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Centro de Investigación Científica de Yucatán,
A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
Estudio del Efecto del Virus mosaico de la
Euphorbia aislado de la península de Yucatán
(EuMV-YP) en la anatomía de las hojas de Solanum
lycopersicum y en la inducción de la expresión
génica
Tesis que presenta
Jaqueline Guadalupe Carrillo Navarrete
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
2015
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo
tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley
Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
Firma: ________________________________
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a mis asesoras de tesis la Dra. Luisa A. López Ochoa
y la Dra. Virginia A. Herrera Valencia porque siempre estuvieron al pendiente de mis
avances, me corrigieron en mis errores, me compartieron sus experiencias y por la
confianza que depositaron en mí durante todo este tiempo.
Al comité tutorial integrado por los doctores Luisa A. López Ochoa, Virginia A. Herrera
Valencia, Santy Peraza Echeverría y Aída Martínez Hernández, por sus valiosos
comentarios a lo largo del trabajo de tesis.
Al comité de revisión de tesis formado por los doctores Luisa A. López Ochoa, Virginia A.
Herrera Valencia, Santy Peraza Echeverría, Aída Martínez Hernández, Gregorio del
Carmen Godoy Hernández, por su valiosa revisión y aportes al documento de tesis.
A la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas y la Unidad de Biotecnología
del CICY por las facilidades para realizar el trabajo experimental de la tesis de maestría.
Al Posgrado en Ciencias Biológicas del CICY, así como a todo el personal por las
facilidades brindadas para realización de esta tesis.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada #289876
para los estudios de maestría, así como al financiamiento del proyecto de ciencia básica
No. 98920 otorgado para la realización de este proyecto.
A la Dra. Naivy F. Gamboa Tec, por su valiosa asesoría en la realización del proceso de
infección y colecta de las plantas de S. lycopersicum.
A la Dra. Ivonne Sánchez del Pino y al Dr. José Juan Zúñiga, por el amable préstamo del
Microscopio estereoscopio NIKON modelo ECLIPSE E200 y su apoyo técnico en la
captura de imágenes en el Software INFINITY ANALYZER 3.
Al apoyo técnico del M. en C. Luis Carlos Gutiérrez, por su valiosa asesoría en los análisis
de los cortes histológicos.
Al apoyo técnico de la Q.B.A. Ileana C. Borges Argáez, por su apoyo técnico en los
experimentos de biobalística.
Al M. en C. Randy Noé Avilez Montalvo, por la cantidad de tiempo brindado para la
discusión de artículos y protocolos empleados.
A mis amigos los golosos del CICY por esos momentos de ñoñería y debates
existenciales, de alegrías y tristezas pero siempre firmes.
DEDICATORIA
A mi Dios el Universo, por todo y por mucho más.
A mis padres, por ser mis guías de vida y mis mayores ejemplos de amor, lucha, entrega
y perseverancia, porque como dice papá “por muy oscuro que se encuentre el camino
siempre hay que seguir adelante, pues al final, siempre hay una luz. Queda estrictamente
prohibido echar para atrás, pues caminar hacia atrás es más fácil perderse”. Gracias papá
y mamá, esta va por ustedes. Aún me falta por caminar, pues esto es solo el inicio de
muchos otros caminos. A mis hermanas, porque juntas hacemos un excelente equipo.
A mis abuelitas, por cada una de sus oraciones de paz y tranquilidad, ustedes siempre
presentes.
A Randy, gracias por las porras en mis momentos de desánimo y apatía, y gracias
también por compartir los momentos de alegrías. Sin duda alguna hacemos una excelente
mancuerna. Soy tu Fan #1, TE AMO.
Si he visto más lejos es porque estoy sentado en los hombros
de gigantes.
Issac Newton.
INDICE
ÍNDICE DE CONTENIDO
INDICE DE FIGURAS ............................................................................................................... v
INDICE DE CUADROS ........................................................................................................... vii
ABREVIATURAS.................................................................................................................... ix
RESUMEN...................................................................................................................... 1
ABSTRACT ..................................................................................................................... 3
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 5
CAPÍTULO I .................................................................................................................... 7
1.1 ANTECEDENTES ............................................................................................................... 7
1.1.1.
Generalidades de los Virus ....................................................................................................... 7
1.1.2.
Familia Geminiviridae; clasificación taxonómica...................................................................... 8
1.1.3.
Begomovirus........................................................................................................................... 11
1.1.4.
Virus Mosaico de la Euphorbia (EuMV).................................................................................. 12
1.1.5.
EuMV-YP................................................................................................................................. 13
1.1.6.
Ciclo celular ............................................................................................................................ 14
1.1.7.
Retinoblastoma y Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) ............................... 16
1.1.8.
Los Geminivirus y el ciclo celular ............................................................................................ 17
1.1.9.
Generalidades de S. lycoperscum........................................................................................... 19
1.2 HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 21
1.3 OBJETIVOS .................................................................................................................... 21
1.3.1.
1.3.1 Objetivo general. ........................................................................................................... 21
1.3.2.
1.3.2 Objetivos específicos. .................................................................................................... 21
1.4 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 22
1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL.......................................................................................... 23
CAPITULO II ................................................................................................................. 27
EFECTO CITOPÁTICO CAUSADO POR EL VIRUS DEL MOSAICO DE LA EUPHORBIA AISLADO DE LA
i
INDICE
PENÍNSULA DE YUCATÁN EN PLANTAS DE Solanum lycopersicum. ........................................ 27
2.1 INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 27
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ............................................................................................ 30
2.2.1 Material vegetal.............................................................................................................................. 30
2.2.2. Inoculación de plantas ................................................................................................................... 30
2.2.3 Seguimiento de síntomas y colecta de material vegetal ................................................................ 30
2.2.4 Cortes histológicos.......................................................................................................................... 31
2.2.5 Tinción con azul de toluidina .......................................................................................................... 32
2.2.6 Captura de imágenes y análisis de medición .................................................................................. 32
2.3 RESULTADOS................................................................................................................. 34
2.3.1 Síntomas evaluados en plantas inoculadas con EuMV-YP.............................................................. 34
................................................................................................................................................................. 37
2.3.2 Alteraciones producidas por EuMV-YP ........................................................................................... 37
2.3.3. Distorsiones en las nervaduras ...................................................................................................... 38
2.3.4 Alteraciones en la región proximal al margen de la hoja e hiperplasia .......................................... 42
2.4. DISCUSIÓN. .................................................................................................................. 45
CAPÍTULO III ................................................................................................................ 49
EuMV-YP INDUCE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS A LA MITOSIS EN S. lycopersicum.... 49
3.1 INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 49
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 51
3.2.1 Material vegetal.............................................................................................................................. 51
3.2.2 Extracción de ARN de tejido foliar de S. lycopersicum.................................................................... 51
3.2.3 RT-PCR ............................................................................................................................................ 51
3.3 RESULTADOS................................................................................................................. 54
3.3.1 Extracción de ARN Total ................................................................................................................. 54
3.3.2 Perfiles de expresión para los genes CDKB1, CDKB2, PCNA y Actina ............................................. 55
3.4 DISCUSIÓN .................................................................................................................... 57
CAPÍTULO IV................................................................................................................ 61
ii
INDICE
CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS ............................................................... 61
4.1 CONCLUSIONES GENERALES........................................................................................... 61
4.2 PERSPECTIVAS............................................................................................................... 62
iii
INDICE
iv
INDICE
INDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Organización genómica de los miembros representativos de la familia
Geminiviridae................................................................................................................... 10
Figura 1.2 Clasificación taxonómica de la familia Geminiviridae (Varsani et al., 2014).... 10
Figura 1.3 Síntomas de las plantas infectadas con EuMV-YP........................................ 13
Figura 1.4 Reprogramación del ciclo celular en plantas. ................................................. 18
Figura 1.5 Estrategia experimental de acuerdo a los objetivos del proyecto. .................. 23
Figura 2.1 Ejemplo del corte transversal de una hoja sana de S. lycopersicum, armado a
partir de varias fotografías……………………………………………………………………….33
Figura 2.2 Ejemplo de síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum
cultivadas bajo condiciones in vitro……………………………………………………………..36
Figura 2.3 Retraso del crecimiento en S. lycopersicum ocasionado por EuMV-YP………37
Figura 2.4 Reconstrucción de cortes transversales de hojas de S. lycopersicum
inoculadas con EuMV-YP………………………………………………………………………..38
Figura 2.5 Alteraciones en la nervadura foliar causada por EuMV-YP en S.lycopersicum.
Sección de nervaduras centrales……………………………………………………………….39
Figura 2.6 Alteraciones en las nervaduras laterales de las hojas de S. lycopersicum
inoculadas con EuMV-YP………………………………………………………………………..41
Figura 2.7 Alteraciones del EuMV-YP en la región próxima al margen de la hoja en S.
lycopersicum……………………………………………………………………………………... 42
Figura 2.8 Cambios en la arquitectura tisular e hiperplasia en S. lycopersicum inducidos
v
INDICE
por la inoculación con EuMV-YP………………………………………………………………. 43
Figura 3.1 Muestras de ARN total de los explantes foliares de S. lycopersicum………...55
Figura 3.2 El EuMV-YP aumenta la expresión de genes asociados a la mitosis…………56
vi
INDICE
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1.1 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus basada en
los hospederos naturales, insecto vector y organización genómica ................................... 9
Cuadro 1.2 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus.............. 12
Cuadro 2.1 Severidad de síntomas de S. lycopersicum (Gamboa-Tec et al., 2015)…....31
Cuadro 2.2 Resultado de la severidad de síntomas observados en plantas inoculadas con
EuMV-YP a los 21 ddi………………………………………………………………………….. 34
Cuadro 2.3 Síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum. As;
Asintomáticas, A: Atenuadas, M: Moderadas, S: severas, ddi: días después de la
infección………………………………………………………………………………………….. 35
Cuadro 2.4 Tamaño de la nervadura central de las plantas inoculadas con EuMV-YP….40
Cuadro 2.5 Análisis estadístico de las mediciones del grosor de la lámina foliar en S.
lycopersicum, plantas sanas y plantas inoculadas con EuMV-YP…………………………..43
Cuadro 2.6 Número de células por micrómetro cuadrado en el mesófilo de plantas de
tomate inoculadas con EuMV-YP……………………………………………………………….44
Cuadro 3.1 Secuencia de cebadores para el análisis de expresión genética…………. 52
Cuadro 3.2 Cuantificación del ARN total obtenido……………………………………………54
vii
INDICE
viii
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
AC1/AL1/Rep
Proteína tipo replicasa
AC2/AL2/Trap
Proteína transactivadora (trans-activator protein)
AC3/AL3/REn
Proteína potenciadora de la replicación (Replication enhancer protein)
ADN
Ácido desoxirribonucleico
ADNcd
ADN de cadena doble
ADNcs
ADN de cadena sencilla
ARN
Ácido ribonucleico
BC1/BL1/MP
Proteína del movimiento (Movement protein)
BV1/BR1/NSP
Proteína transportadora nuclear ( Nuclear shuttle protein)
CDK
Proteína transportadora nuclear ( Nuclear shuttle protein)
EuMV
Virus mosaico de la Euphorbia
EuMV-YP
Virus mosaico de la Euphorbia aislado de la península de Yucatán
ICTV
Comité internacional de taxonomía de virus
PCNA
Antígeno nuclear de células en proliferación
pRBR
Proteína de retinoblastoma en plantas
RT-PCR
Reacción en cadena de la polimerasa acoplado a transcripción reversa
TYLCSV
Virus del rizado amarillo del tomate aislado de la sardina
TYLCV
Virus del rizado y amarillamiento del tomate
ix
ABREVIATURAS
VIGS
Vector de silenciamiento génico basado en virus
x
RESUMEN
RESUMEN
Los geminivirus son virus de ADN circular de cadena sencilla, que se replican en el núcleo
de las células infectadas y son causantes de enfermedades en las plantas. Los
pertenecientes al género Begomovirus son los más representados, éstos pueden ser de
uno o dos componentes genómicos, y son también llamados mono y bipartitas
respectivamente. Para replicar su genoma los begomovirus bipartitas reprograman la
expresión de genes del ciclo celular para estimular la replicación del ADN en las células
diferenciadas, sin pasar por la mitosis en un proceso conocido como endorreduplicación.
Por el contrario los begomovirus monopartitas son capaces de inducir la proliferación
celular cuando están asociados a B-satélites. Recientemente, se encontró que el aislado
de la península de Yucatán del Virus del mosaico de la Euphorbia (EuMV-YP) invade las
células del mesófilo e induce la proliferación celular causando pérdida de identidad tisular
en plantas de Nicotiana benthamiana. En virtud de que la localización y el efecto
citopático causado por diferentes aislados de EuMV, parecen ser dependientes del
hospedero, en éste trabajo se evaluó el efecto causado por EuMV-YP en plantas de S.
lycopersicum, y se estudió la expresión de genes asociados con la mitosis. Los resultados
obtenidos mostraron que EuMV-YP tiene un comportamiento diferente a los demás
begomovirus bipartitas, ya que las células del mesófilo presentaron proliferación celular,
estos resultados se muestran en el capítulo II. Además se observó la inducción de la
expresión de los genes CDKB1 y CDKB2, confirmando que EuMV-YP es capaz de inducir
la mitosis, estos resultados se presentan en el capítulo III.
1
RESUMEN
2
ABSTRACT
ABSTRACT
The Geminiviruses are circular single-stranded DNA viruses which replicate in the nucleus
of infected cells and are responsible for several plant diseases. Those belonging to the
genus begomovirus are the most represented, they can be one or two genomic
components, and are also called mono and bipartite respectively. In order to replicate its
genome begomovirus reprogram the bipartite expression of cell cycle genes to stimulate
DNA replication in differentiated cells, and they do this without going through mitosis in a
process known as endoreduplication. Conversely the monopartite begomoviruses are
capable of inducing cell proliferation when associated with B-satellites. Recently, it was
found that the isolated Yucatan Peninsula Mosaic Virus Euphorbia (EuMV-YP) invades
mesophyll cells and induces cell proliferation, causing loss of tissue identity in Nicotiana
benthamiana plants. Given that the location and the cytopathic effect caused by different
isolates of EuMV seems to be dependent on the host, in this work the effect caused by
EuMV-YP (Chapter II) in Solanum lycopersicum plants was evaluated and studied genes
associated expression with mitosis. The results showed that EuMV-YP has a different
behavior to others bipartite begomovirus since mesophyll cells showed cell proliferation,
these results are shown in EuMV-YP also induces the expression of the CDKB1 CDKB2
genes was observed, confirming that EuMV-YP is capable of inducing mitosis, these
results are shown in Chapter III
3
ABSTRACT
4
INTRODUCCION
INTRODUCCIÓN
La familia Geminiviridae incluye virus que infectan a una gran variedad de especies de
plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, produciendo en muchos casos pérdidas
significativas en cultivos de importancia económica.
Los virus pertenecientes a esta familia son caracterizados estructuralmente por la
morfología geminada de las partículas del virión (18-30 nm) y genéticamente por un
genoma que consta de una o dos moléculas de ADN circular de cadena sencilla; esta
característica es poco común entre los virus de plantas (Fondong, 2013). Para poder
replicarse los virus de esta familia reprograman el ciclo celular de su hospedero, sin
embargo, se ha visto que miembros de diferentes géneros reprograman el ciclo celular de
forma diferente (Gutierrez, 2000).
El género begomovirus es uno de los 7 géneros de la familia Geminiviridae, su genoma
puede ser; monopartita o bipartita, además es el género con más especies virales dentro
de la familia Geminiviridae. Los virus pertenecientes a este grupo requieren de la
maquinaria de las células que infectan para poder replicarse (Fondong, 2013; RuizHerrera et al., 1997) Cuando una célula se encuentra en estado quiescente se ha
reportado que los begomovirus intervienen en la activación del ciclo celular provocando
división celular anormal (Hanley-Bowdoin et al., 2013). Los begomovirus bipartitas al igual
que los mastrevirus inducen la reentrada del ciclo celular, en vez de pasar por la mitosis
activando el endociclo (Hanley-Bowdoin et al., 2013).
El Virus del mosaico de la Euphorbia aislado de la península de Yucatán (EuMV-YP) es
un begomovirus bipartita que tiene un amplio rango de hospederos, incluso plantas de
interés comercial como chile, tomate y frijol (Villanueva-Alonzo et al., 2013).En estudios
recientes en nuestro grupo de trabajo, se observó que el EuMV-YP induce la expresión de
genes de la mitosis en plantas de N. benthamiana, infecta células del mesófilo e induce
hiperplasia causando pérdida de identidad tisular (Gamboa-Tec et al., 2015; Fondong,
2013), ésta es una alteración inusual debido a que EuMV-YP es un begomovirus bipartita
y los begomovirus bipartitas inducen la reentrada al endociclo, no la mitosis. Para
determinar si esta respuesta inusual está dada por determinantes genéticos virales, en
5
INTRODUCCION
este trabajo se infectaron plantas de S. lycopersicum variedad Saladette con EuMV-YP y
se estudiaron los cambios morfológicos y la expresión de los genes del ciclo celular que
pudieran estar involucrados en la infección viral.
6
CAPÍTULO I
CAPÍTULO I
1.1 ANTECEDENTES
1.1.1.
Generalidades de los Virus
Los virus son partículas submicroscópicas de una o más moléculas de ADN o ARN de
cadena doble o sencilla, normalmente encapsuladas en cubiertas de proteínas o
lipoproteínas, capaces de organizar su propia replicación dentro de una célula hospedera
(Ruiz-Herrera et al., 1997). Durante millones de años los virus han interactuado con los
mecanismos moleculares de la célula que parasitan, llamada célula hospedera para su
propio beneficio y han evolucionado con ella para explotar sus fuentes de energía y su
maquinaria biosintética (Kang et al., 2005).
Los virus infectan a casi todos los organismos vivientes, multicelulares o unicelulares
como por ejemplo bacterias, hongos, plantas y animales. Son clasificados en jerarquías
por el comité internacional de taxonomía de virus (ICTV) (Gutierrez, 2000). Esta
clasificación se basa en las propiedades físicas del virus; como el tamaño y la forma,
además, en factores involucrados en la replicación como el número de componentes
genómicos, el tipo y naturaleza de los ácidos nucleicos, la estructura del genoma (lineal o
circular) (Fauquet y Stanley, 2005). Los virus de plantas se han clasificado en 20 familias
y 88 géneros, el 90% de los virus de plantas tienen genomas de ARN y el 10% restante
posee genomas de ADN (Fauquet et al., 2008).
En las plantas las enfermedades virales están influenciadas por varios factores, tales
como ambientales, replicación del viroide, modo de dispersión del virus, niveles de
agresividad del virus y niveles de resistencia de la planta hospedera (Torres-Pacheco et
al., 1996). Existen diferentes vías de transmisión viral, por ejemplo; a) Mecánica: por
contacto de parte de plantas infectadas con plantas sanas (transmisión por maquinaria
agrícola contaminada, las manos de los operadores o animales). b) Por vectores, que
pueden ser insectos, ácaros, nematodos, etc. y c) a través de las partes de la planta
usadas para la propagación, ya sea semillas o tubérculos (Jones, 2003). Sin embargo, la
transmisión por vectores es la más eficiente y tiene mayor repercusión, por lo tanto se
7
CAPÍTULO I
usan diversos insecticidas químicos para controlarlos. Esto repercute de manera
importante en los costos de producción agrícola y en la contaminación ambiental.
1.1.2.
Familia Geminiviridae; clasificación taxonómica
La familia Geminiviridae es una de las familias de virus más grandes y más importantes
que infectan a una gran variedad de especies de plantas dicotiledóneas y
monocotiledóneas (Fondong, 2013), ocasionando daños y pérdidas de importancia
económica. La incidencia y severidad de las enfermedades ocasionadas por geminivirus
se ha incrementado considerablemente en los últimos 20 años (Varsani et al., 2014).
Los geminivirus se caracterizan estructuralmente por la morfología de las partículas
icosaédricas geminadas del virión y genéticamente por la conformación de su genoma
que consiste en uno o dos moléculas de ADN de cadena simple circular sencilla (Fauquet
et al., 2008). El ADN de doble cadena (ADNdc) (formas replicativas) es transcrito en el
núcleo de las células infectadas de las plantas (Fondong, 2013), donde también se lleva a
cabo la replicación. El genoma de estos virus es pequeño, con un tamaño promedio de
2.5 a 3 X 103 nucleótidos, y puede ser monopartitas o bipartitas (Hanley-Bowdoin et al.,
2013). Los miembros representativos de esta familia son los géneros Mastrevirus,
Curtovirus y los Begomovirus, debido a la organización de su genoma (Gutierrez, 2000)
(Figura 1.1). Los miembros pertenecientes a la familia de los geminivirus se replican por
círculo rodante y por replicación dependiente de la recombinación (Hanley-Bowdoin et al.,
2013).
En base a la organización de su genoma, el insecto vector y el rango de plantas
hospederas, los geminivirus, son clasificados por el comité internacional de taxonomía de
virus (ICTV) en 7 géneros; Mastrevirus, Curtovirus, Begomovirus, Topocuvirus,
Becurtovirus, Eragrovirus, y Turncurtovirus (Figura 1.2) (Varsani et al., 2014). Los
miembros del género Mastrevirus tienen un componente genómico (monopartitas), son
transmitidos por varias especies de chicharritas que infectan plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas, los miembros del género Curtovirus tienen un solo componente genómico,
son transmitidos por chicharritas del género Circulifer y son exclusivos de plantas
dicotiledóneas, los miembros del genero Begomovirus pueden presentar un genoma
monopartita o doble genoma (bipartita), son transmitidos por la mosquita blanca (Bemisia
8
CAPÍTULO I
tabaci),e infectan a plantas dicotiledóneas, los Topocuvirus tienen un solo componente
genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y son transmitidos por insectos de la familia
Membracide. Los Becurtovirus, Eragrovirus, y Turncurtovirus son los géneros de reciente
incorporación en la familia Geminiviridae (Varsani et al., 2014). Los Becurtovirus tienen un
componente genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y son transmitidos por
chicharritas (Circulifer haematoceps). Los Eragrovirus contienen un solo componente
genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y de igual forma son transmitidos por
chicharritas. Los Turncurtovirus tiene un componente genómico, infectan a plantas
dicotiledóneas y son transmitidos por chicharritas (Varsani et al., 2014) (Cuadro 1.1).
Cuadro 1.1 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus basada en
los hospederos naturales, insecto vector y organización genómica
Género
Hospedero
Vector
Genoma
Mastrevirus
Monocotiledóneas y
Chicharritas
Monopartita
dicotiledóneas
(Cicadellidae)
Dicotiledóneas
Chicharritas
Curtovirus
Monopartita
(Cicadellidae)
Begomovirus
Topocuvirus
Dicotiledóneas
Dicotiledóneas
Mosca blanca
Monopartita y
(Aleyrodidae)
bipartita
Chicharritas
Monopartita
(Membracidae)
Becurtovirus
Dicotiledóneas
Chicharritas
Monopartita
(Cicadellidae)
Eragrovirus
Dicotiledóneas
Chicharritas
Monopartita
(Cicadellidae)
Turncurtovirus
Dicotiledóneas
Chicharritas
Monopartita
(Cicadellidae)
9
CAPÍTULO I
Figura 1.1 Organización genómica de los miembros representativos de la familia Geminiviridae. La
región (LIR, IR, CR) contiene señales requeridas para la replicación y la transcripción del ADN viral.
Figura 1.2 Clasificación taxonómica de la familia Geminiviridae (Varsani et al., 2014).
10
CAPÍTULO I
1.1.3.
Begomovirus
El género Begomovirus es el de mayor importancia dentro de la familia de los geminivirus,
por ser el más abundante (contiene 288 especies virales), con un amplio rango de
hospederos e infecta a plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, produciendo pérdidas
de importancia económica (Fondong, 2013). Los begomovirus se han diseminado
rápidamente por el planeta debido fundamentalmente a la propagación de su vector, la
mosquita blanca (Bemisa tabaci) (Nawaz-ul-Rehman y Fauquet, 2009).
Con base en la organización del genoma, diversidad genética y distribución geográfica los
begomovirus han sido divididos en dos grupos; begomovirus del viejo mundo (OW), los
cuales se encuentran en algunos países de Europa, África, Asia y Australia y los
begomovirus del nuevo mundo (NW), exclusivos del continente Americano (Varsani et al.,
2009). Los begomovirus del viejo mundo son bipartitas y monopartitas y los
pertenecientes al nuevo mundo, solo se han identificado virus representativos del genoma
bipartita (Varsani et al., 2009).
El genoma de los begomovirus está compuesto de ADN circular de cadena simple de
aproximadamente 2.8 kb (monopartita) y 5.2 kb (bipartita) (Gregorio-Jorge et al., 2010).
Los virus bipartitas tienen dos componentes circulares denominados ADN-A y ADN-B. El
componente A, contiene toda la información que las proteínas virales requieren para la
replicación, transcripción y encapsulación del ADN del virus, mientras que el componente
B codifica para las proteínas involucradas en el movimiento (Cuadro 1.2) (Ruiz-Herrera et
al., 1997). Los dos componentes que integran el genoma de un virus bipartita son
heterólogos entre si y solo comparten una región de 200 nucleótidos con un alto
porcentaje de identidad (Gregorio-Jorge et al., 2010), este fragmento denominado región
común (RC) está dentro de la región intergénica y contiene un segmento de 30
nucleótidos capaz de formar la estructura de tallo-asa, la cual está involucrada con el
inicio de la replicación viral (Gregorio-Jorge et al., 2010). El begomovirus monopartita
está constituido de un solo componente genómico de ADN circular que es equivalente a
los componentes ADN-A y ADN-B de los begomovirus bipartitas (Gregorio-Jorge et al.,
2010).
11
CAPÍTULO I
Cuadro 1.2 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus
NOMENCLATURA
FUNCIÓN
GENOMA
AC1 AL1 Rep
Iniciación de la replicación
A
AC2 AL2 Trap
Activación de la transcripción de genes tardíos
A
AC3 AL3 Ren
Replicación
A
AC4 AL4
Replicación
A
AV1 AR1 CP
Proteína de la cápside
A
BC1 BL1 MP
Movimiento viral Célula-célula
B
Movimiento viral hacia el núcleo
B
BV1 BR1 NSP
1.1.4.
Virus Mosaico de la Euphorbia (EuMV)
El EuMV, es un begomovirus bipartita cuyo hospedero natural es la planta silvestre E.
heterophylla, este virus fue descubierto y descrito desde los años 50, sin embargo, fue
hasta los años 80 que se logró clasificar con base a sus factores biológicos, bioquímicos y
propiedades físicas dentro de la familia Geminividae (Kim y Lee, 1992).
Debido al desarrollo de nuevas herramientas moleculares y los servicios de secuenciación
a escala industrial a bajo costo (Sanger y una variedad de técnicas de secuenciación de
nueva generación) se ha logrado identificar diversos aislados de este virus como el
aislado de Yucatán (EuMV-YP), Jalisco (EuMV-Jal), Cuba (EuMV-CU: Tb y EuMV-CU:
Hav) Jamaica (EuMV-JM), Estados Unidos (EuMV-EU4) y Brasil (EuMV-MGS1 y EuMVMGS 2). (Fiallo-Olivé et al., 2012; Fiallo-Olivé et al., 2010; Gregorio-Jorge et al., 2010;
Collins y Roye, 2007; Hernández-Zepeda et al., 2007).
12
CAPÍTULO I
1.1.5.
EuMV-YP
El aislado de la península de Yucatán del virus del mosaico de la Euphorbia (EuMV-YP)
fue identificado en plantas de E. heterophylla en el 2007 (Hernández-Zepeda et al., 2007),
siendo la primera vez que se reportó la secuencia completa del ADN-B. La Obtención de
las secuencias de ambos componentes genómicos, permitió su clasificación dentro el
clado del Virus mosaico de la calabaza (SqMV) (Hernández-Zepeda et al., 2007).
Con las clonas infectivas obtenidas en este trabajo se inocularon plantas mediante
biobalística, encontrándose hospederos experimentales pertenecientes a las familias
Euphorbiaceae, Malvaceae y Solanaceae incluyendo algunas especies de importancia
agronómica como Capsicum chinense, Nicotiana tabacum, S. lycopersicum, Arabidopsis
thaliana, N. benthamiana (Hernández-Zepeda et al., 2007). Los síntomas observados
fueron: mosaicos dorados, enrollamiento de las hojas y moteados amarillos (Figura 1.3)
Figura 1.3 Síntomas de las plantas infectadas con EuMV-YP, inoculadas por biobalística (A) chile (C.
chinense), (B) Frijol (P.vulgaris) y (C) Euphorbia (E. heterophylla).
13
CAPÍTULO I
El EuMV-YP fue utilizado para la construcción de un vector de silenciamiento inducido por
virus tipo (VIGS), el cual permitió estudiar la respuesta de genes relacionados con la
patogenicidad en plantas de N. benthamiana y C. chinense (Villanueva-Alonzo et al.,
2013). Empleando el gen de la subunidad I del magnesio quelatasa se encontró que el
silenciamiento inducido por este vector era inicialmente mayor en el floema, lo que llevó a
sugerir que EuMV-YP estaba restringido a este tejido (Villanueva-Alonzo et al., 2013).
Se ha visto que los aislados de Florida y Costa Rica de EuMV inducen cambios en la
arquitectura tisular de Datura stramonium, un hospedero experimental, pero no en el
hospedero natural E. heterophylla (Kim y Fulton, 1984). Gamboa-Te, recientemente
identificó que el EuMV-YP induce cambios en la arquitectura tisular e hiperplasia en tejido
foliar de N. benthamiana (Gamboa-Tec et al., 2015). Utilizando técnicas de
inmunofluorescencia se observó, que éste virus se localiza tanto en las células del
mesófilo como en el floema. Esto es interesante, ya que en estudios anteriores se reportó
que el aislado de Costa Rica se encuentra restringido al floema en E. heterophylla (Kim y
Lee, 1992); mientras que el aislado de Florida se encontró en células de la epidermis y del
mesófilo
en
plantas
de
Datura
stramonium
(Kim
y
Lee,
1992)
Esto podría sugerir que la afinidad tisular de los distintos aislados de EuMV depende del
hospedero. Cabe mencionar que en la época en la que se estudió a los aislados de
Florida y Costa-Rica el diagnóstico se realizaba por la morfología de las partículas virales,
ya que no se contaba con sus secuencias virales. Por lo que no está claro si dichos
aislados realmente correspondan a EuMV o si pudiesen tratarse de aislados de otra
especie de geminivirus causante de mosaicos en E. heterophilla. Por lo tanto, es
necesario determinar si EuMV-YP es capaz de invadir el mesófilo de otros hospederos,
así como determinar si puede provocar hiperplasia y cambios en su estructura tisular.
1.1.6.
Ciclo celular
En las plantas la división celular constituye un proceso de importancia vital, no solo para
el crecimiento vegetal sino también para el desarrollo. En todos los organismos las células
llevan a cabo un patrón predeterminado de crecimiento. En las células eucariotas este
patrón de crecimiento es realizado a manera de ciclos (Vázquez, 2006)
El ciclo celular en las plantas es similar al de otros organismos superiores, sin embargo,
14
CAPÍTULO I
existen diferencias importantes con respecto al de los animales, ya que la vía en que la
división celular se integra dentro del desarrollo es diferente; en los animales la forma del
organismo está determinada en el embrión y lo que ocurre es una migración celular en el
organismo maduro, la división celular reemplaza células pérdidas o dañadas (EchevarríaMachado et al., 2002). Las plantas pueden continuar creciendo y alterar su forma a través
de su ciclo de vida por división celular en regiones especializadas conocidas como
meristemos y por el subsecuente desarrollo de tejidos y órganos (Echevarría-Machado et
al., 2002).
El ciclo celular está dividido en dos etapas conocidas como interface y fase M. La
interface consta de 3 partes; 1) G1; en esta fase la célula crece, acumula nutrientes y se
prepara para que, en el caso de que las condiciones sean adecuadas, el ADN sea
duplicado, 2) S o fase de síntesis; el material genético es duplicado, 3) G2, en esta fase la
célula continua creciendo y lleva a cabo una preparación y organización para que el
material genético se segregue adecuadamente en la fase M, la fase M; de mitosis o
división celular, sucede la división equitativa del material genético a las células hijas
(Vázquez, 2006).
Existen señales que inducen la entrada a la división celular y otras que detienen el ciclo
en la fase G1, lo que provoca la interrupción de la proliferación celular; es en este
proceso, denominado estado quiescente (G0), en donde la célula queda metabólicamente
activa pero no prolifera (Muller et al., 1993).
La transición de una fase a otra dentro del ciclo celular es regulada por ciclinas (CYC).
Las ciclinas, son proteínas que se acumulan continuamente a través del ciclo celular, y
son proteolíticamente destruidas en la mitosis. En las plantas se han descrito 60 ciclinas,
49 en A. thaliana, más que en algún otro organismo eucariótico. Las ciclinas en los
mamíferos se clasifican en; A, B1, B2, C, D1, D2, D3, E, F, G1, G2, H, I, K, T1, y T2; las
ciclinas de plantas son clasificadas en 5 grupos: A, B, C, D y H. Las ciclinas de tipo A y B
conocidas como ciclinas mitóticas, se acumulan durante las fases S, G2 y la fase
temprana M. Las ciclinas de tipo D, controlan la progresión a través de la fase G1 en
respuesta a factores de crecimiento y nutrientes. Las ciclinas de tipo H y C, han sido
caracterizadas en álamo y arroz (Renaudin et al., 1996). Las ciclinas contienen una región
común conocida como cyclin box, de aproximadamente 150 aminoácidos, un dominio
15
CAPÍTULO I
conservado responsable de la unión y activación de las cinasas dependientes de ciclinas
(CDK’s) (Renaudin et al., 1996).
Las CDK’s, son una familia de proteínas cinasas que también intervienen en el ciclo
celular, estas fosforilan en residuos de serina/treonina y requieren asociarse a las ciclinas
para realizar su función (Renaudin et al., 1996). Los efectores a través de una cascada de
señalización, pueden modificar la actividad de estas cinasas, regulando de esta manera
los eventos del ciclo celular.
1.1.7.
Retinoblastoma y Antígeno nuclear de células en proliferación
(PCNA)
El ciclo celular involucra a diversas proteínas que participan regulando sus diferentes
fases, como por ejemplo; la proteína relacionada con el retinoblastoma (pRBR) que regula
la transición de la fase G1/S en mamíferos (Echevarría-Machado et al., 2002). En plantas,
el homólogo animal de pRBR es un regulador clave del ciclo celular (Hanley-Bowdoin et
al., 2013; Echevarría-Machado et al., 2002). pRBR es un inhibidor de la actividad de la
familia de factores de transcripción E2F, los cuales son reguladores maestros de la
expresión de genes involucrados en la transición entre las fases G0/G1. Los complejos
pRBR-E2F detiene el inicio del ciclo celular, esta inhibición se revierte cuando pRBR es
fosforilada (Hanley-Bowdoin et al., 2013). El avance hacia las diferentes fases del ciclo
celular esta mediado por la familia de proteínas cinasas dependientes de ciclinas (CDKs)
cuya actividad está regulada por la interacción con diferentes ciclinas. La degradación y
síntesis de las ciclinas durante el ciclo celular es un proceso altamente regulado. Lo cual,
aunado a la acción de los inhibidores de cinasas constituyen al control del ciclo celular
(Renaudin et al., 1996).
El antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) es otro componente esencial de la
maquinaria de replicación, recombinación y reparación del ADN ya que participa en
proporcionar posesividad a la DNA polimerasa durante la replicación. PCNA interactúa
con proteínas celulares involucradas en la regulación del ciclo celular (Keiman, 1997).
16
CAPÍTULO I
1.1.8.
Los Geminivirus y el ciclo celular
Existen reportes que sugieren que los geminivirus intervienen en el ciclo celular de las
células de las plantas que infectan. Se ha visto que los dsDNA de geminivirus son 20
veces más abundantes en los núcleos de las células en la fase S que en la células
situadas en otras fases del ciclo (Accotto et al., 1993), esto llevó a la conclusión de que la
replicación del ADN de los geminivirus está sincronizada con la capacidad de la célula
hospedera para replicar su ADN durante la fase S (Accotto et al., 1993).
La proteína Rep y REn de los geminivirus, interactúan con PCNA y pRBR del hospedero
para inducir la replicación viral (Castillo et al., 2003). Durante la infección viral se inactiva
la pRBR, desensamblando los complejos con los factores E2F, permitiendo la reentrada a
la fase S, lo cual es una característica de muchos virus de ADN pequeños que infectan a
plantas y animales (Hanley-Bowdoin et al., 2013). La interferencia de geminivirus con
reguladores del ciclo celular, conduce a una progresión anormal a través de la fase-S,
eventualmente lleva a la división celular con el consecuente aumento en el número de
células, fenómeno conocido como proliferación celular.
Trabajos anteriores sugieren que los miembros de los géneros Mastrevirus, Begomovirus
y Curtovirus reprograman el ciclo celular cuando infectan a células maduras en estado
quiescente para inducir la replicación tanto del ADN viral como del cromosómico (HanleyBowdoin et al., 2013). Los Curtovirus inducen la proliferación celular en las plantas
infectadas, mientras que los Begomovirus y Mastrevirus provocan el aumento del tamaño
de las células debido a la síntesis continua de ADN cromosómico en las células
infectadas, sin llevarse a cabo la división celular, en un proceso conocido como
endorreduplicación o endociclo (Hanley-Bowdoin et al., 2013). En estudios del
transcriptoma de A. thaliana de plantas infectadas con CaLCuV se reportó el aumento de
la expresión de genes que participan en la transición entre las fases S/G2 y la inhibición
de la expresión de genes de la transición entre las fases M/G1 del ciclo celular (AscencioIbáñez et al., 2008)
Por otra parte se ha reportado que los begomovirus monopartitas inducen proliferación y
diferenciación celular cuando están asociados a genomas satélites (Alberter et al., 2005;
Idris et al., 2005; Cui et al., 2004). Estudios realizados en plantas de algodón revelaron
17
CAPÍTULO I
que DNA satélite asociado al genoma del virus del enrollamiento de la hoja del algodón de
Multan (CLCuGV) es requerido para el desarrollo de síntomas en las plantas infectadas, la
planta de algodón inoculadas con clonas infectivas de CLCuGV-DNAβ presentaron
hiperplasia en las células del floema, similar a lo reportado en plantas de N. benthamiana
y N. tabacum que fueron infectadas con el Curtovirus BCTV (Idris et al., 2005). Se ha
demostrado que la DNAβ asociado al virus del enrollamiento de la hoja amarilla de tomate
(TYLCCNV) es requerida para la inducción de la enfermedad del enrrollamiento de las
hojas en plantas de tabaco, tomate y petunia, y el gen βC1 del DNAβ es responsable de
la inducción de síntomas en las plantas infectadas(Cui et al., 2004).
Recientemente en nuestro grupo de trabajo se identificó que EuMV-YP, un begomovirus
bipartita, provoca cambios en la expresión de genes que participan en la inducción de la
mitosis en N. benthamiana (Gamboa-Tec et al., 2015). Realizando ensayos de
microscopía se observó que las plantas con síntomas moderados y severos produjeron
hiperplasia en el tejido foliar. Está respuesta es interesante ya que no se espera que esto
ocurra en infecciones con begomovirus bipartitas.
Figura 1.4 Reprogramación del ciclo celular en plantas. Los begomovirus bipartitas reprograman el
ciclo celular del hospedero, induciendo la replicación del genoma sin pasar por la mitosis, en un
proceso conocido como endociclo o endorreduplicación (Tomado de (Hanley-Bowdoin et al., 2013).
18
CAPÍTULO I
1.1.9.
Generalidades de S. lycoperscum
El tomate (S. lycopersicum) es una planta herbácea, originaria de América y cultivada en
todo el mundo para su consumo principalmente gastronómico, pertenece a la familia de
las Solanaceae (Nuez, 1995). Las plantas tienen un tamaño variable según las distintas
variedades, poseen tallos ramificados semileñoso con un grosor mediano que oscila entre
2 a 4 cm en su base, en el que se van desarrollando las hojas, tallos secundarios e
inflorescencias (Lucero-Flores et al., 2012). Las hojas son compuestas e imparipinnadas,
con foliolos peciolados, lobulados, con borde dentado, recubiertos de pelos glandulares y
se disponen de forma alternada sobre el tallo (Lucero-Flores et al., 2012). Las flores son
pequeñas, constan de 5 o más sépalos con igual número de pétalos de color amarillo
dispuestos de forma helicoidal. Las flores se agrupan en inflorescencias en forma de
racimos. El fruto de la planta de tomate puede alcanzar un peso aproximado de 600 g
dependiendo de la variedad. Está constituido por el pericarpio, el tejido placentario y las
semillas (Nuez, 1995).
El genoma completo de la planta de tomate fue secuenciado y reportado por primera vez
en el 2012. Se identificó que el genoma tiene un tamaño de 900 Mb, contiene 12
cromosomas, 35004 genes que codifican para proteínas. Hasta el momento se han
reportado 56 genes que codifican proteínas que pertenecen a la familia de las ciclinas.
El tomate es una planta de interés comercial, además, es el segundo cultivo hortícola más
importante después de la papa. La producción mundial actual es de 100 millones de
toneladas de fruto fresco por 3.7 millones de hectáreas en el mundo (Gennari et al.,
2013). Su producción en el 2008 se distribuyó de la siguiente manera: China fue el
principal país productor (36%), seguido de Estados Unidos (14%), Turquía (12%), y la
India (11%). México ocupó el décimo lugar con una producción del 3% (Lucero-Flores et
al., 2012). En México durante el 2008, se produjeron 2.26 millones de toneladas de
tomate, siendo el estado de Sinaloa el principal productor, seguido de Baja California,
Michoacán, San Luis Potosí y Jalisco (Lucero-Flores et al., 2012).
Las plantaciones de tomate al igual que muchos otros cultivos son vulnerables a diversas
enfermedades ocasionadas por bacterias, hongos y virus. Sin embargo, el tomate es una
planta altamente de interés comercial y susceptible a infecciones virales. Las
19
CAPÍTULO I
enfermedades virales son las que ocasionan mayor pérdida económica entre los cultivos
de importancia comercial, por ejemplo: el Virus del enrollamiento de la hoja amarilla de
tomate (TYLCV) que causa pérdidas devastadoras de hasta el 100% (Fauquet y Stanley,
2005; Picó et al., 1996)
20
CAPÍTULO I
1.2 HIPÓTESIS
El EuMV-YP posee determinantes genéticos que le permiten inducir la proliferación celular
en S. lycopersicum.
1.3 OBJETIVOS
1.3.1.
Objetivo general
Determinar si EuMV-YP se localiza en el mesófilo e induce proliferación celular en S.
lycopersicum.
1.3.2.
•
Objetivos específicos
Determinar si EuMV-YP induce la proliferación celular en los tejidos foliares de S.
lycopersicum.
•
Estudiar si EuMV-YP induce cambios en el nivel de expresión de genes asociados
a la mitosis en el mesófilo de S. lycopersicum.
21
CAPÍTULO I
1.4 JUSTIFICACIÓN
En nuestro grupo de trabajo se encontró recientemente que EuMV-YP induce la
proliferación celular en el mesófilo de N. benthamiana. Este virus posee un amplio rango
de hospederos, incluyendo a plantas de tomate (S. lycopersicum). Se ha reportado hasta
el momento que los begomovirus bipartitas inducen el endociclo, no la mitosis, por lo
tanto, EuMV-YP debe tener características genéticas únicas que le permiten llevar a cabo
este proceso. Por otro lado, se ha encontrado que el tropismo de los diferentes aislados
de EuMV es dependiente del hospedero, por lo tanto es necesario determinar si EuMV-YP
es capaz de inducir la división celular en el mesófilo de otros hospederos, como S.
lycopersicum. En virtud de que los begomovirus bipartitas inducen el endociclo en las
plantas mediante un mecanismo de activación transcripcional de la expresión de genes
del ciclo celular en las plantas infectadas, es necesario identificar si EuMV-YP utiliza este
mismo mecanismo para inducir la expresión de genes asociados a la mitosis en S.
lycopersicum.
22
CAPÍTULO I
1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
La estrategia experimental consiste en dos puntos que se resumen en la siguiente
imagen.
Figura 1.5 Estrategia experimental de acuerdo a los objetivos del proyecto.
23
CAPÍTULO I
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26
CAPÍTULO II
CAPITULO II
EFECTO CITOPÁTICO CAUSADO POR EL VIRUS DEL MOSAICO DE LA
EUPHORBIA AISLADO DE LA PENÍNSULA DE YUCATÁN EN PLANTAS DE
Solanum lycopersicum
2.1 INTRODUCCIÓN
Los begomovirus como grupo infectan a una amplia variedad de cultivos de importancia
económica como: algodón, frijol, chile y tomate entre otros, así como a especies silvestres
(Hernández-Zepeda et al., 2007).
La respuesta de las plantas a las infecciones se manifiesta por el desarrollo de síntomas
característicos de una particular combinación de virus-hospedero. Estudios anteriores han
reportado diversos síntomas ocasionados por los begomovirus como son: retraso del
crecimiento que puede conducir a enanismo, clorosis, mosaicos amarillos, abultamientos
y enrollamientos en las hojas y otras anormalidades en los tejidos (Brown et al., 2002).
Los cambios en la morfología celular causada por infección viral se denominan efecto
citopático (Baron et al., 1996). Existen diversos tipos de efectos citopáticos, en algunos
tejidos enfermos aparecen estructuras intracelulares llamadas cuerpos de inclusión en el
núcleo o citoplasma de la célula infectada (Baron et al., 1996). Un efecto citopático
particularmente característico de algunas infecciones virales es la formación de sincitios o
policariocitos; que son grandes masas citoplasmáticas que contienen muchos núcleos y
por lo general se producen por la fusión de células infectadas (Baron et al., 1996). Las
infecciones por geminivirus tienen como resultado alteraciones en las células, organelos
celulares, y la aparición de estructuras celulares asociadas al virus en las plantas
enfermas (Stanley et al., 2001), también se ha reportado en varios estudios que los
geminivirus regulan el ciclo celular de las células que infectan, lo cual conduce a una
progresión anormal a través de la fase-S (Stanley et al., 2001; Gutierrez, 2000). En
algunos casos, el efecto citopático está asociado a cambios morfológicos tales como
abultamientos o ampollas en las hojas, conocidas como enaciones, enchinamiento de la
hoja e hiperplasia, estos síntomas están directamente relacionados al ciclo celular
27
CAPÍTULO II
anormal (Hanley-Bowdoin et al., 2013; Gutierrez, 2000). Las enaciones son pequeños
tumores que se presentan en el limbo de las hojas infectadas por virus, en algunos
géneros como es el caso de los Curtovirus, por ejemplo: la infección del Virus del rizado
apical de la remolacha (BCTV) donde se han observado estas alteraciones (Park et al.,
2004). En plantas de A. thaliana infectadas con Curtovirus BCTV, se observó la presencia
de hiperplasia en células del floema y el aumento de los transcritos de genes marcadores
de la mitosis (Park et al., 2004).
Recientemente, se ha caracterizado a la proteína C4 como la responsable de la severidad
de síntomas en plantas infectadas por Curtovirus (Hanley-Bowdoin et al., 2013). Estudios
realizados en plantas transgénicas de A. thaliana y N. benthamiana, indican que la
proteína C4 del BCTV y el Virus del rizado apical severo de la remolacha (BSTV) tiene un
efecto directo en la inducción de la división celular anormal cuando expresan esta
proteína. Por otra parte se identificó que la proteína C2 del BCTV actúa como un reactivador del ciclo celular de las células infectadas y proporciona un entorno favorable
para la replicación de geminivirus. Cuando se expresó la proteína C2 en plantas de A.
thaliana, se observó el aumento de genes de reentrada del ciclo celular, estos resultados
sugirieron que C2 actúa como proteína promotora de la activación del ciclo celular, sin
embargo, esto no ocurrió en la infección de A. thaliana con begomovirus monopartita.
Estudios del transcriptoma de A. thaliana infectadas con CaLCuV indican que los
begomovirus bloquean la fase mitótica e inducen la endorreduplicación activando el ciclo
celular de las células que infectan. Por otra parte, se ha reportado que los begomovirus
monopartitas, cuando están asociados a genomas satélites de ADN inducen la
proliferación y diferenciación celular, produciendo una nueva hoja pequeña que sale de la
nervadura central de las hojas de plantas infectadas (Cui, 2004; Idris, 2005). Estudios
recientes en plantas de N. benthamiana infectadas con begomovirus bipartitas EuMV-YP,
se observó la presencia de hiperplasia en células del mesófilo y el aumento de la
expresión de genes marcadores de la mitosis (Gamboa-Tec et al., 2015), sin embargo se
desconoce si esta respuesta es dependiente del hospedero, esto es particularmente
importante de determinar en virtud de que N. benthamiana es hipersusceptible a infección
por virus (Goodin et al., 2008), por tanto los efectos observados en esta planta pudiesen
ser un reflejo del hospedero y no del virus. Para saber si EuMV-YP es capaz de inducir la
mitosis en otro hospedero se estudiaron los efectos de la infección del EuMV-YP en
28
CAPÍTULO II
plantas de S. lycopersicum variedad Saladette. En este capítulo se describe la correlación
entre la severidad de síntomas y el efecto citopático observado, particularmente en la
inducción de la proliferación celular.
29
CAPÍTULO II
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1 Material vegetal
Se utilizaron semillas de tomate (S. lycopersicum) de la variedad Saladette. Las semillas
fueron desinfectadas utilizando etanol al 70 % y cloro comercial al 30 %. Las semillas
desinfectadas fueron germinadas in vitro en cajas magenta utilizando medio MS
(Murashige & Skoog) suplementado con 30 g de sacarosa y vitaminas.
Las plantas se inocularon una vez que presentaron dos pares de hojas verdaderas, es
decir alrededor de 15 días después de la germinación. Las plantas se mantuvieron a 25
°C + 3 bajo condiciones de fotoperiodo de 16/8 horas-luz/oscuridad en el cuarto de
crecimiento del laboratorio.
2.2.2. Inoculación de plantas
La inoculación de las plantas se realizó mediante biobalística a alta presión (1100 psi)
empleando una cámara Bio-Rad conectada a un tanque de helio. Para ello se prepararon
partículas de oro marca Bio-Rad de 0.6 μm. El EuMV-YP fue inoculado utilizando 1 μg de
ADN de las clonas infectivas de cada genoma viral (ADN-A y ADN-B) en forma de
hemidímeros clonados en pBluescribell SK+ (Villanueva-Alonzo et al., 2013). Se
inocularon un total de 20 plantas con EuMV-YP. Como testigo negativo se utilizó el vector
vacío, inoculando 10 plantas para diferenciar los posibles efectos ocasionados por el daño
mecánico causado por el bombardeo, las plantas inoculadas se mantuvieron in vitro en el
cuarto de crecimiento hasta el momento de su análisis.
2.2.3 Seguimiento de síntomas y colecta de material vegetal
Se realizó un seguimiento de los síntomas en las plantas inoculadas, los cuales fueron
clasificados de acuerdo al grado se severidad, como: asintomáticos, atenuados,
moderados y severos. La descripción de los síntomas se resume en el cuadro 2.1. Este
seguimiento visual fue acompañado de un registro fotográfico a los 7, 14 y 21 ddi. Al
mismo tiempo se colectaron las hojas número 9 y 10 de cada planta a los 14 ddi,
enumerándolas a partir de la primera hoja verdadera.
30
CAPÍTULO II
Cuadro 2.1 Severidad de síntomas de S. lycopersicum (Gamboa-Tec et al.,
2015).
Características
Descripción
Asintomáticas (As)
Sin síntomas
Atenuada (A)
Moderada (M)
Mosaicos cloróticos
Torsión del margen de la hoja, mosaicos
cloróticos, enrollamiento foliar.
Torsión del margen de la hoja, mosaicos
Severa (S)
cloróticos, enrollamiento foliar hacia el
envés y retraso de crecimiento
2.2.4 Cortes histológicos
Los tejidos foliares colectados se fijaron en solución FAA (10 % formaldehído, 5 % ácido
acético, 50 % etanol absoluto) por 72 h a 4 °C. Se removió el fijador y las muestras se
deshidrataron a 4 °C tratándolas por tres horas bajo concentraciones crecientes de etanol
(30, 50, 70, 80, 90 %), seguido de 3 cambios en etanol absoluto de 3 horas cada uno.
Después del tiempo de deshidratación las muestras se empaparon en una mezcla de
butanol al 100 % y parafina, se incubaron a temperatura ambiente por un tiempo de 48 h,
transcurrido ese tiempo se incubaron a 60 °C haciendo 6 cambios con parafina líquida
cada tres horas. Las muestras se colocaron en moldes de aluminio calentados
previamente a 60 °C, se le adicionó más parafina y se cubrieron con soportes de plástico.
Los moldes se dejaron secar por 4 horas a temperatura ambiente; después de las cuatro
horas se eliminó el soporte de aluminio.
Se realizaron cortes transversales a un grosor de 5 µm de la región media de la hoja de la
planta que presentaron síntomas moderados y severos, así como de las que fueron
inoculadas con el vector vacío (testigo negativo). Para ello se emplearon cuchillas de bajo
31
CAPÍTULO II
perfil (Thermo Scientific, 1407060) y un micrótomo (modelo HE340E). Los cortes
histológicos se colocaron en baño maría con agua a 50 °C para permitir la extensión del
corte y luego se colocaron en un portaobjetos, se dejaron secar, incubando a 37 °C por 3
h y luego se mantuvieron a 4 °C hasta su desparafinación.
Para retirar la parafina, las laminillas se incubaron a 65 °C por 15 min, después se
realizaron tres incubaciones en xileno por 10 min, y una, por 30 min a temperatura
ambiente, finalmente se realizó la rehidratación utilizando concentraciones decrecientes
de etanol (100, 96, 80, 50 y 30 %) por 5 min.
2.2.5 Tinción con azul de toluidina
Se realizó la tinción mediante inmersión en una solución de 2.5 mg/mL de azul de
toluidina durante 10 s. El exceso de colorante se retiró incubando por 10 s con agua
desionizada seguido por un lavado con etanol (100 % por 30 s) y finalmente uno con agua
(por 10 s).
2.2.6 Captura de imágenes y análisis de medición
Utilizando toda la longitud del corte transversal de la hoja, se seleccionaron cuatro
regiones para realizar las mediciones del grosor de la lámina foliar y las dimensiones de la
nervadura central (Figura 2.1). Para realizar el registro de las imágenes se tomaron varias
fotografías con el fin de cubrir el corte transversal completo de cada planta estudiada
(Figura 2.1). Las imágenes se capturaron utilizando una cámara INFINITY acoplada a un
microscopio estereoscopio NIKON modelo ECLIPSE utilizando el objetivo 4X para
seleccionar los portaobjetos y luego analizar las regiones de interés de los cortes,
posteriormente se utilizó el microscopio estereoscopio NIKON modelo ECLIPSE E200
utilizando el objetivo 5X, el cual fue previamente calibrado utilizando una regla milimétrica.
Para el grosor de la lámina foliar se midieron cuatro puntos del corte transversal,
incluyendo tanto regiones cercanas a las nervaduras centrales como hacia las regiones
proximales al margen de la hoja. De igual forma se contó el número de células por µm2 en
cuatro puntos de la lámina foliar (Figura 2.1) utilizando el software INFINITY ANALYSIS
versión 5.0.3 (Lumera corporation) disponible en línea.
32
CAPÍTULO II
Figura 2.1 Ejemplo del corte transversal de una hoja sana de S. lycopersicum, armado a partir de
varias fotografías. Las líneas punteadas indican las inserciones de las fotos, las flechas indican las
regiones seleccionadas para las mediciones del grosor de la lámina foliar y de la nervadura central.
NC; nervadura central, EL; fragmentos laterales, CB; regiones más cercanas a los márgenes de la
lámina foliar. Imágenes capturadas con objetivo 4X.
33
CAPÍTULO II
2.3 RESULTADOS
2.3.1 Síntomas evaluados en plantas inoculadas con EuMV-YP
Se inocularon 20 plantas de tomate variedad Saladette con EuMV-YP y 10 con el vector
vacío como testigo negativo
A partir de los siete días después de la inoculación se observaron síntomas atenuados,
moderados y severos de acuerdo a lo reportado previamente (Gamboa-Tec et al., 2015).
En este trabajo de tesis se obtuvieron en total dos plantas asintomáticas, siete con
síntomas atenuados, cinco con síntomas moderados y seis con síntomas severos (Cuadro
2.3).
Cuadro 2.2 Resultado de la severidad de síntomas observados en plantas inoculadas
con EuMV-YP a los 21 ddi.
Se evaluó la proporción y el porcentaje de infección observado y los resultados se
34
CAPÍTULO II
presentan en el Cuadro 2.3. La mayor severidad de síntomas de EuMV-YP se presentó a
los 14 ddi, obteniéndose cinco plantas con infección severa de las 20 plantas inoculadas.
Entre los síntomas observados en las plantas con infección severa fueron: mosaicos
cloróticos en las hojas, enrollamiento y torsión del margen de la hoja y retraso del
crecimiento. Posteriormente se observó una reducción en la severidad de síntomas a los
21 ddi ya que solo una planta presentó síntomas severos. No fue necesario evaluar el
porcentaje de severidad a los 7 ddi ya que la mayoría de las plantas eran asintomáticas o
con síntomas atenuados.
Cuadro 2.3 Síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum. As;
Asintomáticas, A: Atenuadas, M: Moderadas, S: severas, ddi: días después de la
infección.
La infección viral se monitoreó hasta los 21 ddi, las plantas asintomáticas y las que
presentaron síntomas atenuados a los 7 ddi, incrementaron su severidad a los 14 y 21
ddi. Entre los síntomas identificados en las plantas inoculadas con EuMV-YP se pudieron
observar: mosaicos en el plano de la hoja, deformación en los márgenes de las hojas,
enrollamiento hacia el envés de la hoja (figura 2.2), tal como fue reportado anteriormente
(Gamboa-Tec et al., 2015).
35
CAPÍTULO II
Figura 2.2 Ejemplo de síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum
cultivadas bajo condiciones in vitro. Planta sana número N-1 (A-C). Planta con síntomas severos
número N-6 (D-F)
Las plantas que presentaron síntomas severos como mosaicos en el plano de la hoja,
deformación en los márgenes de las hojas, enrollamiento hacia el envés de la hoja,
abultamientos (enaciones) en las hojas, también se pudo observar que presentaron
alteraciones en el desarrollo de la planta, como el retraso de crecimiento (internodos
cortos) (Figura 2.3). La planta SEVERA-7 mostró un enrollamiento completo en el borde
de las hojas (Figura 2.3 B) a diferencia de la planta SEVERA-1 y SEVERA-5 (Figura 2.3
C-D). El mayor grado de severidad de síntomas se observó a los 21 ddi.
36
CAPÍTULO II
Figura 2.3 Retraso del crecimiento en S. lycopersicum ocasionado por EuMV-YP. Las plantas con
síntomas severos de EuMV-YP a los 21 ddi mostraron deformaciones de los peciolos y reducción de
los internodos. Planta sana (A), diferentes plantas con síntomas severos (B-D): (B) SEVERA-7, (C)
SEVERA-1, (D) SEVERA-5.
2.3.2 Alteraciones producidas por EuMV-YP
Para identificar los posibles efectos en la arquitectura tisular, es decir, cambios
anatómicos ocasionados por EuMV-YP en las plantas de S. lycopersicum se compararon
reconstrucciones de cortes histológicos completos de plantas que presentaban síntomas
moderados y severos a los 14 ddi (tres plantas para cada caso) con las plantas testigo
(Figura 2.4). Se observaron cambios en la forma, tamaño y organización celular. En la
planta seis, que presentó síntomas severos, se observó una nervadura lateral muy cerca
a la nervadura central, sin embargo, no se lograron observar las demás nervaduras
laterales (Figura 2.4 B); por el contrario, en la planta sana, se observan adecuadamente
las estructuras de las nervaduras laterales (Figura 2.4 A). Otras plantas con síntomas
severos presentaron cambios en la epidermis inferior y engrosamiento en las regiones
cercanas al borde de hoja (Figura 2.4 C).
37
CAPÍTULO II
Figura 2.4 Reconstrucción de cortes transversales de hojas de S. lycopersicum inoculadas con
EuMV-YP. Planta sana (A), planta con síntomas severos (B-C). los número y las líneas indican
la inserción de las fotos para la reconstrucción del corte. Imágenes capturadas con objetivo 4x.
2.3.3. Distorsiones en las nervaduras
Uno de los efectos más notorios observados fue un mayor desarrollo en las nervaduras
centrales de las plantas que presentaron síntomas moderados y severos (Figura 2.5),
también se observaron cambios en la forma, tamaño y número de células en las plantas
con infección severa. La planta SEVERA-1 mostró hipertrofia en las células del mesófilo
provocando un alargamiento en el área vascular (Figura 2.5 F), a diferencia de la
38
CAPÍTULO II
SEVERA-7 donde se observó hiperplasia en las células del haz vascular y deformación en
las células de parénquima en empalizada (Figura 2.5 E). Las plantas SEVERA-5 y
SEVERA-6 presentaron engrosamiento en la parte lateral de la nervadura (Figura 2.4 B).
Las plantas con síntomas moderados, no presentaron daños significativos, sin embargo,
se pudo observar un incremento en el tamaño de las células de mesófilo (Figura 2.5 C-D)
comparado con el de la planta sana (Figura 2.5 A-B).
Figura 2.5 Alteraciones en la nervadura foliar causada por EuMV-YP en S.lycopersicum. Sección de
nervaduras centrales, plantas sanas (A-B), nervaduras con síntomas de infección moderada (C-D),
nervadura central de plantas con infección severa con alteraciones en el tamaño y forma de las
células (E-F). Imágenes capturadas con objetivo 5X. Barra de medición de 100 µm.
39
CAPÍTULO II
Utilizando el software INFINITY ANALYSIS, se midió la longitud (grosor y altura) de las
nervaduras centrales de las hojas de plantas con síntomas moderados y severos,
comparando con la planta sana. Las plantas con síntomas moderados presentaron un
tamaño similar a la nervadura central de las hojas de plantas sanas, sin embargo, cuando
se analizaron las nervaduras de las hojas de plantas con síntomas severos se observó un
incremento notorio en comparación con la planta sana (Cuadro 2.4) .
Cuadro 2.4 Tamaño de la nervadura central de las plantas inoculadas con EuMV-YP.
Las alteraciones en las nervaduras también se observaron en las nervaduras laterales de
plantas con síntomas moderados y severos. Las nervaduras laterales de las plantas con
síntomas severos mostraron alteraciones morfológicas en el área vascular, ocasionando
deformación de la nervadura (Figura 2.6 E-F), comparada con las hojas de plantas sanas
(Figura 2.6 A-B). En la nervadura lateral de la hoja de la planta SEVERA-1 (Figura 2.6 F)
se observó un incremento en el tamaño de las células del mesófilo, y este mismo fenotipo
40
CAPÍTULO II
se observó en la nervadura central (Figura 2.5 F). En el extremo izquierdo de la nervadura
lateral de la hoja de la planta SEVERA-7 se observó la presencia de hiperplasia y cambios
morfológicos en las células del parénquima en empalizada, también se observó un cambio
dramático en la forma y tamaño de las células del parénquima esponjoso. La presencia de
hiperplasia en las células del parénquima en empalizada dificultó la observación del área
vascular; también se observaron cambios en las células de la parte abaxial de la hoja, que
posiblemente corresponden a la epidermis, sin embargo su forma está tan alterada que es
difícil de aseverarlo (Figura 2.6 E). En las nervaduras laterales de las hojas de las plantas
MODERADAS 4 y 12 se observaron cambios en las forma, tamaño y disposición de las
células del parénquima en empalizada (Figura 2.6 C-D) e hipertrofia en las células del
colénquima (Figura 2.6 C).
Figura 2.6 Alteraciones en las nervaduras laterales de las hojas de S. lycopersicum inoculadas
con EuMV-YP. Nervadura lateral planta sana (A-B), nervadura lateral planta con síntomas
moderados (C-D), nervaduras laterales de plantas con síntomas severos (E-F). Imágenes
capturadas con objetivo 5X. Barra de medición 100 μm.
41
CAPÍTULO II
2.3.4 Alteraciones en la región proximal al margen de la hoja e hiperplasia
Las alteraciones en la estructura tisular también se observaron en las regiones proximales
al margen de la hoja de las plantas con infección severa (Figura 2.7). En la región
proximal al margen de la hoja de la planta SEVERA-1 (Figura 2.7 B) se observó un
incremento en las células del parénquima empalizada en comparación con la sana, en la
cual dicha organización está formada de una capa simple de células epidérmicas en cada
extremo de la lámina foliar, una capa anticlinal de células del parénquima empalizada y de
4 a 5 capas de células poco uniformes (células alargadas y redondas) que conforman el
parénquima esponjoso (Figura 2.7 A). La región proximal al margen de la hoja de la planta
SEVERA-6 presentó hiperplasia (Figura 2.7 C), y en la región proximal al margen de la
hoja de la planta SEVERA-7 se observaron cambios en la forma de la célula del
parénquima empalizada y deformación en la epidermis inferior de la hoja (Figura 2.7 D).
La región proximal al margen de la hoja de las plantas con síntomas moderados no
presentó cambios observables en su estructura y arquitectura tisular.
Figura 2.7 Alteraciones del EuMV-YP en la región próxima al margen de la hoja en S.
lycopersicum. Alteraciones morfológicas en las células de las plantas con síntomas severos. La
región proximal al margen de la hoja de las plantas con síntomas severos (B-D), comparados con
las de una planta sana (A). Imagen capturada al objetivo 5x. Barra de medición 100 µm.
De acuerdo a los resultados de las mediciones del grosor de la lámina foliar, las plantas
sanas presentaron un grosor uniforme, en contraste al de las plantas con síntomas
moderados y severos, de la cuales las plantas con síntomas severos presentaron un
mayor incremento de dichas láminas foliares. Al realizar un análisis estadístico t Student
de las dimensiones del grosor de la lámina foliar de plantas sanas comparado con el de
las plantas que presentaron síntomas severos se puede concluir que estas diferencias
son significativas [P (T<=t) = 0.009290] (cuadro 2.5).
42
CAPÍTULO II
Cuadro 2.5 Análisis estadístico de las mediciones del grosor de la lámina foliar en S.
lycopersicum, plantas sanas y plantas inoculadas con EuMV-YP.
Columna 1
Media
Varianza
Observaciones
P(T<=t) dos colas
Valor crítico de t (dos colas)
SANA
99.1667
97.4242
12.0000
0.009290
2.2010
SEVERA
123.333333
405.151515
12
En el mesófilo de dos de las seis plantas con infección severa se observó proliferación
celular (hiperplasia), a diferencia de las plantas sanas que mostraron un número y tamaño
normal de células (Cuadro 2.6). Se cuantificó el número de células en dos regiones
afectadas y en dos de aspecto normal, tanto en tres plantas sanas como en las dos que
presentaron hiperplasia. La planta SEVERA-5 presentó hiperplasia en el parénquima en
empalizada (Figura 2.8-B). La SEVERA-7 presento hiperplasia tanto en el parénquima en
empalizada como en el esponjoso (Figura 2.7-C), y mayor proliferación celular (Cuadro
2.7); también presentaron distorsiones en la parte abaxial, en lo que parecen ser células
de la epidermis inferior, pero también es posible que se deba a la proliferación celular en
el colénquima o parénquima esponjoso (Figura 2.7).
Figura 2.8 Cambios en la arquitectura tisular e hiperplasia en S. lycopersicum inducidos por la
inoculación con EuMV-YP. Sección transversal de hoja sana (A) con síntomas virales severos (B-C).
Mesófilo de plantas sanas (A), mesófilo con desorden celular en el parénquima empalizada (B) y en el
parénquima esponjoso (C). Imágenes capturadas al objetivo 5X. MP; parénquima en empalizada, ME;
parénquima esponjoso, ES; epidermis superior, EI; epidermis inferior. Barra de medición 100 μm.
43
CAPÍTULO II
Cuadro 2.6 Número de células por micrómetro cuadrado en el mesófilo de plantas de
tomate inoculadas con EuMV-YP.
-; Región normal +; Región con alteración moderada ++; Región con alteración severa
44
CAPÍTULO II
2.4. DISCUSIÓN
En este trabajo se observó que EuMV-YP produce alteraciones en las nervaduras
centrales de las hojas de plantas con síntomas severos, aumentando el tamaño de la
nervadura, también se observaron cambios en las células del mesófilo como hiperplasia e
hipertrofia. En estudios anteriores se había reportado que el EuMV-YP ocasionaba
alteraciones en la nervadura central en plantas de N. benthamiana, los efectos
observados fueron: distorsiones en nervaduras de plantas con síntomas moderados y
severos, reducción del haz vascular, disminución del número de células del colénquima y
células epidérmicas de mayor tamaño. Los síntomas observados en este trabajo son
similares a los reportados en N. benthamiana, sin embargo, en las plantas de N.
benthamiana se observó mayor severidad (Gamboa-Tec et al., 2015).
El EuMV-YP ocasionó hiperplasia en las células del mesófilo de S. lycopersicum, lo cual
resulta interesante ya que este síntoma no se había observado anteriormente en plantas
infectadas con geminivirus bipartitas. Sin embargo, se ha visto que tanto los Curtovirus
como Begomovirus bipartitas pertenecientes a la familia Geminiviridae son capaces de
reprogramar el ciclo celular completo, es decir inducir la mitosis y producir hiperplasia
(Hanley-Bowdoin et al., 2013). La hiperplasia inducida por geminivirus se reportó por
primera vez en plantas de Beta vulgaris infectadas con
el BCTV, un geminivirus
perteneciente al género Curtovirus (Park et al., 2004). EuMV-YP es un virus de ADN que
requiere división celular activa para tener disponibles los elementos necesarios para
poder replicarse, por lo que posiblemente presente algún mecanismo que induzca la
hiperplasia. Se ha demostrado que la proteína viral C4 de los curtovirus está involucrada
en la inducción de la hiperplasia, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis y N.
benthamiana que sobre expresaban la proteína C4 de BCTV, en las cuales se observó
hiperplasia y enaciones (ampollas) características de las plantas infectadas con BCTV
(Latham et al., 1997).También la proteína C2 de este virus influye en la inducción de la
expresión de genes del ciclo celular que conducen a la replicación del ADN viral (LozanoDuran et al., 2012). Sin embargo, estas proteínas son filogenéticamente distintas de las
ortólogas en los begomovirus bipartitas (Fondong, 2013).
45
CAPÍTULO II
Previamente se observó que las plantas de N. benthamiana infectadas con EuMV-YP con
síntomas moderados y severos presentaron hiperplasia en el tejido foliar (Gamboa-Tec et
al., 2015). En el presente trabajo de un total de 20 plantas de S. lycopersicum inoculadas
con EuMV-YP, seis presentaron infección severa a los 21 ddi, de las cuales únicamente
dos presentaron hiperplasia. Ninguna de las plantas con síntomas moderados presentó
este mismo fenotipo. El grado de hiperplasia observada en plantas de S. lycopersicum fue
del 30% en comparación con N. benthamiana que fue del 50 %, en donde se pudo
observar hiperplasia en plantas que presentaron síntomas moderados y severos
(Gamboa-Tec et al., 2015). Esta diferencia pudiese deberse a que N. benthamiana tiene
mayor susceptibilidad a infecciones virales.
Por otra parte, con base en el análisis estadístico se observaron diferencias significativas
en las mediciones del grosor en las láminas foliares de las plantas sanas con respecto a
las plantas con síntomas severos. Igual que en N. benthamiana, en S. lycopersicum la
hiperplasia se presentó en regiones discretas y no en toda la longitud del corte de la
lámina foliar (Gamboa-Tec et al., 2015). Sin embargo la proporción observada, tanto de
plantas moderadas como de plantas severas con hiperplasia fue menor para el caso de S.
lycopersicum. Mientras que en N. benthamiana si se encontraron plantas con síntomas
moderados que presentaron hiperplasia, esto no se observó en S. lycopersicum.
Con base en estos resultados, se pudiera considerar que la inducción de la proliferación
celular por EuMV-YP está determinada por componentes genéticos del virus, ya que este
fenotipo ha sido observado en dos especies diferentes de plantas (N. benthamiana y S.
lycopersicum). Es probable que EuMV-YP induzca la división celular empleando
mecanismos moleculares similares a los de los Curtovirus, por ejemplo BCTV.
46
CAPÍTULO II
BIBLIOGRAFÍA
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gene silencing vector based on Euphorbia mosaic virus-Yucatan peninsula for
NPR1 silencing in Nicotiana benthamiana and Capsicum annuum var. Anaheim.
Biotechnology letters, 35, 811-823.
48
CAPÍTULO III
CAPÍTULO III
EuMV-YP INDUCE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS A LA MITOSIS EN
S. lycopersicum
3.1 INTRODUCCIÓN
El ciclo celular eucariota es controlado por la acción ordenada de un complejo de
proteínas compuestas de una subunidad catalítica denominada cinasa dependiente de
ciclina (CDK) y elementos reguladores positivos nombrados ciclinas. La asociación de
cierta CDK con una ciclina, determina la actividad del complejo, su estabilidad,
localización y especificidad de sustrato (Renaudin et al., 1996).
Las proteínas de los geminivirus propician un ambiente celular favorable para la
replicación del ADN utilizando la maquinaria de la célula que infectan, para ello
reprograman la entrada al ciclo celular de la células diferenciadas que infectan (HanleyBowdoin et al., 2013; Gutierrez, 2000). Los miembros de los géneros Begomovirus y
Mastrevirus inducen la reentrada al ciclo celular, activando la fase de síntesis (S) pero en
vez de continuar con la mitosis, las células entran a un estado de endociclo, mientras que
los pertenecientes al género Curtovirus inducen el ciclo celular completo, es decir
concluyen la mitosis (Hanley-Bowdoin et al., 2013; Fondong, 2013).
En las plantas de A. thaliana infectadas por BCTV y BSTV, que son especies del género
Curtovirus, se observó el aumento de los transcritos de genes marcadores de la mitosis
(CDK1) y la presencia de hiperplasia (Park et al., 2004). Por otra parte se encontró que la
infección con el virus del enrollamiento foliar de la col (CaLCuV) especie del género
begomovirus, causó el aumento de la expresión de los transcritos de los genes de la fase
S/G2 y la inhibición de transcritos involucrados en la fase M/G1 del ciclo celular.
Resultados similares se observaron en este mismo hospedero infectado con Virus
sudafricano del mosaico de la Yuca (SACMV) otro virus perteneciente al género
begomovirus (Pierce y Rey, 2013). Estos y otros resultados indican que los begomovirus
bipartitas bloquean la fase mitótica e inducen la endorreduplicación de las células
infectadas. Sin embargo, en estudios recientes de nuestro grupo de trabajo se observó
49
CAPÍTULO III
que el begomovirus bipartita EuMV-YP, induce la expresión de los transcritos de genes
que codifican proteínas involucradas en la mitosis, tales como CYCA1, CYCA2 y CDKB2
a los 15 y 21 ddi en plantas de N. benthamiana (Gamboa-Tec et al., 2015).
En este capítulo se describen los resultados de la investigación tendientes a elucidar si
EuMV-YP es capaz de inducir la expresión de los genes tales como: CDKB1 y CDBK2,
que son considerados marcadores de la mitosis en plantas de S. lycopersicum, así como
del gen PCNA. Estos resultados constituyen un complemento importante al hallazgo de la
inducción de la proliferación celular en plantas de tomate que se presentan en el capítulo
II.
50
CAPÍTULO III
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1 Material vegetal
Se colectaron las hojas verdadera #9 y 10 de plantas de S. lycopersicum inoculadas con
EuMV-YP a los 14 ddi, así como de plantas inoculadas con el vector vacío, tal como se
describió en el capítulo anterior.
Se pesaron 100 mg de tejido foliar de tres plantas que presentaron síntomas moderados,
tres con síntomas severos, así como de tres plantas sanas, este material se envolvió en
papel aluminio, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C
hasta su uso.
3.2.2 Extracción de ARN de tejido foliar de S. lycopersicum.
Para la extracción ARN total se utilizó tejido foliar congelado, se realizó un pool de 3
plantas sanas, 3 con síntomas moderados y 3 plantas con síntomas severos. Se
pulverizaron 100 mg de tejido con nitrógeno líquido en un mortero, el macerado fue
depositado en un tubo de microcentrífuga. La extracción de ARN se realizó utilizando un
estuche comercial (RNeasy plant mini kit, QIAGEN) siguiendo las recomendaciones del
fabricante, e incluyendo un tratamiento con 10 U de DNAsa I (Invitrogen), la pastilla se
resuspendió en 25 µL con agua desionizada estéril.
El ARN total obtenido se cuantificó en un espectrofotómetro tipo Nanodrop (Thermo
Scientific, modelo 2000C) y mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % teñido con
GelRed (Biotium). Se distribuyó en 5 alícuotas de 5 µL y se almacenó en congelación a 80 °C hasta su uso.
3.2.3 RT-PCR
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó a partir de 250 ng de ARN total con
0.5 µL de oligo DT, 4 µL de una mezcla de dNTPs a una concentración de 10 mM en un
volumen total de reacción de 16 µL. Una vez realizada la mezcla de reacción se incubaron
a 70 °C por 5 minutos para la desnaturalización, posteriormente se colocó en hielo por 1
minuto. Se añadió la segunda mezcla de reacción que contenía 200 U de transcriptasa
reversa, 2 µL de amortiguador RT 10X, 2 U de inhibidor de RNAsa (New England
51
CAPÍTULO III
BioLabs), la mezcla de reacción se llevó a un volumen de 20 µL. Se realizó una
incubación por 1 hora a 42 °C y 5 minutos a 80 °C. Una vez concluida esta incubación la
reacción se ajustó a un volumen de 50 µL. El ADNc obtenido se almacenó a -20 °C.
Para la síntesis de la segunda cadena de ADNc se utilizaron los cebadores específicos
previamente reportados para los genes CDKB1 y CDKB2 de tomate (Joubés et al., 2001),
como testigo se utilizaron cebadores para los genes PCNA (Pasumarthy et al., 2011) y
Actina de tomate (Correa-Aragunde et al., 2006) (Cuadro 3.1). Se preparó la mezcla de
reacción de PCR con los siguientes componentes; 20 pmoles de cada cebador, 0.2 mM
de mezcla de dNTPs, 2.5 µL de amortiguador thermopol 10X, 1.25 U de Taq DNA
polimerasa y 2 µL de la primera cadena de ADNc, la mezcla de reacción se llevó a un
volumen final de 25 µL.
Cuadro 3.1 Secuencia de cebadores para el análisis de expresión genética.
GEN
SECUENCIA
5’GCTAAACCAATCAATCAAGCTT3’
CDKB1
5’CTATGGCAGTGAGCAACCC3’
5’GGAGGCTGCTAAAAATGCTG3’
CDKB2
5’GTATAAGCTCTGCCAAGTCC3’
5´GTTCTAGAATCGATTAAGGATC3’
PCNA
5’CCATTAGCTTCATCTCAAAATC3’
5’AAGAGCTATGAGCTCCCAGA3’
Actina
5’TAATCTTCATGCTGCTAGGAG3’
52
CAPÍTULO III
Se realizaron las amplificaciones del ADNc utilizando diferentes condiciones de
temperatura. El programa de la reacción de PCR para analizar la expresión del gen que
codifica a la actina constó de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos,
alineamiento a 57 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 25 segundos. Para el gen
CDKB1 se utilizó 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a
54 por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos. Para el gen CDKB2 se utilizó
30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a 56 °C por 30
segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos. Para el gen PCNA se utilizó 30 ciclos de
desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a 57 °C por 30 segundos y
extensión a 72 °C por 30 segundos.
El ADN obtenido se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se corrió a 60
volts por 50 minutos.
53
CAPÍTULO III
3.3 RESULTADOS
3.3.1 Extracción de ARN Total
Se extrajo ARN total de las muestras colectadas a los 14 ddi y se midió la absorbancia a
260/280 nanómetros para medir la concentración y pureza del ARN obtenido (Cuadro
3.3).
Cuadro 3.2 Cuantificación del ARN total obtenido
Muestra
Concentración
Absorbancia
[ng/μL]
260/280
Sana
134.9
2.16
Moderada
55.2
2.17
Severa
1524.9
2.12
Las extracciones se encontraron en el rango óptimo de pureza y se obtuvo un patrón
similar en todos los ARN obtenidos, con la salvedad de que en el ARN de las plantas con
síntomas moderados se obtuvo menor concentración (Cuadro 3.3). Para verificar la
integridad del ARN total aislado se corrió un gel de agarosa (Figura 3.1) donde se observa
que en las plantas con síntomas severos presentaron una ligera degradación comparado
con las plantas sanas y las plantas con síntomas moderados.
54
CAPÍTULO III
Figura 3.1 Muestras de ARN total de los explantes foliares de S. lycopersicum de plantas sanas,
con síntomas moderados y severos a los 14 ddi. Gel agarosa 1 %, 80 volts/40 min. SA; Planta
sana, M; Planta con síntomas moderada, S; planta con síntomas severos.
3.3.2 Perfiles de expresión para los genes CDKB1, CDKB2, PCNA y Actina
Para comprobar si EuMV-YP provoca cambios en la expresión de los genes que regulan
la entrada a la mitosis y por tanto pudieran tener una relación con la hiperplasia
observada en el capítulo anterior, se realizó el perfil de expresión de dos genes
marcadores de la mitosis: CDKB1 y CDKB2 (Joubés et al., 2001). Como resultado se
observó el aumento en la expresión de ambos genes en las plantas con síntomas
moderados y severos en comparación con la expresión en plantas sanas, en las cuales se
obtuvo una expresión basal apenas detectable de estos genes mediante electroforesis en
el gel de agarosa (Figura 3.2). Las plantas con síntomas severos presentaron mayor
expresión de los genes de la mitosis, en comparación con las plantas con síntomas
moderados.
Por su parte, PCNA es una proteína que interviene en el ciclo celular participando en la
55
CAPÍTULO III
fase de síntesis, sin embargo se ha visto que ciertos geminivirus inducen su expresión
para activar el ciclo celular de su hospedero y poder replicarse. En este trabajo se
observó la expresión de PCNA tanto en plantas sanas como en moderadas y severas, sin
embargo, se observó un incremento significativo en su expresión en las plantas con
síntomas severos.
El gen constitutivo que codifica para actina se utilizó como testigo de carga, y como se
esperaba se observó el mismo nivel de expresión en plantas sanas, moderadas y
severas.
Figura 3.2 El EuMV-YP aumenta la expresión de genes asociados a la mitosis. RT-PCR de los
genes CDKB1, CDKB2, PCNA, Actina en plantas sanas, moderadas y severas de S. lycopersicum a
los 14 ddi.
56
CAPÍTULO III
3.4 DISCUSIÓN
En este trabajo se estudió la infección causada por EuMV-YP en plantas de S.
lycopersicum se observó un incremento en la expresión de los transcritos de los genes
CDKB1 y CDKB2, en plantas de S. lycopersicum que presentaron síntomas moderados y
severos y como se presentó en el capítulo anterior, se observó una respuesta de
hiperplasia en las plantas con síntomas severos. Previamente, en plantas de N.
benthamiana infectadas con EuMV-YP se observó un aumento de la expresión de los
genes CYCA1, CYCA2 y CDKB2, cuya expresión se incrementa al inicio de la mitosis y
que por lo tanto son considerados marcadores de la mitosis; estos cambios de expresión
genética se asocian con la inducción de hiperplasia (Gamboa-Tec et al., 2015). Los
resultados de este trabajo confirman los resultados previamente observados en plantas de
N. benthamiana en un hospedero distinto, por lo que sugiere que EuMV-YP contiene
elementos genéticos en su genoma para inducir la proliferación celular. Esta respuesta es
similar a la de los curtovirus, con la diferencia de que en las infecciones causadas por los
curtovirus la hiperplasia ocurre en las células de los haces vasculares particularmente las
asociadas al floema (Park et al., 2004; Latham et al., 1997); mientras que la hiperplasia
causada por EuMV-YP ocurre en el parénquima en empalizada y esponjoso (Gamboa-Tec
et al., 2015). El curtovirus BCTV induce la expresión del gen del ciclo celular CDKB1 en
plantas infectadas de A. thaliana (Park et al., 2004). Sin embargo, en este mismo
hospedero, infectado con el Begomovirus bipartita CaLCuV, se observó el aumento de la
expresión de genes de la transición entre las fases S y G2 (S/G2) y la disminución de la
expresión de genes de la transición entre la Mitosis y la fase G1 (M/G1) del ciclo celular
(Ascencio-Ibáñez et al., 2008). El EuMV-YP es el primer begomovirus bipartita reportado
que induce la expresión de genes asociados con la activación de la mitosis en las plantas
infectadas. Nuestros resultados sugieren que el EuMV-YP comparte mecanismos
moleculares con el curtovirus BCTV, por lo que representa un modelo interesante para el
estudio de genes celulares implicados en las infecciones virales en las plantas.
Por otra parte, también se analizó la expresión del gen PCNA, observándose la expresión
basal en plantas sanas y en las que presentaron síntomas moderados, sin embargo, se
obtuvo un aumento notorio de su expresión en las plantas con síntomas severos. PCNA
es una proteína multifuncional, que participa en la fase S del ciclo celular, cuya expresión
57
CAPÍTULO III
a nivel de transcritos permanece reprimida en células diferenciadas (Pasumarthy et al.,
2011; Keiman, 1997), sin embargo se ha observado que los geminivirus inducen su
expresión. También se sabe que las proteínas REn del TGMV y Rep del Virus del rizado
amarillo del tomate aislado Sardina (TYLCSV), ambos begomovirus interactúan con la
proteína PCNA del tomate durante la infección para inducir la replicación del ADN
cromosómico y viral en la planta hospedera (Castillo et al., 2003). Al estudiar mecanismos
de replicación por círculo rodante se observó que PCNA es responsable del número de
copias de ADN viral dentro de las plantas hospederas infectadas (Bagewadi et al., 2004).
Por tanto, los resultados de este trabajo sobre la inducción en la expresión del gene de
PCNA por EuMV-YP en plantas de tomate que presentaron síntomas severos de
infección, fueron los esperados. No obstante, se esperaba una mayor inducción en las
plantas con síntomas moderados; la falta de activación en la expresión de este gen puede
deberse a que se colectó el material a los 14 ddi, que fue una etapa tardía en la infección.
Para resolver este problema se deberían hacer ensayos de expresión del gen PCNA en
plantas a los 7 y 9 ddi como se realizó para otros geminivirus (Pierce y Rey, 2013;
Ascencio-Ibáñez et al., 2008).
Por lo tanto, los resultados obtenidos en el capítulo III, sugieren que EuMV-YP es capaz
de inducir la proliferación celular, por lo que éste aislado viral debe contener elementos
genéticos en su genoma para generar esta respuesta en el hospedero. En este sentido, la
respuesta inducida por EuMV-YP es similar a la de los Curtovirus y Begomovirus
monopartitas.
58
CAPÍTULO III
BIBLIOGRAFÍA
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59
CAPÍTULO III
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60
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS
4.1 CONCLUSIONES GENERALES

EuMV-YP es capaz de provocar síntomas severos como abultamientos,
enrollamientos y retraso del crecimiento en plantas de S. lycopersicum.

EuMV-YP causa cambios en la arquitectura tisular en las hojas de S.
lycopersicum con síntomas moderados y severos.

EuMV-YP induce hiperplasia en células del mesófilo en plantas de S.
lycopersicum con síntomas severos. La proliferación observada, esta
correlacionada con la inducción de la expresión de genes marcadores de la
mitosis.

EuMV-YP que es un begomovirus bipartita, debe contener determinantes
genéticos para inducir la mitosis en plantas infectadas.
61
CAPÍTULO IV
4.2 PERSPECTIVAS
En este trabajo se estudió el efecto citopático y la expresión de los genes marcadores de
la mitosis causado por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum. Como resultado se
reportó que este virus fue capaz de causar proliferación celular en plantas infectadas que
presentaron síntomas severos. Igualmente se observó un incremento en la expresión de
genes del ciclo celular que participan en la inducción de la mitosis. Los resultados
observados en este trabajo confirman lo previamente observado en N. benthamiana
corroborando que este virus se comporta de manera diferente a otros begomovirus
bipartitas, por lo que sería de gran interés utilizar esté mismo virus como modelo para:

Caracterizar el efecto citopático en plantas de E. heterophilla y D. stramonium para
verificar si se presenta el mismo efecto en el hospedero natural.

Realizar pruebas moleculares cuantitativas como PCR en tiempo real, para medir
la expresión de los transcritos de los genes del ciclo celular de la fase mitótica. Así
como en etapas tempranas de la infección, a los 7 y a los 9 ddi.

Caracterizar el efecto citopático en otros órganos de la planta con infección severa
ocasionado por EuMV-YP.

Identificar si otro aislado de EuMV (Jalisco, Cuba, Puerto Rico, etc.) causa efecto
citopático similares a los producidos por EuMV-YP.
62