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Medida de la actividad enzimática
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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: MEDIDA POR MÉTODOS CONTINUOS Y DISCONTINUOS.
Salvo para unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas
espectroscópicas directas, la presencia de una enzima es determinada por la medida de la
reacción que cataliza, pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la
reacción. Además, la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad
en diferentes condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia
para la investigación y análisis de proteínas.
La figura 1 muestra una curva típica de
Figura 1
formación de un producto (P) en función del tiempo
para una reacción catalizada enzimáticamente. Se
observa que la velocidad disminuye con el tiempo,
hecho que puede deberse a las siguientes causas:
9 Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima
9 El transcurso de la reacción produce una
disminución significativa de la concentración de
sustrato (S)
Tiempo
9 La reacción inversa puede comenzar a cursar y
hacerse relativamente importante al aumentar la
concentración de P
8
P
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad
inicial, esto es, obtener la tangente al origen del gráfico mostrado en la figura 1. De esta
manera, las diferentes causas que producen la disminución de la actividad con el tiempo son
eliminadas.
La figura 2 ejemplifica medidas experimentales
de la formación de P en función del tiempo (como en
la fig.1), determinadas a tres concentraciones
diferentes de S. Puede observarse que la velocidad
(v) que se obtendría en cada caso dependería del
intervalo de tiempo que se tomara para medirla.
Figura 2
1
s3
P
s2
s1
En este ejemplo, si medimos v para cuando
obtendríamos
el
mismo
valor,
S=S1,
independientemente de haber elegido el intervalo 01 o el 1-2. En cambio para S=S2, la v obtenida sería
Tiempo
distinta según el intervalo elegido. Para estos dos
casos, la v podría calcularse adecuadamente
eligiendo el intervalo 0-1, donde la formación de P
es función lineal con el tiempo. Para el ejemplo de la figura 2, la medida de v, cuando S=S3,
usando el intervalo 0-1, no es enteramente confiable ya que se necesitan más puntos
experimentales que verifiquen la condición de linealidad en la estimación de v realizada.
0
0
1
2
3
4
5
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Medida de la actividad enzimática
2
Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo, hay que tener en
cuenta que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura, la
fuerza iónica, el pH, la concentración de S, la cantidad de enzima en el medio de medida.
Todos estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de
actividad enzimática.
La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la
aparición de un P de la reacción en función del tiempo. La determinación cuantitativa de S o
de P puede hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos
(los más comunes), volumétricos, potenciométricos, radioquímicos, espectrofluorométricos.
Independientemente del método utilizado, puede suceder que para, por ejemplo, una
reacción enzimática: Sa + Sb Æ P + Q, pueda medirse Q en presencia de los otros
componentes de la mezcla de reacción. En este caso, la reacción enzimática podría seguirse
continuamente en función del tiempo. En consecuencia, podrían obtenerse numerosos
puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la
producción de Q en función del tiempo, a partir de un único medio de reacción. Esto es lo
que se denomina método continuo de medida de la actividad enzimática.
Los ejemplos típicos de métodos continuos
empleados para medir actividad los constituyen las
deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como
coenzima. Estos métodos se basan en que la forma
reducida de la coenzima (NAD(P)H), pero no la forma
oxidada (NAD(P)), absorbe a 340nm (la Fig. 3A muestra
los espectros de absorción del NAD+ y del NADH).
Figura 3 A
Coef.de
extinción
NAD(P)+
NAD(P)H
250
350
400
λ(nm)
Así, la actividad de la Lactato deshidrogenasa:
+
+
piruvato + NADH + H Æ lactato + NAD
podría seguirse por un método continuo midiendo la disminución de absorbancia a 340nm,
con lo que se obtendría la curva mostrada en la figura 3B.
En ciertos casos, aunque no haya una
propiedad analítica diferencial de un S o de un P
que permita su dosaje continuo, aún puede
Figura 3
B
medirse la actividad de una enzima por un método
continuo si se acopla otra reacción enzimática a la
de la enzima en cuestión. Por ejemplo, la actividad
de la piruvato quinasa (PK) podría medirse en
forma continua por un método que utilice a la LDH
como enzima acoplada de forma que se dose el
piruvato producido por acción de la PK:
0.9
0.8
Abs 340nm
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1
2
3
4
5
Tiempo (min)
6
7
8
Fosfoenolpiruvato + ADP Æ piruvato + ATP (PK)
Piruvato + NADH + H+ Æ lactato + NAD+ (LDH)
Si las cantidades de LDH y de NADH
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agregadas al medio de reacción son los suficientemente elevadas, la disminución de la
absorbancia a 340nm va a medir la velocidad de producción de piruvato por parte de PK.
En otros casos, la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse
determinando continuamente un dado S o P en presencia de los demás componentes del
medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar, para lo cual se requiere
detener la reacción enzimática. En estos casos se utilizan métodos discontinuos, en los
que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reacción diferente. Por ejemplo, la
actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa:
ADPGlc + PPi Æ Glc1P + ATP,
puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la formación de ATP radioactivo. Si
no se separa el ATP formado del PPi que no reaccionó no se observa cambio de la
radioactividad en el medio de reacción. Para determinar cuánta radioactividad está en forma
de ATP es necesario detener la reacción enzimática y separar el ATP del PPi. De esta forma,
para tener una curva de ATP formado en función del tiempo, es necesario preparar tantos
medios de reacción como puntos experimentales se deseen.
Un método discontinuo puede comprender también aquel en el que el dosaje de un S
o P no implique su separación del medio de reacción, sino su reacción química en
condiciones que afectan la actividad de la enzima. Por ejemplo, la actividad de la
fosfoglucosaisomerasa:
Glc6P ∏ Fructosa6P
podría medirse dosando Fru6P por el método de Roe. Pero las condiciones del método de
dosaje hacen que necesariamente se detenga la reacción enzimática con cada medida de
Fru6P. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto experimental
de cantidad de Fru6P producida.
Nótese que, en general, el uso de un método continuo brinda con mayor facilidad un
número elevado de medidas de variación de S o P en función del tempo (inclusive puede
tenerse un trazo continuo) que un método discontinuo. Por esto, y teniendo en cuenta lo
antes mencionado sobre la variación de v en función del tiempo, al usar un método
discontinuo para medir actividad enzimática hay que ser particularmente cuidadoso para
estar seguro de medir velocidades iniciales.
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