonato de cubrimiento, el cual
también sirvió de control blanco. Como anticuerpos se
usaron las líneas celulares monoclonales identificadas
como 10-5A9-1F9-1D5 específica para CMV y 102E12-2F6-2E1 específica para PSV producidas en el laboratorio de Virología del CIAT (Velasco et al. 1998),
ambos en dilución 1/5000 con solución tampón fosfato
salino más 0.5‰ de Tween 20 (PBS-Tween) (Clark y
Adams 1977) y un anticuerpo monoclonal específico
contra la región común de la cubierta proteínica de los
Potyvirus producido por el laboratorio USDA Florist
and Nursery Crops en Beltsville, Maryland, USA (Jordan y Hammond 1988 1986) y comercializado por la
compañía Agdia Inc. (Mishawaka, Indiana, USA) en dilución 1/200 con solución tampón PBS-Tween más
0,2% de sero-albúmina de bovino (BSA – Sigma A4503) y 2% de polivinilpyrrolidona MW 40.000 (Sigma
PVP-40). Como conjugados para todos los virus se utilizó una inmunoglobulina IgG comercial contra ratón
marcada con fosfatasa alcalina (Sigma A-5153) en dilución 1/2000 con PBS-Tween en las pruebas para detectar CMV y PSV y PBS-Tween + 0,2% BSA + 2% PVP40 para detectar potyvirus. Con las muestras y el
conjugado se hicieron incubaciones de dos horas a temperatura ambiente y con los anticuerpos monoclonales
se dejaron las placas a 4° C durante toda la noche.
La TAS-ELISA (BarJoseph y Malkinson 1980).para detectar la presencia del BGMV se realizó cubriendo
las placas con el antisuero policlonal #1110 producido
en conejo contra el begomovirus aislado de Macroptilium lathyroides en Homestead, Florida, USA (Hiebert
et al. 1991) en dilución 1/800 con el tampón carbonato
de cubrimiento, incubándose durante toda la noche a 4°
C. Luego, se adicionaron las muestras maceradas en dilución 1/100 con tampón fosfato salino (1x PBS), pH
7,4; se bloquearon los sitios no específicos de unión de
la placa con BSA al 1% disuelto en tampón 1x PBS
(Towbin y Gordon 1984) durante 30 minutos a temperatura ambiente; se agregó la línea celular monoclonal
identificada como 4C1-3F7, de amplio espectro serológico para los begomovirus transmitidos por mosca
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blanca, producido en la Universidad de Florida, Gainesville, USA (Cancino et al. 1995), en dilución
1/20000 con 1x PBS. Como conjugado se usó la IgG
anti ratón marcada con fosfatasa alcalina (Sigma A5153) en dilución 1/2000 con 1x PBS. Las incubaciones no especificadas, se hicieron durante una hora a
temperatura ambiente.
Entre cada paso de los diferentes procedimientos,
las placas se lavaron con tampón PBS-Tween (Voller et
al. 1976) cuatro veces, cinco minutos cada lavado, para eliminar los excesos de cada reactivo. Las soluciones tampones usadas fueron frescas, sin azida de sodio
y se adicionaron en volúmenes de 100 µl/pozo.
La detección del complejo antígeno – anticuerpo –
conjugado en todas las pruebas se realizó utilizando como substrato de color una solución fresca de p-nitrofenil fosfato (Sigma 104 – 105) a una concentración de 1
mg/ml en tampón de dietanolamina al 9,7%, pH 9.8.
Las reacciones colorimétricas se cuantificaron en valores de absorbencia a 405 nm, mediante un espectrofotómetro lector de ELISA Dynex – MRX, a los 30 y 60 minutos de haber agregado el substrato, sin detener la
reacción.
En todas estas pruebas ELISA siempre se incluyeron controles conocidos de cada uno de los virus a detectar: Un material sano como control negativo, un material enfermo como control positivo y un blanco como
control de la calidad y limpieza de las soluciones tampones usadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las muestras de loroco procesadas mediante tinción
negativa presentaron partículas alargadas o isométricas
similares a virus, con una longitud aproximada de 750 nm
o un diámetro de 30 nm en el caso de las partículas isométricas.
En el Cuadro 1 se presentan los resultados de los análisis serológicos. Según se observa, ninguna de las muestras de loroco resultó positiva para begomovirus, aunque
en algunos cultivos de loroco se encontraban poblaciones
altas de la mosca blanca B. tabaci. Por el contrario, todas las muestras resultaron positivas para potyvirus, y seis
muestras resultaron positivas para cucumovirus.
Los resultados obtenidos están de acuerdo al tipo de
partícula observada en el microscopio electrónico, así como a los síntomas observados, ya que los potyvirus tienden a inducir mosaicos y amarillamientos, mientras que
los cucumovirus causan deformaciones foliares severas
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Cuadro 1. Resultado de los análisis serológicos realizados a muestras foliares de loroco
afectado por enfermedades virales en el Salvador, Centro América. El
Salvador, 2004.
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
Localidad
El Porvenir
El Porvenir
El Porvenir
El Porvenir
Zapotitán
Zapotitán
Zapotitán
Zapotitán
Síntoma*
Begomovirus
ELISA
Potyvirus
Ai
A,M
Ai,CI
A,D
A,D,CI
A,D,CI
A,D,CI
A,D,CI
-
+
+
+
+
+
+
+
+
Cucumovirus
+
+
+
+
+
+
* A= amarillamiento foliar; i= intenso; M= mosaico; CI= clorosis de las inflorescencias;
D= deformación foliar.
por lo general. La clorosis de las inflorescencias no está
necesariamente asociada a las enfermedades virales detectadas, sino parece ser un trastorno fisiológico causado
por la alimentación del biotipo B de la mosca blanca B.
tabaci detectado ya en El Salvador (datos no publicados),
como se ha observado en otros cultivos atacados por esta
plaga, tales como la habichuela y algunas cucurbitáceas
(observación personal). Los dos virus detectados son
muy posiblemente transmitidos por áfidos, los cuales se
encuentran frecuentemente asociados al cultivo del loroco en El Salvador.
de jabones o detergentes no fitotóxicos. Este es el primer
informe sobre patógenos virales del loroco.
RECOMENDACIONES
Investigar a fondo el efecto del uso de coberturas
en el cultivo del loroco en cuanto a los aspectos de sanidad, fisiología y producción.
AGRADECIMIENTOS
CONCLUSIONES
En esta investigación se identificaron dos virus diferentes en plantas de loroco afectadas por variegaciones y deformaciones foliares en el Valle de Zapotitán,
El Salvador. Estos virus son probablemente transmitidos por áfidos de manera no-persistente, es decir, en
cuestión de segundos. Por esta razón, no se recomienda
el control químico. Durante la realización de este
trabajo se están evaluando coberturas de hoja de palma
para la etapa inicial de las plantaciones, con el fin de
disminuir la incidencia temprana de áfidos y, por consiguiente, de estas enfermedades virales en las etapas
más susceptibles de crecimiento del loroco.
La mosca blanca y específicamente el biotipo B de
B. tabaci, debe ser controlada como plaga y no como vector de virus. La clorosis de las inflorescencias esta probablemente asociada a esta plaga, por lo que se pueden usar
insecticidas sistémicos selectivos o simples aplicaciones
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Los autores agradecen al Departamento para el Desarrollo Internacional del Reino Unido (DFID) por su
apoyo financiero, y a los asistentes de investigación
Ana Cecilia Velasco y José Arroyave por su ayuda en
los trabajos de serología y microscopía electrónica, respectivamente.
LITERATURA CITADA
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