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Detección Electroquímica del Crecimiento de Escherichia coli en Leche
Cruda con Sensores Basados en Electrodos Planos de Platino
H. Cobas1*, A. Mesa1, S. Pavoni1, Á. Zayas2, E. Álvarez2, R. Contreras2
1
Centro de Investigaciones en Microelectrónica., km 8½ Antigua Carretera de Vento. Capdevila.Boyeros, Ciudad de La
Habana, Cuba. P.O.Box 8016.
2
Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Diagnóstico Microbiológico – CNIC, Ave. 25 esq. 158, No. 15202,
Cubanacán, Playa, Ciudad Habana, Cuba.
*Corresponding author: (537) 2663051, [email protected]
Abstract
A basic research for quality electrochemical monitoring system dairy product is presented. A previously
designed electrochemical system was evaluated. The electrochemical technic applied in measurements
consisted in cyclical voltammetry from 0 to 1 V at differents scan rates (10 mV/s, 20 mV/s and 50 mV/s). An
electrochemical sensor based on thin film platinum electrode was used. The E. coli new measurements in
culture medium EC with milk is compared with those obtained in previous research with culture medium DKD.
As result similar voltametric behavior were obtained independently of the culture medium. Once more time the
electrochemical activity was detected once completed bacteria growth latency phase.
Keywords: bacteria, E. coli, sensor de película delgadas, voltametría, leche.
Negativas y Gram Positivas. Dentro de las Gram
Negativas se encuentran las Enterobacterias y
dentro de estas se encuentra la Escherichia coli
(E. coli), con la cual se realizó el trabajo
experimental que se presenta en este artículo.
Dentro
de
los
métodos
empleados
internacionalmente con el fin de monitorear el
crecimiento de microorganismos, se tienen la
Bioluminiscencia, Impedancia, Turbidimétrico,
Catalasa, Limulus Test, DEFT, entre otros. La
mayor parte de los métodos automatizados están
dirigidos al conteo total de bacterias o unidades
formadoras de colonias (ufc). Esto posibilita el
análisis rápido de gran cantidad de muestras con
una aceptable repetibilidad y exactitud en relación
con el conteo directo. En la Tabla 1 se pueden
observar algunos de los métodos automatizados
para evaluar la calidad microbiológica de la leche.
El grupo de Sensores y Sistemas Electroquímicos
del Centro de Investigaciones en Microelectrónica
(CIME) en conjunto con especialistas de la
Dirección de Diagnóstico Rápido Microbiológico
(DIRAMIC)
del
Centro
Nacional
de
Investigaciones Científicas (CNIC) trabajan en el
desarrollo de sensores y sistemas electroquímicos
que contribuyan al diagnóstico microbiológico.
Como resultado se llevó a cabo el diseño y
desarrollo de un sensor electroquímico fabricado
Introducción
En el mundo actual es cada vez más importante el
monitoreo de parámetros de la calidad de los
alimentos. Tanto fabricantes como vendedores
deben mantener un control activo de sus productos
con el fin de que los mismos se mantengan aptos
para el consumo humano. Disímiles son las
consecuencias que la ingestión de alimentos en mal
estado puede causar a la salud, como fiebres,
intoxicaciones, diarreas, etc. Son las bacterias las
responsables de la descomposición y deterioro
paulatino de estos productos. Por esta razón,
mantener un riguroso monitoreo de estos
microorganismos es de vital importancia para la
salud pública, para la industria alimenticia y para el
sector encargado de la comercialización.
A nivel internacional los productos lácteos se
encuentran entre los alimentos más importantes y
comercializados. Entre ellos, la leche es
considerada como el alimento más completo y la
más barata de las proteínas de origen animal [1]. Su
presencia en las dietas alimenticias es muy
importante ya que maximiza el uso del calcio por el
cuerpo humano. Lo que permite un fortalecimiento
de la estructura ósea [2].
En la leche se pueden encontrar diferentes tipos de
bacterias. Estas se clasifican en dos grupos: Gram
438
Tabla 1 Algunos métodos automatizados para detectar
microorganismos en leche.
Equipo
Metodo
Aplicacion
es
Bactoscan 8000
Conteo de bacterias por
epifluorescencia
Leche y
derivados
Bactometer 33
Impedancia
Leche y
derivados
Lumac 3M
ATP-Bioluminiscencia
Leche y
derivados
PetriFoss
Preparación de placas,
dosificación de medios
y siembra
Leche y
derivados
Spiral Plate
System
Siembra automática y
contador láser
Leche y
derivados
Stomacher 400
Homogenizador
Leche
Diralec
Turbidimétrico
Leche
Figura 1. Microcelda electroquímica empleada. a) Electrodos
que componen la microcelda y terminales de interconexión. b)
Muestra en forma de gota de 10 µL depositada sobre la
microcelda.
en Labview 7.1 [11]. El cual es el encargado de
aplicarle al circuito potenciostato la señal de
excitación correspondiente, así como medir sus
salidas; presentar los resultados de la medición en
pantalla en forma gráfica en tiempo real; generar un
fichero de salida donde se almacenan los
parámetros con que se realizó la medición y
generar un fichero de salida donde se almacenan
los resultados de la medición para su posterior
procesamiento. El acople entre la computadora y el
potenciostato se realizó con una tarjeta de
adquisición de datos profesional (NI 6014 de
National Instruments) [12]. El potenciostato se
encarga de aplicar la señal de excitación a la celda
electroquímica y convertir a tensión la corriente
que entrega la celda. En esta, producto de la señal
aplicada, se produce una reacción electroquímica
en la superficie del electrodo de trabajo dando
como resultado una corriente proporcional a la
concentración de las especies electroactivas.
con tecnología de capas delgadas [3] y se construyó
el sistema de medición electroquímico encargado
de excitar al sensor y procesar su señal de salida
[4]. Como parte de estas investigaciones se analizó
el crecimiento de la bacteria E. coli en medio de
cultivo Diramic Kit Diagnóstico (DKD) [3-9].
En el presente trabajo se evalúa la posibilidad de la
utilización
del
sistema
electroquímico
anteriormente diseñado en el análisis del
crecimiento de la bacteria E. coli en leche, como
parte de investigaciones preliminares para el
desarrollo de un sistema electroquímico de control
de calidad de productos lácteos.
Materiales y métodos
Sensores
Como elemento sensor se utilizó una microcelda
electroquímica formada por dos electrodos planos
de platino (Fig. 1a), la cual forma parte de un chip
fabricado en tecnología de capas delgadas sobre
substrato de vidrio [3-9]. El electrodo de
pseudoreferencia tiene forma de anillo con un área
aproximada de 2 mm2. El electrodo de trabajo tiene
forma de disco con un diámetro de 1000 µm.
La zona de la microcelda que no es activa está
recubierta de un material hidrofóbico para definir la
superficie donde se depositará el electrolito en
forma de gota microvolumétrica (Fig. 1b). Sobre el
área activa se deposita perfectamente delimitada
una gota de 10 µL de volumen.
Figura 2. Esquema del sistema de medición.
Instrumentación electroquímica
En la figura 2 se presenta el esquema del sistema de
medición electroquímico empleado [4, 10]. Este se
controla mediante un instrumento virtual diseñado
Cultivos microbianos
Para preparar las muestras que se utilizaron en los
experimentos se emplearon los siguientes
elementos:
439
-Medio de cultivo 4223 Caldo de EC (EC),
fabricado por Biocen [13].
-Peptona bacteriológica.
-Cloruro de sodio (NaCl).
-Agua estéril.
-Bacteria E. coli ATCC 25922.
-Leche cruda (vaca).
Como primer paso se preparó un caldo peptonado a
partir de 1 g de peptona bacteriológica y 8,5 g de
NaCl disueltos en 1 L de agua estéril. Luego se
tomó 1 mL de la muestra de leche cruda
homogenizada y se realizaron diluciones sucesivas
en el caldo peptonado hasta llegar a una relación de
1/1000. De esta última disolución se añadió 1 mL a
3,5 mL de medio EC hasta alcanzar un volumen
final de 4,5 mL. En lo adelante a este preparado se
identificará como leche blanca (LB).
Para preparar el inóculo se tomó una asada de 4 ó 5
colonias de E. coli cultivadas entre 18-24 horas a
37 °C y se realizó una suspensión con una turbidez
de
0,5
McFarland
equivalente
a
1 x108 - 3x108 cel/mL. Se tomaron 150 µL de esta
suspensión y se inocularon en los frascos que
contenían LB. En lo adelante a este preparado se
identificará como ELEC. Las muestras preparadas
se pusieron a incubar a 37 ºC y se extrajo una cada
media hora para ser procesada.
de muestra sobre el mismo.
Cada media hora se extrajo una muestra de la
incubadora y se realizaron los pasos anteriormente
descritos. En la tabla 2 se presentan los parámetros
de configuración que diferencian los protocolos.
Estos parámetros son el período de muestreo (Ts) y
la mínima variación de potencial entre dos valores
consecutivos de tensión aplicada (dV), los cuales
determinan la velocidad de barrido en el sistema.
Tabla 2. Parámetros que diferencian los protocolos
Protocolo 1 Protocolo 2 Protocolo 3
Parámetros
(10 mV/s)
(20 mV/s)
(50 mV/s)
Ts
500 ms
1000 ms
500 ms
dV
0,005
0,02
0,025
Resultados y discusión
Tomando como base conocimientos acumulados
por el grupo de trabajo en investigaciones
anteriores, donde se medía el crecimiento de la
bacteria E. coli en medio de cultivo DKD, se
llevaron a cabo diferentes experimentos. Estos
tenían como objetivo determinar semejanzas y
diferencias en la respuesta electroquímica del
sistema al cambiar el medio de cultivo en que se
encontraba la bacteria.
El primero de los experimentos tenía como fin
determinar si el sistema respondía o no ante los
cambios realizados en el medio de cultivo. Para
ello se prepararon 10 muestras de ELEC con
concentración inicial de 108 cel/mL de la bacteria.
Se pusieron a incubar 9 muestras, cada media hora
se extrajo una y se midió siguiendo el Protocolo 2
(Voltametría Cíclica a 20 mV/s de 0 a 1 V), el cual
se mencionó anteriormente. La décima muestra no
se puso a incubar y se midió en tiempo cero. El
voltamograma obtenido por el sistema, con esta
muestra, se presenta en la curva a) de la figura 3.
Se puede observar que en esta no aparece un pico
de corriente alrededor de 0,2 V de la tensión de
excitación. En la curva b) de la misma figura se
presenta el voltamograma obtenido por el sistema
al medir una de las muestras que se puso a incubar.
El tiempo de incubación transcurrido fue de
5,5 horas. En el mismo se puede observar que
alrededor de los 0,2 V de tensión de excitación se
obtiene un pico en la corriente de respuesta del
sistema de aproximadamente 0,45 µA. Es de notar
que las respuestas del sistema al utilizar muestras
de ELEC son similares a las obtenidas en
mediciones con medio de cultivo DKD (Fig. 3c y
3d) [3-9]. Esto pone en evidencia que es posible la
utilización de este sistema en las investigaciones
básicas para el desarrollo de un sistema de control
de calidad de productos lácteos.
En los diferentes experimentos realizados se
comprobó que la forma del voltamograma obtenido
Procedimiento experimental
El trabajo experimental se basó en la utilización de
la técnica de Voltametría de Cíclica para tres
velocidades de barrido, 10 mV/s, 20 mV/s y 50 V/s.
Se empleó la configuración de dos electrodos del
sistema electroquímico.
En las mediciones se utilizaron los siguientes
analitos:
-Solución salina, (NaCl en H2O).
-ELEC.
-LB.
Antes de introducir las muestras en la incubadora
se tomó un frasco de LB para realizar la medición
en tiempo cero.
Para llevar a cabo los experimentos se
prepararon tres protocolos de medición. En
cada uno, antes de realizar las mediciones, se
efectuó un baño ultrasónico del sensor durante
15 s. Se garantizó que el potencial entre los
terminales de trabajo y referencia fuese cero y
se configuró la técnica con:
Vinicial = 0,
Vfinal = 1 V (entre R yW),
No. De Barridos = 2,
el período de muestreo (Ts) y el incremento de
tensión (dV) se especifican en la Tabla 2 para los
tres protocolos.
Una vez configurados todos los parámetros de la
técnica se conectó el sensor y se depositaron 10 µL
440
muestra de LB preparadas como se explicó
anteriormente. De las mismas se pusieron a incubar
9 y se midió una sin incubar. Cada media hora se
extrajo una muestra de la incubadora y se efectuó la
medición. Para la realización de estas mediciones
se utilizó el Protocolo 2 (Voltametría Cíclica de 0 a
1 V a 20 mV/s). En la figura 4 se puede observar el
comportamiento de la respuesta electroquímica en
función de la tensión aplicada entre los electrodos
de trabajo y referencia. En ella se muestra el tiempo
de incubación para cada muestra. A partir de las
curvas obtenidas se pueden analizar las variaciones
de la respuesta electroquímica de la LB en el
tiempo.
Se analizaron las variaciones alrededor de una
tensión de 0,2 V debido a que es la tensión de
excitación donde se han obtenido las respuestas de
mediciones hechas con E. coli en investigaciones
anteriores [3-9]. Se puede observar como estas
variaciones
no
son
significativas
independientemente del tiempo de incubación
transcurrido. Por tal motivo descartamos la
interferencia de la respuesta de la LB, en la
respuesta de la medición con muestras de ELEC.
a partir de tiempos de incubación superior a 3,5
horas fue repetitiva. En las mediciones realizadas
antes de las 3,5 horas no se observó respuesta.
Como era de esperar, a partir de las experiencias
con medio de cultivo DKD, el sistema se mantuvo
sin respuesta durante el tiempo que el
microorganismo demoró en transitar por su fase de
latencia [6, 9]. Esto sucede probablemente ya que
durante este período la bacteria se encuentra en un
proceso de adaptación al nuevo ambiente en que se
encuentra [14, 15], no se reproduce y por tanto los
desechos
metabólicos
tienen
una
baja
concentración que no puede ser medida. Este
tiempo es inversamente proporcional a la
concentración inicial de microorganismos [6].
En todos los casos en el barrido descendente de la
señal de excitación no se apreció respuesta dado
por la carencia de picos de corrientes apreciables.
Por esta razón se centró el estudio en el barrido
ascendente de la señal de excitación.
Figura 4. Voltamogramas a 20 mV/s de 0 a 1 V obtenidos con
4 muestras de LB obtenidos en diferentes tiempos de
incubación.
En investigaciones anteriores se reportó el
incremento del pico de corriente del voltamograma
a medida que se aumenta la velocidad de barrido
para una misma concentración, igualmente se
produce un corrimiento hacia la derecha del nivel
de tensión correspondiente al mismo [4, 5, 8, 16,
17].
Figura 3. Voltamogramas a 20 mV/s de 0 a 1 V. a) y b)
obtenidos de ELEC con diferentes tiempos de incubación y
concentración incicial 108 cel/mL. a) Muestras con 0 horas. b)
Muestras con 5,5 horas, c) y d) obtenidos con medio DKD
para tiempos de incubación de 0 horas y de 5,5 horas,
respectivamente, y concentración incicial 105 cel/mL.
En la figura 5a se presentan las respuestas del
sistema al realizar la técnica Voltametría
Cíclica a muestras de ELEC con concentración
inicial 108 cél/mL. Se utilizaron los Protocolos
1, 2 y 3 (10 mV/s, 20 mV/s y 50 mV/s). Al
realizar el experimento el período de
incubación en cada caso fue de 4.75 horas. Las
curvas que se muestran en este gráfico siguen
la forma de respuesta típica de este tipo de
sistema, tanto para el medio de cultivo ELEC
Los especialistas en microbiología plantean que en
las muestras de LB también pueden existir trazas de
microorganismos en concentraciones reducidas que
pueden variar con el transcurso del tiempo. De aquí
la necesidad de analizar si con el período de
incubación las concentraciones de estas trazas
aumenta al punto de poder afectar las mediciones.
Para determinar la influencia que la LB puede tener
sobre la respuesta del sistema se tomaron 10
441
(Fig. 5a) como DKD (Fig. 5b).
Al analizar la gráfica de la figura 5a se puede
apreciar
una
diferencia
entre
este
comportamiento y el reportado en la literatura.
Para los voltamogramas correspondientes a las
velocidades 20 mV/s y 50 mV/s la intensidad
de corriente pico varió de 0,822 µA a 1,65 µA,
coincidente con lo reportado. A diferencia, la
curva correspondiente a 10 mV/s mostró una
corriente pico de 1,38 µA, mayor que la
correspondiente a la curva de 20 mV/s,
contrario al comportamiento típico en este tipo
de sistema. Se repitieron los experimentos en
varias oportunidades y los resultados fueron
similares. Este comportamiento está aún bajo
estudio para poder esclarecer las causas que lo
provocan.
En la figura 5b se muestra la respuesta
electroquímica del sistema al realizar la técnica
Voltametría Cíclica en muestras de E. coli
inoculada en medio DKD. La concentración
inicial fue 105 cél/mL y período de incubación
de 5,68 horas. Se emplearon las velocidades de
10 mV/s, 20 mV/s y 50 mV/s en los
experimentos realizados. En estas respuestas se
aprecia el incremento de corriente pico con el
aumento de la velocidad de barrido [4, 5, 8].
Al analizar las figuras 3 y 5 es de notar la
diferencia entre los niveles de corrientes pico
correspondientes a cada velocidad para cada
una de las gráficas. Para el caso de los
experimentos mostrados en la figura 3b y 5a,
estos se realizaron con una concentración
inicial mayor que los de la figura 3d y 5b. Por
esta razón se esperaba que los niveles de
corriente, para tiempos de incubación iguales o
próximos, fuesen mayores en las curvas de las
Figura 5. Voltamogramas obtenidos con muestras de ELEC y
E. coli en DKD. a)Voltamogramas obtenidos con muestas de
ELEC con diferentes velocidades de barrido y concentración
inicial de 108 cél/mL y tiempo de incubación de 4,75 horas.
b) Voltamogramas obtenidos con diferentes velocidades de
barrido, con muestras de E. coli inoculadas en medio de
cultivo DKD con concentración inicial de 105cél/mL y tiempo
de incubación de 5,68 horas [4]
Conclusiones
Se obtuvieron voltamogramas sin pico de corriente
para tiempos de incubación inferiores de 3,5 horas
donde las muestras de ELEC, de concentración
inicial 108 cel/mL, aún transitaban por la fase de
latencia y con pico de corriente cuando ya las
muestras habían sobrepasado esta fase.
Al realizar la técnica de Voltametría Cíclica solo se
observó respuesta en el sentido ascendente de la
señal de excitación.
Se comprobó que la forma de los voltamogramas
no varió significativamente al cambiar el medio de
cultivo. Por lo que es posible la utilización del
sistema de medición electroquímico empleado en
los experimentos, en las investigaciones básicas
para el desarrollo de un sistema de control de
calidad de productos lácteos.
Al analizar las muestras de leche blanca (no
inoculada con la bacteria E. coli) no se observaron
cambios apreciables alrededor del potencial de
excitación 0,2 V, independientemente del tiempo
de incubación. Por lo que se puede descartar su
influencia en la respuesta general del sistema.
gráficas de las figuras 3b y 5a que las de las figuras
3d y 5b. Los comportamientos anteriormente
descritos probablemente estén provocados por el
cambio del medio de cultivo. Este, entre otros
interferentes, tiene presente la grasa propia de la
leche que puede adherirse a la superficie activa de
los electrodos. De esta forma se puede aumentar la
resistencia a la transferencia de electrones producto
de la reacción electroquímica en la interfaz
electrodo electrolito y de aquí el menor valor de
corriente pico. Este comportamiento aún sigue bajo
estudio para delimitar las razones que lo pueden
estar provocando. En este sentido se proyectan
experimentos donde se extraiga la mayor cantidad
posible de grasa de las muestras con el objetivo de
corroborar la hipótesis anteriormente planteada.
Las respuestas del sistema cuando se realizaron
442
experimentos con ELEC presentaron menor
sensibilidad comparado con las respuestas
cuando se utilizó E. coli en medio DKD.
Se obtuvieron anomalías en la respuesta
electroquímica cuando el sistema utilizó la
velocidad de barrido de 10 mV/s.
6.
Pavoni, S., Cobas, H. ”Electrochemical
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Sensor Based on Platinum Electrodes”. V
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7.
Pavoni, S., Cobas, H.”Estudio sobre la
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amperométrico”
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8.
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Internacional CNIC, Habana 2005.
9.
Cobas, H., Pavoni, S., Zayas, A., Rodríguez, F.,
Álvarez, E., Contreras, R. “Aplicación de la
Voltametría en el Análisis del Crecimiento
Microbiológico”. VII Congreso de la Sociedad
Cubana de Bioingeniería, Habana 2007.
Agradecimientos
Los autores agradecen enormemente por la ayuda
prestada a:
− Instituto de Pesquisas Tecnológicas del Estado
de São Paulo, en particular al Dr. Mario
Ricardo Gongora Rubio.
− Al proyecto SENSAME del Programa
Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para
el Desarrollo CYTED, en particular a la
Dra. Cecilia Jiménez Jorquera.
− Instituto de Química y Biosensores (ICB) de
Münster, Alemania.
10. Cobas, H., Valdés, E., Pavoni, S. “Sistema
basado en la instrumentación virtual para
mediciones voltamétricas”. Proc. XI Workshop
International Iberchip, Salvador de Bahía, pp.
358-359, 2005.
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Pavoni, S., Cobas, H., Zayas, A., Álvarez, E.,
Contreras, R., Rodríguez, F. “Evaluación de un
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443