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CÓDIGO:
PROCEDIMIENTO PARA LA
DETERMINACION DE ANTÍGENO Y
ANTICUERPOS DEL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA POR
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PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE
ANTÍGENO Y ANTICUERPOS DEL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA POR
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ELABORÓ
REVISÓ
APROBÓ
REFERENTE DE LABORATORIO
REPRESENTANTE DE CALIDAD
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
SECRETARIO DE SALUD
REPRESENTANTE DE LA
DIRECCIÓN
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1. OBJETIVO
Determinar cualitativamente el antígeno p24 del virus de la inmunodeficiencia
humana HIV‑1 y de los anticuerpos contra el HIV‑1, incluyendo el grupo O, y contra
el HIV‑2 en suero humano por la técnica de Electroquimioluminiscencia (ECLIA).
2. ALCANCE
Aplica para la determinación cualitativa del antígeno p24 del HIV-1 y de los
anticuerpos contra el HIV-1 incluyendo el grupo O y contra el HIV-2 en muestras de
suero.
Este procedimiento se realiza a sueros de pacientes procedentes de los
Laboratorios Públicos y privados de la Red Departamental de Laboratorios y a
muestras de pacientes que son tomadas en el Laboratorio de Salud Pública para
diagnóstico.
3. DEFINICIONES
•
Anticuerpo:
Sustancia
de
naturaleza
glucoproteica
denominada
inmunoglobulina (Ig) que es producida como respuesta del sistema inmunitario
ante la presencia de una sustancia extraña llamada antígeno. Cada anticuerpo
se fabrica expresamente para un determinado antígeno con tal grado de
especificidad que antígeno y anticuerpo suelen designarse con el nombre del
antígeno y el prefijo anti-.
•
Antígeno: Sustancia extraña al organismo capaz de estimular el sistema
inmunitario. Puede tratarse de proteínas, polisacáridos, glucoproteínas o
sustancias más complejas como lípidos, ácidos nucleicos o microorganismos.
Sólo una pequeña parte del antígeno, el llamado determinante antigénico, es el
responsable de estimular el sistema inmune y unirse al anticuerpo.
•
ECLIA: Inmunoensayo de Electroquimioluminiscencia, se basa en que la
quimioluminiscencia emitida es producida por un salto electrónico en la cámara
de reacción
•
VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana que ataca el sistema inmunológico
y provoca el SIDA. Es un virus del género Lentivirus, perteneciente a la familia
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de los retrovirus. Su información genética o génoma está en forma de cadena
de ARN monocatenario.
4. RESPONSABLES
Es responsabilidad de los profesionales del Laboratorio de inmunoensayo cumplir
con los lineamientos establecidos en este procedimiento, sin hacer ningún cambio
que no esté debidamente documentado y autorizado.
5. GENERALIDADES:
5.1 Características
El virus de VIH constituye el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia
adquirida SIDA y pertenece a la familia de los retrovirus. El VIH puede transmitirse
por sangre o hemoderivados, por contacto sexual o de una madre a su hijo antes,
durante y tras el parto.
Hasta el día de hoy se han identificado dos tipos de virus de inmunodeficiencia
humana, denominados HIV-1 y HIV-2. Se han descrito varios subtipos, de los
conocidos virus IH, cada uno con distribución geográfica diferente. El VIH-1 puede
dividirse en tres grupos remotamente vinculados: el grupo M (por “main” o principal),
el grupo N (por “no M, no O”), y el grupo O (por “outlier”). Basándose en su
interrelación genética, dentro del grupo M del VIH-1 se han identificado como
mínimo 9 subtipos diferentes (de A a D, sw F a H, J, K). Existen virus recombinantes
de VIH-1 que consisten en secuencias de 2 o aun más subtipos diferentes que se
están diseminando de forma epidémica.
5.2 Referencias
Inserto HIV combi PT
6. DESARROLLO
6.1 Fundamento
Los anticuerpos contra las proteínas de VIH que indican la presencia de una
infección por VIH pueden encontrarse en suero generalmente dentro de 6 a 12
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semanas tras contraer la infección. Con la detección del antígeno p24 del VIH-1
en muestras de pacientes recientemente infectados con una alta carga viral, el VIH
se consigue determinarse alrededor de 6 días antes de lo que lo hacen los ensayos
de anticuerpos tradicionales. El presente ensayo de 4ta generación permite detectar
simultáneamente anticuerpos anti VIH y el antígeno p24 del VIH obteniéndose así
una mayor sensibilidad y una ventana diagnostica más reducida.
La prueba permite detectar simultáneamente y en una única determinación el
antígeno p24 del HIV-1 y los anticuerpos anti-HIV-1 y anti-HIV-2. A fin de determinar
los anticuerpos específicos anti-HIV, esta prueba utiliza antígenos recombinados
derivados de las regiones env-y pol del HIV-1 (incluyendo el grupo O) y del HIV-2.
Para detectar el antígeno p-24 del HIV-1, se emplean anticuerpos monoclonales
específicos.
Técnica sándwich con una duración total de 27 minutos.
§ 1ª incubación: Pretratamiento de 40 μL de muestra con detergente.
§ 2ª incubación: Anticuerpos biotinilados monoclonales anti‑Ag p24, contra el
antígeno específico recombinado del HIV y contra los péptidos específicos
del HIV, así como anticuerpos monoclonales anti‑Ag p24,contra el antígeno
específico recombinado del HIV y contra los péptidos específicos del HIV
marcados con quelato de rutenio) forman un complejo sándwich.
§ 3ª incubación: Después de incorporar las micropartículas recubiertas de
estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por interacción
entre la biotina y la estreptavidina.
§ La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por
magnetismo, las micropartículas se fijan a la superficie del electrodo. Los
elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo
ProCell/ProCell M. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una
reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide con un
fotomultiplicador.
§ El software proporciona automáticamente los resultados comparando la
señal de electroquimioluminiscencia generada por la reacción de la muestra
con la señal del valor de corte obtenido anteriormente por calibración.
6.2. Materiales
6.2.1. Equipos
•
Cobas e 411
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Nevera muestras
Nevera de reactivos
Pipeta (1000 ul)
6.2.2. Reactivos
•
•
•
•
•
•
Estuche de reactivo HIV combi PT (Listos para uso)
Calibradores HIVCOMPT Cal 1 y HIVCOMPT Cal 2
PreciControl HIV
ProCell (tampón del sistema)
CleanCell (solución detergente para la célula de lectura).
SysWash (aditivo para el agua de lavado).
6.2.3. Otros
•
•
•
•
•
6.3.
Agua destilada o desionizada
Probeta 100 ml
Copillas (Servir muestras)
Copilla (Reacción- AssayCup)
Puntas de pipeta (AssayTip)
Procedimiento
6.3.1.
Preparación De La Muestra
§ Tipo de muestra: Suero recogido en tubos estándar de muestra o en
tubos que contienen gel de separación.
Criterio: Identificación correcta de las muestras negativas y positivas.
• Estabilidad: 4 semanas a 2‑8 °C, 7 días a 25 °C, 3 meses a ‑20
°C.
Las muestras pueden congelarse hasta 5 veces.
Si las muestras se procesan en tubos primarios (sistemas de recogida de muestras),
seguir las instrucciones del fabricante de los tubos. Centrifugar las muestras que
contienen precipitado antes de efectuar la prueba. No emplear muestras inactivadas
por calor. No utilizar muestras ni controles estabilizados con azida.
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Se debe garantizar una temperatura de 20‑25 °C para la medición de muestras,
calibradores y controles.
Para evitar posibles efectos de evaporación, determinar las muestras, los
calibradores y los controles que se sitúan en los analizadores dentro de un lapso de
2 horas.
•
Identificación de muestras:
La muestra es identificada con el código interno asignado en el momento
de la recepción de la misma.
6.3.2.
Preparación de reactivos
Los reactivos contenidos en el estuche están listos para el uso (excepto
HIVCOMPT Cal1 y HIVCOMPT Cal2) y se suministran en frascos compatibles
con el sistema.
ü Calibradores HIVCOMPT Cal 1 y HIVCOMPT Cal 2: Para la reconstitución,
disolver cuidadosamente el contenido de un frasco añadiendo exactamente
1.0 ml de agua destilada o desionizada. Dejar reposar 15 minutos en frasco
cerrado. Mezclar con cuidado, evitando la formación de espuma.
Transferir los calibradores reconstituidos a los frascos suministrados vacíos,
etiquetados y de cierre hermético.
ü SysWash: 35 ml de sysWash y se completa a volumen de 3000 ml con agua
6.3.3.
•
Controles y/o curvas de calibración
Para la calibración:
Colocar los calibradores reconstituidos en los racks del analizador a 20‑25°C
sólo con el objeto de efectuar una calibración. Después del uso, cerrar los
frascos inmediatamente y guardar a 2‑8 °C.
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Debido a posibles efectos de evaporación, se recomienda no efectuar más de
5 calibraciones por juego de frascos de calibradores.
Nota: Todos los datos necesarios para calibrar el test se introducen
automáticamente en el analizador.
Intervalos de calibración:
Efectuar la calibración una vez por lote de reactivos empleando los
calibradores HIVCOMPT Cal 1 y HIVCOMPT Cal 2.
Se recomienda repetir la calibración:
•
Tras un mes (28 días) si se trata del mismo lote de reactivos.
•
Tras 7 días (al emplear el mismo estuche de reactivos en el
analizador)
•
En caso necesario: por ejemplo si el control de calidad
PreciControl HIV esta fuera del intervalo definido.
Después de efectuar una calibración, guardar los calibradores de 2°C -8°C o
desecharlos según sea el caso.
Conservar los calibradores en posición vertical a fin de evitar que la solución se
pegue a la tapa hermética.
•
Para los controles: Para el control de calidad emplear PreciControl HIV
colocar los controles en los rack.
Todos los datos necesarios para realizar en control del test se introducen
automáticamente en el analizador
Efectuar el control:
•
Junto con el test cada 24 horas.
•
Con cada estuche de reactivos
•
Después de cada calibración.
Verificar que los resultados de los controles se encuentren entre los
intervalos de aceptación definidos (Verificación en el equipo)
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Consideraciones generales:
•
•
•
•
Evite la formación de espuma en reactivos y muestras de todo tipo
(especímenes, calibradores y controles).
Los reactivos se deben almacenar entre 2 ºC y 8ºC. No congelar. (Ver inserto
conservación y estabilidad)
Conservar el estuche de reactivos en posición vertical para garantizar la
disponibilidad total de las micropartículas durante la mezcla automática antes
del uso.
Se debe garantizar una temperatura de 20-25°C para la medición de
muestras, calibradores y controles.
6.4.1.
Acondicionamiento y manejo de equipos
El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida
(F-SA-18) de los mismos y el F-AS-34 Control Interno de Equipos
6.4.2.
Condiciones ambientales
El análisis se puede efectuar dentro de las siguientes condiciones ambientales:
Condición Ambiental
Temperatura Ambiente
Rango
20 y 25 °C
Las condiciones de temperatura se registran en el F-SA-44 Control de temperatura
y humedad relativa ambiental
6.4.3.
Descripción del método
Antes del uso, atemperar los reactivos refrigerados a aproximadamente 20 °C y
colocarlos en el rotor de reactivos (20 °C) del analizador. Evitar la formación de
espuma. El analizador realiza automáticamente los procesos de atemperar, abrir y
tapar los frascos.
•
Calibrar y pasar controles en el equipo (Ver 6.3.3)
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Corrida de muestras:
•
Las muestras recepcionadas para control de calidad deben ser procesadas
por duplicado, las muestras de pacientes gestantes y muestras para
diagnóstico, solo se procesan una sola vez, y en caso de ser reactivo el
resultado, se procesa nuevamente por duplicado.
-
Agregar aproximadamente 500 ul de muestra a las copillas o colocar los
tubos primarios en el racks de muestras.
-
Programar las muestras en el equipo con el rack respectivo y código de la
muestra asignado en el momento del ingreso al sistema de información.
6.4.4.
Cálculos y/o valores de referencia
El analizador calcula automáticamente el valor de corte basándose en la
medición de HIVCOMPT Cal1 y HIVCOMPT Cal2. Los resultados se indican
como reactivos o como no reactivos así como en forma de índice de corte
(señal de la muestra/valor de corte).
Interpretación de los resultados:
Las muestras con un índice de corte (IC) < 0.90 son no reactivas en la prueba
Elecsys HIV combi PT. Estas muestras se consideran negativas para el HIV-1
Ag y para anticuerpos anti-HIV-1/-2 y no requieren más análisis.
Las muestras con un índice de corte dentro del intervalo ≥ 0.90 a < 1.0 se
consideran
limítrofes
en
el
test
Elecsys
HIV
combi
PT.
Las muestras con un índice de corte ≥ 1.0 se consideran reactivas en la
prueba
Elecsys
HIV
combi
PT.
Se recomienda volver a analizar por duplicado con el test Elecsys HIV combi
PT todas las muestras inicialmente reactivas o limítrofes. Si en ambos casos
se encuentran valores < 0.90 para el índice de corte, las muestras se
consideran negativas para HIV-1 Ag y anticuerpos anti-HIV-1/-2.
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Las muestras inicialmente reactivas o limítrofes con un índice de corte ≥0.90
en cualquiera de las determinaciones se considera repetidamente reactivas.
Las muestras repetidamente reactivas deben ser confirmadas según los
esquemas confirmatorios recomendados Por el Instituto Nacional de Salud y
Ministerio de Salud y Protección Social.
INTERPRETACION DE
INDICE DE CORTE (IC)
RESULTADOS DE MUESTRAS
REACTIVO para anti-HIV y antígeno
> 1.0
HIV
LIMITROFES
≥ 0.90 a < 1.0
NO REACTIVA para anti-HIV y
<0.90
antígeno HIV
6.4.5.
Obtención de resultados
Los resultados del índice de corte (IC) de controles y muestras procesadas, se
verifican en la pantalla del equipo y al finalizar la corrida se imprimen para luego ser
digitados en el Sistema Interno de Información del Laboratorio.
Los resultados impresos emitidos por el equipo se archivan en una carpeta.
6.4.6.
•
•
•
•
Aseguramiento de calidad de resultados
Realizar análisis de la muestra por duplicado.
Verificar que los reactivos estén vigentes
Verificar calibración y mantenimiento de equipos.
Procesar controles positivos y negativos en cada corrida de muestras.
6.4.6.1.
Control de calidad Interno
La prueba cuenta con los siguientes controles que se realizan por cada corrida
analítica:
CONTROLES HIV COMBI PT
PC HIV 1
INTERVALO DIANA DEL INDICE
DE CORTE
0.00-0.67
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10.0-32.0
30.0-100
Los intervalos exactos, indicados como índice de corte, están incluidos en los
códigos de barras y se encuentran a disposición impresos en la ficha de valores
adjunta de los controles o de manera electrónica.
PC HIV 1
PC HIV 1
Si los valores obtenidos para los controles se encuentran fuera de los rangos
especificados, la prueba se considera inválida y por lo tanto deberá repetirse
nuevamente.
Criterios de rechazo
RANGO DE ACEPTACION
ACCION PARA
INCUMPLIMIENTO DE
CRITERIOS
PreciControl
Según la ficha de valores
del PreciControl
Repetir Análisis
Reactivos vigentes
Vigencia del reactivo
Mantenimiento de equipos
Calibración, verificación y
mantenimiento vigente
CRITERIO
6.4.6.2.
Repetir Análisis
Repetir Análisis y solicitar
mantenimiento y
calibración
Control de Calidad Externo
El laboratorio participa en programas de evaluación externa como MLE para HIV y
con el Instituto Nacional de Salud (PIVI).
Los resultados de los controles se registran en el análisis de resultados de control
de calidad externo F-SA-109
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7. REGISTROS
Registro
F-SA-34
Control Interno
de equipos
F-SA-44
Control de
temperatura y
humedad
relativa
ambiental
F-SA-109
análisis de
resultados de
control de
calidad externo
F-SA-18
Hoja de vida de
Equipos
Responsable
Director Técnico
/Profesional de
Laboratorio
Director Técnico
/Profesional de
Laboratorio
Director Técnico
/Profesional de
Laboratorio
Director Técnico
/Profesional de
Laboratorio
8. ANEXOS. No Aplica
Como
conservarlo
Medio físico y/o
electrónico
Medio físico y/o
electrónico
Medio físico y/o
electrónico
Medio físico y/o
electrónico
Donde
conservarlo
Según Listado
Maestro de
documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
maestro de
registros y/o
tabla de
retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
maestro de
registros y/o
tabla de
retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
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registros y/o
tabla de
retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
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registros y/o
tabla de
retención
documental
Tiempo de
conservación
Disposición
final
Según Listado
Maestro de
documentos F-MC04, Según F-MC-03
-Listado maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
Según Listado
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documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos F-MC04, Según F-MC-03
-Listado maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos F-MC04, Según F-MC-03
-Listado maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
Según Listado
Maestro de
documentos FMC-04, Según FMC-03 -Listado
maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
Según Listado
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-Listado maestro de
registros y/o tabla
de retención
documental
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9. HISTORIAL
VERSIÓN
VIGENCIA
1
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IDENTIFICACIÓN DE LOS
CAMBIOS
Versión inicial