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Resumen: M-058
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Análisis diferencial de Celularidad, Viabilidad, Apoptosis y Mitosis
en médula ósea murina tratada con diferentes dosis de Etopósido.
Lucas, Ana G. - Aguirre, María Victoria - Aquino Esperanza, José A.
Aizpuru, Gualberto R. - Brandan, Nora
Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE.
Moreno 1240. Corrientes (3400). Argentina
E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
Durante la pasada década se han desarrollado una gran diversidad de nuevas drogas oncológicas, entre las cuales se
encuentra el Etopósido (ET), derivado semisintético de la podofilotoxina también conocido como VP-16 (1, 2). El
mismo se utiliza ampliamente en el tratamiento de leucemias, linfomas y varios tumores sólidos incluyendo cáncer
testicular y de ovario (3).
El ET inhibe la actividad de la topoisomerasa II a través de la formación de un complejo ternario DNA-Topoisomerasa
II- ET. Las topoisomerasas II son enzimas que provocan rupturas transitorias de las cadenas de ADN facilitando el
alivio de tensiones e impidiendo la formación de nudos en el DNA neosintetizado, por pasaje de segmentos intactos de
éste a través de brechas transitorias en la doble cadena de DNA original (4).
La inhibición de las topoisomerasas por ET se produce por estabilización del complejo formado entre este agente y la
topoisomerasa en los extremos clivados 5´del ADN, para formar fragmentos de ADN no reparables ligados a la proteína
(5). Las células dañadas poseen mecanismos capaces de reconocer tales alteraciones en el ADN y en consecuencia,
eliminarlas a través de la apoptosis (6).
El propósito del presente trabajo es evaluar el efecto de diferentes dosis de ET (20 y 40 mg/kg) administradas por única
vez, sobre la celularidad total, viabilidad, mitosis y apoptosis en médula ósea utilizando un modelo murino “in vivo”
durante un período de 20 días post-injuria.
MATERIALES Y MÉTODOS
ANIMALES Y ADMINISTRACION DE LAS DROGAS
Se utilizaron ratones adultos isogénicos de la cepa Swiss CF1 (peso aproximado 26 a 28 g) provenientes del bioterio de
la Facultad de Medicina de la UNNE. De estos animales, se obtuvieron muestras de médula ósea a partir del fémur
murino. Los ratones fueron mantenidos con dieta estándar, y dispusieron de agua libremente.
El ET (Delta Farma) se disolvió en solución salina a una concentración de 1mg/ml. Los ratones (n=6) recibieron una
sola inyección por vía intraperitoneal de ET (20 o 40 mg/kg), y los estudios se realizaron a los 2, 5, 7.10 y 15 días post
tratamiento. El grupo control recibió solución salina (n=6)
DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR
Células de médula ósea, a los tiempos determinados fueron suspendidas en PBS y colocadas en hielo hasta que se
realizó el contaje celular. Un pequeño volumen de Trypan Blue (0.4 %) (Sigma) fue agregado a igual volumen de
suspensión celular y la mezcla fue incubada por 5 minutos. La muerte celular se determinó por la presencia del Trypan
Blue citoplasmático. El número total de células y el porcentaje de células no viables se determinó usando un
hemocitómetro bajo microscopia óptica.
La viabilidad celular se expresó como el porcentaje del número de células vivas/ número de células totales. Este
estudio fue realizado por triplicado.
DETERMINACIÓN DE LA CELULARIDAD
Los ratones se anestesiaron con pentobarbital (3%) y fueron sacrificados por dislocación cervical a los tiempos
especificados en el protocolo. Se obtuvo médula ósea a partir de los fémures por lavado repetitivo con IMEM
buffereado, utilizando jeringa estéril con aguja G21. La celularidad en medula ósea se determinó utilizando una cámara
de Neubauer. Los resultados fueron expresados como el células totales X 10 6/ fémur (media ± SEM).
DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR
Las células de médula ósea, a los tiempos determinados fueron suspendidas en PBS y colocadas en hielo hasta que se
realizó el contaje celular. Un pequeño volumen de Trypan Blue (0.4 %) (Sigma) fue agregado a igual volumen de
suspensión celular y la mezcla fue incubada por 5 minutos. La muerte celular se determinó por la presencia del Trypan
Blue citoplasmático. El número total de células y el porcentaje de células no viables se determinó usando un
hemocitómetro bajo microscopia óptica. La viabilidad celular se expresó como el porcentaje del número de células
vivas/ número de células totales. Este estudio fue realizado por triplicado.
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CUANTIFICACIÓN DE LA APOPTOSIS
Las células teñidas con May-Grundwald-Giemsa fueron observadas mediante microscopia óptica, detectándose las
células apoptóticas en base a cambios morfológicos típicos (fragmentación nuclear, formación de cuerpos apoptóticos y
burbujas en la membrana plasmática) (18). Para su semicuantificación se midió el índice apoptotico, definido como el
numero de celulas apoptóticas por campo respecto numero de células totales observadas por campo, contando diez
campos representativos por extendido.
DETERMINACIÓN DE LA MITOSIS POR MICROSCOPÍA ÓPTICA
Las células teñidas con May-Grundwald-Giemsa fueron observadas mediante microscopia óptica, detectándose las
células mitóticas en base a sus cambios morfológicos típicos (husos mitóticos y cariocinesis).
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La celularidad en médula ósea fue determinada a los 2, 5, 7, 10 y 15 días después de la administración de diferentes
dosis de ET (20 y 40 mg/kg). Como se muestra en la Figura 1, la administración de 20 mg/kg del citotóxico, produjo
cambios estadísticamente significativos en la celularidad femoral a los 7 días post-tratamiento (p < 0.05); en cambio,
una mayor dosis del citotóxico produjo una disminución en la celularidad de 2.75 veces respecto a los valores normales,
a los 2 días post-tratamiento (p < 0.01).
Efectos del Etopósido (20 mg/kg) sobre la Celularidad Femoral
Efectos del Etopósido (40mg/kg) sobre la Celularidad femoral
35
25
Células x 10 6 /fémur
Células totales/fémur (x10
6
)
40
30
*
20
15
10
5
30
20
**
10
0
0
0
5
10
15
0
20
5
10
15
20
25
Días post-etopósido
Días post-Etopósido
Figura 1: Efectos de diferentes dos is de ET s obre la celularidad en médula ós ea. Los res ultados s e expres an como
la media +/- SEM de tres diferentes experiencias (6 ratones /lote).
Al estudiar la viabilidad celular en médula ósea murina, tras la inyección de las diferentes dosis de ET, se observó que
la dosis baja del citotóxico no indujo cambios estadísticamente significativos, sin embargo, la mayor dosis produjo
variaciones estadísticamente significativas a los 2 días post-injuria (p < 0.05). Estos resultados se muestran en la
Figura 2.
Efectos de Etopósido (20mg/kg) sobre la Viabilidad Femoral
Efectos del Etopósido (40mg/kg) sobre la Viabilidad Femoral
95
90
90
85
%
% de Viabilidad Celular
100
*
80
80
75
70
70
0
5
10
15
Días post-etoposido
20
0
5
10
15
20
25
Días post-etopósido
Figura 2: Efectos de diferentes dosis de ET sobre la viabilidad en médula ósea. Los resultados fueron expresados como la
media +/- SEM de tres diferentes experiencias (6 ratones/lote).
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Cuando se cuantificó la apoptosis en médula ósea mediante microscopía óptica, se observó que la administración del 20
mg/kg de ET no produjo cambios estadísticamente significativos a los tiempos previstos. Sin embargo, al utilizar 40
mg/kg del citotóxico, se evidencia a los 2 días post- inyección el mayor nivel (17 veces el valor control) de apoptosis (p
< 0.01); siguiendo elevado (7 veces el valor normal) a los 5 días post-tratamiento (p < 0.01), para descender a cifras
normales entre los 7 y 15 días post-injuria y aumentar nuevamente (5 veces el valor control) a los 20 días post-ET (p <
0.01).
Apoptosis en MO tras la inyección de ET (20 mg/kg)
Apoptosis en MO tras la inyección de ET (40 mg/kg)
**
8
7
6
1.00
5
0.75
%
% de cél apoptóticas
1.25
4
**
**
3
0.50
2
0.25
1
0
0.00
0
0
5
10
15
5
20
10
15
20
25
Días post-etopósido
Días post-etóposido
Figura 3: Apoptosis inducida por diferentes dosis de ET en médula ós ea murina. Los resultados s e expresan como la media
+/- SEM de tres diferentes experiencias (6 ratones /lote).
Como se muestra en la Figura 4, el índice de mitosis en médula ósea murina disminuye 7 veces el valor control a los 2
días tras la inyección de una dosis baja de ET (p < 0.01). En cambio, con una dosis de 40 mg/kg, de ET se observa la
ausencia de mitosis en médula ósea a los 2, 5, 7, 10 y 15 días post-inyección del citotóxico (p < 0.01).
Mitosis en MO tras la inyección de ET (20 mg/kg)
Mitosis en MO tras la inyección de ET (40 mg/kg)
1.5
1.0
1.0
%
%
1.5
0.5
0.5
**
0.0
0
2
5
7
10
Días post-etopósido
15
0.0
0
**
**
**
**
**
2
5
7
10
15
20
Días post-etopósido
Figura 4: Efectos de diferentes dosis de ET sobre el indice de mitosis en MO Los
resultados fueron expresados como la media +/- SEM de tres diferentes experiencias (6
ratones/lote).
CONCLUSIONES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
El porcentaje de mitosis representó el parámetro más sensible, en respuesta a diferentes dosis de ET.
Los porcentajes de apoptosis y viabilidad femoral no presentaron variaciones significativas a dosis única de 20
mg/kg de ET; sin embargo, se vieron alterados al utilizar la doble dosis.
La celularidad total de médula ósea se ve fuertemente afectada con la dosis de 40 mg/kg (2 días postinyección), respecto a la observada con 20 mg/kg (7 días post-tratamiento).
La celularidad y la viabilidad se vieron afectadas con 40 mg/kg de ET, solamente a los 2 y 5 días
respectivamente, recuperándose rápidamente.
A los 20 días post-administración con 40 mg/kg de ET, el porcentaje de mitosis en MO regresa a los valores
normales.
El ET afecta, en función de la dosis y el tiempo, todos los parámetros analizados (celularidad, viabilidad,
mitosis y apoptosis en MO).
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BIBLIOGRAFÍA
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