Download Cinética enzimática (alfa

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502504
GUIA No 5.1- Cinética enzimática (alfa-amilasa).
I. EL PROBLEMA
-
Observar el efecto de la concentración de sustrato y de enzima en la velocidad de
reacción enzimática.
II. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN.
-
Efecto de la concentración de enzima y de sustrato en la velocidad de reacción
Ecuación de Michaelis-Menten de la velocidad de reacción enzimática
Significado de la velocidad máxima y de la constante de Michaelis.
III. MATERIALES Y REACTIVOS.
Materiales por grupo.
-
20 tubos de ensayo
un vaso de precipitados de 450ml
dos vaso de precipitados de 250ml
5 pipetas graduadas de 5ml
Una placa de calentamiento
Una gradilla
Un aro con nuez
Una pinza para tubo de ensayo
Un frasco lavador
Un pipeteador
Materiales y reactivos generales. (volumnes calculados para 10 grupos de laboratorio)
-
Solución de almidón al 1% ( 2,0 L)
Buffer pH 7,2 (1,0 L)
Solución de α-amilasa
Ácido 3,5-dinitrosalicílico ( 1 L)
Agua destilada
Dos baños de maría a 35ºC
Espectrofotómetros y celdas
Micropipetas de 0 a 100 lamdas y puntas
Toallas de papel.
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IV. PROCEDIMIENTO.
1. Efecto de la concentración de sustrato:
Tabla No 1:
tubo
B
1
2
3
4
5
6
Almidón (ml)
5,0
0,5
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Buffer pH 7.2 (ml)
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Agua (ml)
5,1
9,5
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
Enzima (µl)
0,0
100
100
100
100
100
100
En siete (7) tubos de ensayo adicionar las cantidades de solución de almidón, buffer pH 7,2 y agua
que se indican en la tabla No1. Colocar los tubos al baño maría a 35ºC por 5 minutos, luego
agregue la cantidad de enzima especificada en la tabla, homogenice y deje incubando a la misma
temperatura por 10min.
Pasado el tiempo de incubación, agregue 3 ml de la solución del ácido 3,5-dinitrosalicílico y
coloque los tubos en un baño a ebullición por 7minutos; retire y enfríelos cuidadosamente en un
chorro de agua fría o en un baño de agua con hielo.
Lea la absorbancia de cada uno de los tubos a 575nm.
2- Efecto de la concentración de enzima:
Tabla No 2:
Tubo
B
1
2
3
4
5
6
Almidón (mL)
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Buffer pH 7,2 (mL)
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Agua (mL)
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Enzima (µL)
0,0
5
15
30
50
80
100
En siete (7) tubos de ensayo adicionar las cantidades de solución de almidón, buffer pH 7,2 y agua
que se indican en la tabla No1. Colocar los tubos al baño maría a 35ºC por 5 minutos, luego
agregue la cantidad de enzima especificada en la tabla, homogenice y deje incubando a la misma
temperatura por 10min.
Pasado el tiempo de incubación, agregue 3 ml de la solución del ácido 3,5-dinitrosalicílico,
homogenice y coloque los tubos en un baño a ebullición por 7minutos; retire y enfríelos
cuidadosamente en un chorro de agua fría o en un baño de agua con hielo.
Lea la absorbancia de cada uno de los tubos a 575nm.
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V. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRACTICA.
-
Datos y observaciones debidamente tabulados
Realice las gráficas de velocidad vs concentración de sustrato y de velocidad vs
concentración de enzima.
Realice las gráficas de Lineweaver-Burk y de Eodie-Hoffte para calcular la velocidad
máxima de la reacción y la constante de Michaelis.
VI. BIBLIOGRAFÍA.
-
Bohinski, R. Bioquímica.1998. Quinta edición, Pearson Educación, México
-
Horton, R.H; Moran, L.A; Ochs, R.S y otros. Bioquímica, 1993. Prentice Hall
Hispanoamericana S.A., México.
-
Plummer, D. Bioquímica Práctica, Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, México,1981.
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