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ISOENZIMAS
CONCEPTO DE ISOENZIMAS
Las isoenzimas (isozimas) son formas moleculares múltiples de una enzima. Catalizan la
misma reacción, pero sus propiedades cinéticas (Vmax y Km), físico-químicas e inmunológicas son
diferentes. Generalmente están constituidas por mezclas de diferentes clases de cadenas
polipeptídicas íntimamente asociadas.
Una forma de regulación metabólica muy importante que tienen los organismos es a través
de la utilización de las isoenzimas. La distribución de las mismas puede variar de un tejido a otro,
por ejemplo la piruvato kinasa de mamífero, que cataliza el tercer paso limitante en la glucólisis,
tiene dos isoformas: la hepática (L) y la muscular (M). Las propiedades catalíticas de la isoforma L
son reguladas negativamente por la acción de distintas hormonas, como por ejemplo el glucagón,
mientras que la forma M no lo es, así cuando el requerimiento de glucosa por el resto del organismo
es grande, la glucólisis en el hígado se detiene rápidamente. En algunos casos hay simultáneamente
isoenzimas diferentes dentro de una misma célula, por ejemplo las malato-deshidrogenasas de
mitocondria y de citosol. En otros casos se cambia de una isoenzima a otra con el paso del tiempo,
así algunas enzimas de la glucólisis en el feto son diferentes de las mismas enzimas en el adulto. Es
interesante destacar que en células de ciertos tumores cancerosos aparecen de nuevo formas fetales
de determinadas enzimas.
El estudio de las isoenzimas ha tomado mucho auge en los últimos tiempos, debido a que el
aumento de algunas de ellas en sangre periférica (LDH, creatinfosfoquinasa y fosfatasa alcalina) ha
sido aplicado al diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades
ISOENZIMAS DE LA LACTATO DESHIDROGENASA
Nombre sistémico: L-lactato:NAD+ oxidoreductasa (código: 1.1.1.27)
La LDH cataliza la siguiente reacción:
Piruvato + NADH + H+
L-lactato + NAD+
En determinadas condiciones de concentraciones y tiempo la cantidad de piruvato
transformado en lactato es directamente proporcional a la actividad de LDH.
La enzima no tiene especificidad estricta por el sustrato pues puede actuar sobre otros α-ceto
o α-hidroxiácidos estructuralmente similares al pirúvico (por ejemplo sobre el α-cetobutírico).
Página 1
Tampoco es estricta su especificidad por la coenzima, pues puede utilizar también el NADPH,
aunque las velocidades de reacción son mucho menores.
A pH 7,3 - 7,8 el equilibrio de la reacción está desplazado hacia el lactato, pero a pH más
alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato; entonces, la reacción puede
ocurrir en cualquiera de los dos sentidos, dependiendo del pH y de la concentración de los sustratos
que se encuentren presentes.
La LDH es una enzima que abunda en hígado, músculo esquelético y eritrocitos; también se
encuentra en menor cantidad en corazón, riñón y aún menos en páncreas y pulmón.
Existen dos genes que codifican dos polipéptidos diferentes: M (Muscle, músculo) y H
(Heart, corazón). Estos monómeros se combinan formando los tetrámeros activos (PM 134.000). Se
han podido separar por electroforesis nativa en geles de poliacrilamida 5 isoenzimas de LDH las
cuales están conformadas como se muestra en el siguiente esquema:
% de la LDH total (suero normal)
H-H
H-H
ó H4
LDH1
23,4 ± 3
LDH2
44,0 ± 4
LDH3
25,0 ± 1,5
LDH4
6,0 ± 2
LDH5
2,0 ± 1
H-H
H-M ó H3M
H-H
M-M ó H2M2
H-M
M-M ó HM3
M-M
M-M ó M4
Como las isoenzimas LDH1 y LDH5 tienen una conformación proteica diferente, cada una presenta
propiedades distintas. Tienen diferente estabilidad a la desnaturalización por temperatura (LDH1 es
estable a 65oC por 30 min y LDH5 es lábil al calor y al frío) y diferente resistencia a varios agentes
químicos inhibidores. También difieren en su movilidad electroforética: LDH1 es de migración
rápida y LDH5 es la más lenta, mientras que LDH2, LDH3 y LDH4 tienen migraciones intermedias,
como se muestra en la Figura 1.
Página 2
Lugar de siembra
Suero Normal
LDH 1
LDH2
LDH3
LDH4
(+)
LDH5
(-)
Figura 1
Las isoenzimas de la LDH tienen diferente afinidad por los sustratos (especialmente por el piruvato)
y coenzimas. Por ejemplo la LDH1 tiene un Km elevado para el piruvato, la Vmax a la cual lo reduce
es baja y además resulta inhibida por un exceso de éste, mientras que LDH5 tiene un Km muy bajo
para el mismo sustrato y la Vmax a la cual lo reduce es elevada. Las otras isoenzimas tienen
propiedades intermedias entre las LDH1 y LDH5 y se parecerán más a una o a otra dependiendo de
que tengan mayor proporción de monómero H o M. Estas características cinéticas son muy
importantes pues se relacionan con la función metabólica que estas isoenzimas cumplen en los
diferentes tejidos. Es de interés el hecho de que la proporción de las diversas isoenzimas de LDH
varíe de un tejido a otro, y por lo tanto los perfiles electroforéticos de las isoenzimas de la LDH de
distintas fuentes son diferentes. En los órganos con alto consumo de oxígeno y pequeña resistencia
a la anoxia (músculo cardíaco y cerebro) y en eritrocitos, predominan las isoenzimas LDH1 y LDH2,
mientras que en otros órganos con mayor reserva de glucógeno (hígado y músculo esquelético), hay
preponderancia de las LDH4 y LDH5, indicando su adaptación a un determinado tipo de
metabolismo energético (Figura 2).
En mamíferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporción que utiliza cada
órgano como fuente de combustible es variable. El cerebro depende exclusivamente de la glucosa
sanguínea mientras que el corazón obtiene el 70% de su energía a partir de los ácidos grasos y el
30% restante la aportan cuerpos cetónicos, glucosa sanguínea y también el lactato (participación de
las LDH1 y LDH2). El músculo esquelético y el hígado obtienen el 90% de su energía a partir de los
ácidos grasos.
Página 3
Durante una actividad física intensa, el cerebro consume aproximadamente la misma
cantidad de glucosa y oxígeno que en estado de reposo mientras que el requerimiento energético del
músculo esquelético y el corazón
Músculo esquelético
aumenta considerablemente. En los
dos
primeros
minutos
de
Acetil-CoA
esta
actividad el miocardio obtiene esa
energía a partir de glucosa tanto
Ciclo de los ácidos
tricarboxílicos
Glucógeno
ADP
ATP
Piruvato
Glucosa
NAD
+
NADH
NADH
sanguínea como de sus propias
NAD
LDH 5
Lactato
reservas de glucógeno, y aunque el
+
Cadena respiratoria
O2
H 2O
consumo de oxígeno aumenta unas
cuatro veces, un 50% del piruvato
Glucógeno
Hígado
Glucosa
formado se convierte en lactato
ADP
(participación de la LDH1 y LDH2),
Este cambio metabólico temporal le
ATP
NAD
hasta
metabolismo
que
para
adapte
lograr
su
CICLO DE CORI
+
permite al corazón obtener la energía
necesaria
Piruvato
NADH
LDH 5
Lactato
un
incremento en el consumo de ácidos
grasos.
El
músculo
Figura 2
esquelético
utiliza (en los primeros segundos) la energía almacenada como creatinafosfato hasta que se activa la
degradación del glucógeno muscular para aportar glucosa como fuente de energía. Aunque en
este tejido durante una actividad intensa el consumo de oxígeno aumenta unas veinte veces, gran
parte del piruvato formado se convierte en lactato (participación de la LDH5 y LDH4). Este cambio
metabólico le permite a este órgano obtener energía extra utilizando la glucólisis anaeróbica. El
pasaje de piruvato a lactato es una vía de recuperación de NAD+ para que la glucólisis continúe. La
mayor parte del lactato formado en esta etapa es recuperado lentamente y reconvertido a glucosa en
el hígado mediante un proceso que requiere el aporte de energía (ver Figura 2). Aquí la oxidación
de lactato a piruvato (participación de la LDH5 y LDH4) es favorecida por la baja relación
NADH/NAD+ y la casi inexistencia de piruvato intracelular. El corazón también puede consumir
parte del lactato producido por el músculo esquelético, favorecido por la cinética de sus isoenzimas.
La LDH se localiza en el citoplasma de las células de los distintos órganos y por lo tanto
cuando se produce un daño celular es fácilmente liberada al medio, desde donde pasa al plasma,
alterando la cantidad y relación de las isoenzimas de LDH presentes en la sangre. La mayor parte de
la LDH del suero normal proviene de la degradación fisiológica de los eritrocitos y plaquetas.
Página 4
Las determinaciones de las isoenzimas de LDH ayudan al diagnóstico y pronóstico de
algunas patologías. Así por ejemplo, analizando las isoenzimas por electroforesis es posible
diferenciar una hepatopatía de un infarto de miocardio, cosa que no puede hacerse midiendo LDH
total por su inespecificidad diagnóstica. En un suero normal hay una relación:
LDH1 (25%)
—————— ≈ 0,5
LDH2 (50%)
mientras que en un infarto de miocardio, en las primeras 24 horas, la relación LDH1/LDH2 se va
acercando a la unidad por aumento de la LDH1, sin que la actividad de LDH total aumente
significativamente. Luego, cuando el enfermo evoluciona satisfactoriamente, esta relación tiende a
volver a la normalidad. Un aumento en el valor de esa relación durante la convalecencia, indica un
reinfarto.
La aparición o el aumento de LDH5 en el suero está indicando un compromiso hepático, o
un daño en el músculo esquelético. En los infartos pulmonares está elevada la LDH3 dando valores
similares a la LDH2, con disminución de LDH1.
ISOENZIMAS DE CREATINA QUINASA
La Creatin Kinasa (CK), también conocida como Creatin FosfoKinasa (CPK) es una enzima,
presente en varios tipos de tejido muscular. Se ubica en el citolplasma de las células y cataliza la
siguiente reacción:
Fosfocreatina + ADP
ATP + creatina
La creatina-fosfocinasa está compuesta de tres isoenzimas ligeramente diferentes:
 CPK-1 (también llamada CPK-BB) se encuentra en el cerebro y los pulmones;
 CPK-2 (también llamada CPK-MB) se encuentra en el corazón;
 CPK-3 (también llamada CPK-MM) se encuentra en el músculo esquelético.
En el organismo humano existen básicamente dos tipos de músculos; los lisos y los
estriados. El movimiento de cualquier parte del cuerpo tiene lugar gracias al trabajo de los
músculos estriados, el cual consiste en un proceso de contracción y relajación, que requiere de dos
elementos esenciales: la energía y un mecanismo de control. Dicho mecanismo de control lo
constituyen los impulsos nerviosos que provienen desde el cerebro, y que llegan a los músculos a
través de las terminaciones nerviosas que conectan con éstos. Por su parte, la energía requerida para
Página 5
la realización del proceso se genera en una reacción química en la que interviene precisamente la
CPK.
La molécula de ATP constituye en sí misma el reservorio para el almacenamiento de la
energía necesaria para que se lleve a cabo la contracción muscular. Durante la contracción se
desprende de una molécula de ATP uno de sus tres fosfatos, el cual es captado por la creatina. Así
el ATP se convierte en una molécula de Adenosina-Difosfato o ADP, mientras la creatina, más el
fosfato que captó se convierte en Fosfocreatina o CP. Con dicho desprendimiento, la energía
química almacenada en la molécula de ATP se convierte en energía mecánica que hace que se
mueva la cabeza de los filamento de miosina y actina, y volviendo inmediatamente después a su
posición original. Es entonces que la Fosfocreatina (CP) libera su fosfato, donándolo a la molécula
de ADP en presencia de la enzima CPK, convirtiéndose nuevamente en ATP. Por su parte, la
creatina ya utilizada se transforma en creatinina que es liberada al torrente sanguíneo para ser luego
será eliminada por vía renal.
Así, la función de la CPK es la hidrólisis de la Fosfocreatina para que ésta done su fosfato a
la molécula de ADP, convirtiéndola en ATP, y haciendo de ésta un nuevo reservorio de energía
química, lista para ser convertida en la energía mecánica necesaria para el proceso de contracción
del músculo.
Debido a la distribución diferencial de las 3 isoformas de la CK en el organismo, es posible
la utilización de las mismas en el diagnóstico de enfermedades que afectan a distintos órganos.
Debido a que la isoenzima CPK-1 se encuentra principalmente en el cerebro y los pulmones, una
lesión a cualquiera de estas áreas puede incrementar sus niveles en suero, como por ejemplo una
lesión cerebral por trauma o accidente cerebrovascular, infarto pulmonar o crisis epiléptica. Los
niveles de CPK-2 aumentan de tres a seis horas después de presentarse un ataque cardíaco. El
aumento en los niveles de CPK-2 también pueden deberse a lesiones por electricidad o inflamación
del músculo cardíaco debido generalmente a virus (miocarditis). La CPK-3 es la isoenzima más
abundante dentro de la CPK total en personas sanas; los niveles de CPK-3 por encima de lo normal
generalmente son un signo de lesión o fatiga muscular y pueden deberse a: distrofia muscular,
miositis (inflamación de músculo esquelético), ejercicio extenuante, etc.
Para diferenciar la distintas isoformas que presentan aumentos en sangre periférica en algunas de
estas patologías, se utiliza un método que se basa en la inhibición específica de las subunidades CKM con anticuerpos monoclonales anti CK-M. Los anticuerpos inhiben tanto la isoenzima MM como
las subunidades M correspondientes a CK-MB. Las subunidades B se determinan mediante el
empleo de un sistema reactivo con N-acetilcisteína como activador, adicionado de anticuerpos
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monoclonales anti CK-M. Luego por diferencia con la determinación de CK total, se puede conocer
cual es la isoforma predominante.
PARTE EXPERIMENTAL
 OBJETIVOS DEL PRÁCTICO
En extractos de diferentes tejidos de rata, se medirá la actividad de LDH total y CK total por
métodos espectrofotométricos. Se determinarán además las proteínas de las muestras para expresar
las actividades como actividades específicas de cada extracto.
 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE TEJIDOS
Los extractos de los diferentes órganos de rata (hígado, corazón, cerebro, músculo
esquelético, riñón y pulmón) serán preparados en buffer Tris-HCl 80 mM (pH 8), utilizando una
relación de volumen del buffer/peso del tejido de 10/1. El tejido será homogeneizado a alta
velocidad en frío, y luego la suspensión será centrifugada a 8.500 X g durante 10 minutos a 4oC. El
sobrenadante, enriquecido en la fracción citosólica de la célula, será alicuotado y guardado a -20oC
hasta el momento de su utilización.
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DE LOS EXTRACTOS DE TEJIDO
Para la determinación de las proteínas se utilizará la técnica de Bradford, un método
colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que
forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la
concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer. Este es un método rápido, sensible,
relativamente barato y específico.
Fundamento:
Se basa en el uso de un colorante, el Coomassie Blue Brilliant G-250, que en medio ácido
reacciona con las proteínas dando un color azulado.
Mediante estudios de espectrofotometría, se pudo comprobar que el colorante presenta tres
especies activas que poseen distintos espectros de absorción de acuerdo a la carga de cada una.
Estas especies son dependientes del pH y se interrelacionan mediante el siguiente equilibrio:
Anión
Neutro
Catión
(595 nm)
(650 nm)
(470 nm)
Azul
Verde
Rojo
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O sea que a medida que se desprotona la forma catiónica, se generan las formas neutra y
aniónicas, cambiando el espectro de absorción del colorante.
La especie que posee capacidad de unirse a las proteínas es la aniónica, por lo tanto el equilibrio
mostrado arriba se desplaza hacia la izquierda a medida que se va formando el complejo aniónproteína.
Especificidad:
La especificidad del método ha sido demostrada por la ausencia de respuesta a una amplia gama
de compuestos incluyendo aquellos con nitrógeno en sus moléculas. Compuestos como el ácido
policitidílico, poliadenílico, poliguanílico, adenina, cafeína, etc. dieron menos de 0,01 unidades de
absorbancia (U.A.). También se ensayaron aminoácidos libres como ser arginina, lisina, triptofano,
alanina, glicina y ácido aspártico, no dando ninguno de ellos color significativo (0,006 U.A.)
Los requerimientos estructurales que permiten la unión del colorante a las proteínas están
todavía siendo estudiados, pero las últimas evidencias muestran que una proteína debe tener un peso
molecular alto (por lo menos tres veces el del colorante), y grupos funcionales básicos y aromáticos.
Al igual que para todos los otros métodos de dosaje de proteínas, excepto el de Kjeldalh, ésta es la
principal desventaja.
Como interferente se pueden citar al SDS y ciertos flavonoides.
Curva Patrón (Standard)
Reactivos:
1)
Solución patrón: se preparara una solución de albúmina 0,1 mg/ml
2)
Reactivo para desarrollar color:
Coomassie Blue Brilliant G-250.....................60 mg
Ácido perclórico 3%........................................1 Litro
Se disuelve el CBBG-250 en 50 ml de etanol y se lleva a 1 litro con ácido perclórico al 3%, se
deja reposar 2 horas por lo menos y se ajusta la absorbancia hasta 1,3-1,5 a 495 nm con agua
Protocolo
Tubo
Albúmina
H2O
Reactivo
B
-
0,8 ml
0.2 ml
1
0,1 ml
0,7 ml
“
2
0,2 ml
0,6 ml
“
3
0,3 ml
0,5 ml
“
4
0,4 ml
0,4 ml
“
5
0,5 ml
0,3 ml
“
muestra
0,1 ml
0,7 ml
“
Página 8
Abs 595 nm
Se calcula la concentración final en mg/ml de las soluciones patrones preparadas y se mide
absorbancia a 595 nm de las mismas. Se grafica la curva de calibración.
Se calcula la concentración de proteínas presentes en los extractos mediante la siguiente fórmula:
Abs
V
1
mg


595
nm
reaccion
concentrac
ión
_
proteína






m
V
dil
ml


alicuota
donde “m” es la pendiente de la recta y “dil” la dilución del extracto de órgano empleada.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LDH TOTAL
La actividad de la enzima será determinada de dos maneras:
a) Siguiendo la oxidación del cofactor NADH (cambio de absorbancia a 340 nm).
b) Siguiendo la reducción de una sal de tetrazolio, acoplada a la reacción enzimática
(cambio de absorbancia a 570 nm).
a) -Determinación de la actividad LDH en base a la oxidación del NADH
Fundamento:
Se basa en la diferencia entre los espectros de
absorción del NAD+ ó NADP+ (oxidados) y el NADH
Abs.
NAD
ó NADPH (reducidos). Como se muestra en la Figura
+
3, la forma reducida absorbe entre 320 y 380 nm, con
un máximo a 340 nm, mientras que la forma oxidada
no absorbe en esta zona. Se mide la variación de
NADH
absorbancia a 340 nm o a 366 nm (dependiendo del
espectrofotómetro con que se cuente) durante el curso
de la reacción enzimática. Habrá un incremento de la
absorbancia si la reacción transcurre en el sentido:
250
300
350
400
Longitud de onda (nm)
Figura 3
NAD+——› NADH
o una disminución si transcurre en el sentido:
NADH ——› NAD+
En el práctico se medirá la actividad de la LDH en el sentido de la formación de NAD+
(disminución de la absorbancia a 340 ó 366 nm).
Reactivos:
Página 9
Se utilizará un equipo de reactivos que incluye:
- Buffer fosfato 50 mM (pH 7,5), conteniendo piruvato 0,6 mM.
- Un vial conteniendo NADH desecado
Reactivo de trabajo: Disolver el contenido del vial en 3 ml del buffer (estable 24 h a 4oC)
Técnica:
En un tubo de lectura de espectrofotómetro colocar:
1 ml de reactivo de trabajo
Termostatizar en un baño a la temperatura en que se medirá la reacción (puede ser 25oC, 30oC ó
37oC, dependiendo del baño termostatizado disponible). Luego agregar:
30 µl muestra
Mezclar y disparar el cronómetro, leer inmediatamente la absorbancia de partida (aproximadamente
1 si se lee a 340 nm ó 0,3 si se lee a 366 nm - esto está dado por la cantidad de NADH) y medir
luego la absorbancia cada 30 segundos durante 4 minutos. Graficar absorbancia en función del
tiempo. En el rango de la curva en que la disminución de la absorbancia es directamente
proporcional al tiempo [velocidad inicial (vo)], determinar la disminución de absorbancia/minuto
(∆A).
Página 10
Advertencias:
1) Después de cierto tiempo, la cinética de la reacción ya no es lineal, por eso la lectura de la
absorbancia debe ser efectuada lo más rápidamente posible después de la adición de la muestra, y
seguirse durante 3 - 4 min. como máximo.
2) Si la velocidad de descenso de la absorbancia es mayor de 0,10 por minuto, diluir la muestra 1/5 o
1/10 con solución fisiológica y repetir el ensayo, para poder trabajar en la zona lineal de la reacción
(vo). Hay que recordar que el valor obtenido en estos casos deberá ser multiplicado por 5 o por 10
según la dilución que se haya realizado, para informar el valor correcto de la actividad enzimática.
3) Si la actividad de la LDH es muy alta, todo el NADH puede ser consumido antes de la primera
lectura y entonces no se observa ninguna variación en la absorbancia Por lo tanto hay que repetir la
reacción diluyendo la muestra.
b) - Determinación de la actividad LDH en base a la reducción de una sal de tetrazolio
acoplada a la reacción enzimática
Fundamento:
La reacción se mide en el sentido de la oxidación del ácido láctico y reducción del NAD+. El
NADH formado reduce a la sal de tetrazolio (MTT) a un formazán coloreado soluble que absorbe a
570 nm. El transporte de electrones desde el NADH al MTT es mediado por el PMS (phenazine
metasulphate):
LDH
Lactato + NAD+ ——————› Piruvato + NADH + H+
NADH + PMSox ——————› NAD+ + PMSred
PMSred + MTTox ——————› PMSox + MTTred (violeta de formazán)
En condiciones adecuadas (vo) la formación del formazán coloreado será directamente
proporcional a la actividad de LDH. Se lee la absorbancia del formazán a 570 nm en función del
tiempo.
Reactivos:
Buffer Tris-HCl (80 mM - pH 8):
Página 11
9,69 g de Tris, se disuelven en 300 ml de agua destilada, se ajusta el pH con ácido clorhidrico 1 N y
se completa a 1 litro con agua destilada.
Solución de L-lactato (10 mM):
144 mg de L-lactato se disuelven en 15 ml de agua destilada
Solución de NAD+:
1 mg de NAD+ se disuelve en 1 ml de buffer (guardar refrigerado).
MTT (Dimetiltiazolyl difenyltetrazolium):
9 mg de MTT se disuelven en 15 ml de agua destilada (guardar al abrigo de la luz).
PMS (Phenazine metasulphate):
18 mg de PMS se disuelven en 15 ml de agua destilada (guardar al abrigo de la luz).
Técnica :
En dos tubos de lectura de espectrofotómetro rotulados como blanco (B) y muestra (M) colocar:
Reactivos
Blanco
Muestra
1- Buffer Tris
0,66ml
0,63 ml
2- NAD+
0,033 ml
0,033 ml
3 - Muestra
---
0,03 ml
4 - MTT
0,1 ml
0,1 ml
5 - PMS
0,1 ml
0,1 ml
Preincubar a 30oC durante unos 5 minutos y luego agregar
6 - L-lactato
0,1 ml
0,1 ml
Cada minuto se lee la absorbancia a 570 nm, contra el blanco, manteniendo los tubos incubados a
30oC. Las lecturas se realizan hasta que la reacción deje de estar en vo. El blanco varía con el pH,
temperatura y tiempo de incubación. Se calcula luego la variación media de absorbancia/min (∆A)
en el rango de vo.
 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CK TOTAL
FUNDAMENTOS DEL METODO
El método usado en el práctico está basado en el siguiente esquema de reacción:
creatina kinasa
Página 12
creatina fosfato + ADP
creatina + ATP
hexoquinasa
ATP + glucosa
ADP + glucosa-6-P
G-6-PDH
glucosa-6-P + NADP+
gluconato-6-P + NADPH + H+
En el práctico se medirá la actividad de la CK en el sentido de la formación de NADPH (aumento
de la absorbancia a 340 ó 366 nm).
Reactivos:
Se utilizará un equipo de reactivos que incluye:
- Buffer imidazol pH 6,7
- Un vial conteniendo todos los sustratos necesarios desecados
Reactivo de trabajo: Disolver el contenido del vial en 2.5 ml del buffer (estable 24 h a 4oC)
Técnica:
En un tubo de lectura de espectrofotómetro colocar:
0.5 ml de reactivo de trabajo
Termostatizar en un baño a la temperatura en que se medirá la reacción (puede ser 25oC, 30oC ó
37oC, dependiendo del baño termostatizado disponible). Luego agregar:
10 µl muestra
Mezclar y disparar el cronómetro, leer inmediatamente la absorbancia de partida y medir luego la
absorbancia cada 30 segundos durante 4 minutos. Graficar absorbancia en función del tiempo. En el
rango de la curva en que el aumento de la absorbancia es directamente proporcional al tiempo
[velocidad inicial (vo)], determinar la variación de absorbancia/minuto (∆A).
 CALCULO DE LOS RESULTADOS
Generalmente a la actividad de una enzima se la expresa en Unidades Intenacionales (UI) y se la
refiere a la cantidad de muestra que la contiene. Una UI es la cantidad de enzima capaz de
transformar un micromol (µmol) de sustrato por minuto. Entonces con el valor de cada una de los
∆A y el del coeficiente de extinción molar (E) de acda una de las sustancias utilizadas en el práctico
se calculan los µmoles de sustrato transformados por minuto:
∆A
∆A = c . E . l
——›
c = ——
E.l
Página 13
E para NADH y NADPH es 6,23 . 103 L . mol-1 . cm-1 a 340 nm
E del MTT es 1,7 . 103 L . mol-1 . cm-1
l = trayecto óptico de la cubeta en cm, =1
Luego se realiza la transformación de moles a µmoles y finalmente se lo expresa por litro de
muestra (teniendo en cuenta la alícuota de muestra tomada y el volumen final de la mezcla de
incubación), de lo cual resulta lo siguiente:
V
c . —— . 106 = UI/L de muestra [µmol/L.min]
v
V= volumen total del ensayo, en ml
v= volumen de la alícuota de muestra, en ml
Para expresar los resultados como actividad específica de la enzima, se realizará el cálculo teniendo
en cuenta el valor de proteínas obtenido para cada extracto. Para ello se utilizará el ∆A obtenido de
las curvas y se lo relacionará con la concentración de proteínas usada para realizar la medición
(teniendo en cuenta la alícuota de muestra tomada y la concentración de proteínas de las diferentes
muestras por el método de Lowry)
Activiadad específica =
∆A x
E.l
1
Valic x Conc. prot. muestra
Página 14
x 106 [µmol/mg prot]