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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas Estudio del Efecto del Virus mosaico de la Euphorbia aislado de la península de Yucatán (EuMV-YP) en la anatomía de las hojas de Solanum lycopersicum y en la inducción de la expresión génica Tesis que presenta Jaqueline Guadalupe Carrillo Navarrete En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS (Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología) Mérida, Yucatán, México 2015 DECLARACIÓN DE PROPIEDAD Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración. Firma: ________________________________ AGRADECIMIENTOS En primer lugar quisiera agradecer a mis asesoras de tesis la Dra. Luisa A. López Ochoa y la Dra. Virginia A. Herrera Valencia porque siempre estuvieron al pendiente de mis avances, me corrigieron en mis errores, me compartieron sus experiencias y por la confianza que depositaron en mí durante todo este tiempo. Al comité tutorial integrado por los doctores Luisa A. López Ochoa, Virginia A. Herrera Valencia, Santy Peraza Echeverría y Aída Martínez Hernández, por sus valiosos comentarios a lo largo del trabajo de tesis. Al comité de revisión de tesis formado por los doctores Luisa A. López Ochoa, Virginia A. Herrera Valencia, Santy Peraza Echeverría, Aída Martínez Hernández, Gregorio del Carmen Godoy Hernández, por su valiosa revisión y aportes al documento de tesis. A la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas y la Unidad de Biotecnología del CICY por las facilidades para realizar el trabajo experimental de la tesis de maestría. Al Posgrado en Ciencias Biológicas del CICY, así como a todo el personal por las facilidades brindadas para realización de esta tesis. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada #289876 para los estudios de maestría, así como al financiamiento del proyecto de ciencia básica No. 98920 otorgado para la realización de este proyecto. A la Dra. Naivy F. Gamboa Tec, por su valiosa asesoría en la realización del proceso de infección y colecta de las plantas de S. lycopersicum. A la Dra. Ivonne Sánchez del Pino y al Dr. José Juan Zúñiga, por el amable préstamo del Microscopio estereoscopio NIKON modelo ECLIPSE E200 y su apoyo técnico en la captura de imágenes en el Software INFINITY ANALYZER 3. Al apoyo técnico del M. en C. Luis Carlos Gutiérrez, por su valiosa asesoría en los análisis de los cortes histológicos. Al apoyo técnico de la Q.B.A. Ileana C. Borges Argáez, por su apoyo técnico en los experimentos de biobalística. Al M. en C. Randy Noé Avilez Montalvo, por la cantidad de tiempo brindado para la discusión de artículos y protocolos empleados. A mis amigos los golosos del CICY por esos momentos de ñoñería y debates existenciales, de alegrías y tristezas pero siempre firmes. DEDICATORIA A mi Dios el Universo, por todo y por mucho más. A mis padres, por ser mis guías de vida y mis mayores ejemplos de amor, lucha, entrega y perseverancia, porque como dice papá “por muy oscuro que se encuentre el camino siempre hay que seguir adelante, pues al final, siempre hay una luz. Queda estrictamente prohibido echar para atrás, pues caminar hacia atrás es más fácil perderse”. Gracias papá y mamá, esta va por ustedes. Aún me falta por caminar, pues esto es solo el inicio de muchos otros caminos. A mis hermanas, porque juntas hacemos un excelente equipo. A mis abuelitas, por cada una de sus oraciones de paz y tranquilidad, ustedes siempre presentes. A Randy, gracias por las porras en mis momentos de desánimo y apatía, y gracias también por compartir los momentos de alegrías. Sin duda alguna hacemos una excelente mancuerna. Soy tu Fan #1, TE AMO. Si he visto más lejos es porque estoy sentado en los hombros de gigantes. Issac Newton. INDICE ÍNDICE DE CONTENIDO INDICE DE FIGURAS ............................................................................................................... v INDICE DE CUADROS ........................................................................................................... vii ABREVIATURAS.................................................................................................................... ix RESUMEN...................................................................................................................... 1 ABSTRACT ..................................................................................................................... 3 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 5 CAPÍTULO I .................................................................................................................... 7 1.1 ANTECEDENTES ............................................................................................................... 7 1.1.1. Generalidades de los Virus ....................................................................................................... 7 1.1.2. Familia Geminiviridae; clasificación taxonómica...................................................................... 8 1.1.3. Begomovirus........................................................................................................................... 11 1.1.4. Virus Mosaico de la Euphorbia (EuMV).................................................................................. 12 1.1.5. EuMV-YP................................................................................................................................. 13 1.1.6. Ciclo celular ............................................................................................................................ 14 1.1.7. Retinoblastoma y Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) ............................... 16 1.1.8. Los Geminivirus y el ciclo celular ............................................................................................ 17 1.1.9. Generalidades de S. lycoperscum........................................................................................... 19 1.2 HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 21 1.3 OBJETIVOS .................................................................................................................... 21 1.3.1. 1.3.1 Objetivo general. ........................................................................................................... 21 1.3.2. 1.3.2 Objetivos específicos. .................................................................................................... 21 1.4 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 22 1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL.......................................................................................... 23 CAPITULO II ................................................................................................................. 27 EFECTO CITOPÁTICO CAUSADO POR EL VIRUS DEL MOSAICO DE LA EUPHORBIA AISLADO DE LA i INDICE PENÍNSULA DE YUCATÁN EN PLANTAS DE Solanum lycopersicum. ........................................ 27 2.1 INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 27 2.2. MATERIALES Y MÉTODOS. ............................................................................................ 30 2.2.1 Material vegetal.............................................................................................................................. 30 2.2.2. Inoculación de plantas ................................................................................................................... 30 2.2.3 Seguimiento de síntomas y colecta de material vegetal ................................................................ 30 2.2.4 Cortes histológicos.......................................................................................................................... 31 2.2.5 Tinción con azul de toluidina .......................................................................................................... 32 2.2.6 Captura de imágenes y análisis de medición .................................................................................. 32 2.3 RESULTADOS................................................................................................................. 34 2.3.1 Síntomas evaluados en plantas inoculadas con EuMV-YP.............................................................. 34 ................................................................................................................................................................. 37 2.3.2 Alteraciones producidas por EuMV-YP ........................................................................................... 37 2.3.3. Distorsiones en las nervaduras ...................................................................................................... 38 2.3.4 Alteraciones en la región proximal al margen de la hoja e hiperplasia .......................................... 42 2.4. DISCUSIÓN. .................................................................................................................. 45 CAPÍTULO III ................................................................................................................ 49 EuMV-YP INDUCE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS A LA MITOSIS EN S. lycopersicum.... 49 3.1 INTRODUCCIÓN............................................................................................................. 49 3.2 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 51 3.2.1 Material vegetal.............................................................................................................................. 51 3.2.2 Extracción de ARN de tejido foliar de S. lycopersicum.................................................................... 51 3.2.3 RT-PCR ............................................................................................................................................ 51 3.3 RESULTADOS................................................................................................................. 54 3.3.1 Extracción de ARN Total ................................................................................................................. 54 3.3.2 Perfiles de expresión para los genes CDKB1, CDKB2, PCNA y Actina ............................................. 55 3.4 DISCUSIÓN .................................................................................................................... 57 CAPÍTULO IV................................................................................................................ 61 ii INDICE CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS ............................................................... 61 4.1 CONCLUSIONES GENERALES........................................................................................... 61 4.2 PERSPECTIVAS............................................................................................................... 62 iii INDICE iv INDICE INDICE DE FIGURAS Figura 1.1 Organización genómica de los miembros representativos de la familia Geminiviridae................................................................................................................... 10 Figura 1.2 Clasificación taxonómica de la familia Geminiviridae (Varsani et al., 2014).... 10 Figura 1.3 Síntomas de las plantas infectadas con EuMV-YP........................................ 13 Figura 1.4 Reprogramación del ciclo celular en plantas. ................................................. 18 Figura 1.5 Estrategia experimental de acuerdo a los objetivos del proyecto. .................. 23 Figura 2.1 Ejemplo del corte transversal de una hoja sana de S. lycopersicum, armado a partir de varias fotografías……………………………………………………………………….33 Figura 2.2 Ejemplo de síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum cultivadas bajo condiciones in vitro……………………………………………………………..36 Figura 2.3 Retraso del crecimiento en S. lycopersicum ocasionado por EuMV-YP………37 Figura 2.4 Reconstrucción de cortes transversales de hojas de S. lycopersicum inoculadas con EuMV-YP………………………………………………………………………..38 Figura 2.5 Alteraciones en la nervadura foliar causada por EuMV-YP en S.lycopersicum. Sección de nervaduras centrales……………………………………………………………….39 Figura 2.6 Alteraciones en las nervaduras laterales de las hojas de S. lycopersicum inoculadas con EuMV-YP………………………………………………………………………..41 Figura 2.7 Alteraciones del EuMV-YP en la región próxima al margen de la hoja en S. lycopersicum……………………………………………………………………………………... 42 Figura 2.8 Cambios en la arquitectura tisular e hiperplasia en S. lycopersicum inducidos v INDICE por la inoculación con EuMV-YP………………………………………………………………. 43 Figura 3.1 Muestras de ARN total de los explantes foliares de S. lycopersicum………...55 Figura 3.2 El EuMV-YP aumenta la expresión de genes asociados a la mitosis…………56 vi INDICE INDICE DE CUADROS Cuadro 1.1 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus basada en los hospederos naturales, insecto vector y organización genómica ................................... 9 Cuadro 1.2 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus.............. 12 Cuadro 2.1 Severidad de síntomas de S. lycopersicum (Gamboa-Tec et al., 2015)…....31 Cuadro 2.2 Resultado de la severidad de síntomas observados en plantas inoculadas con EuMV-YP a los 21 ddi………………………………………………………………………….. 34 Cuadro 2.3 Síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum. As; Asintomáticas, A: Atenuadas, M: Moderadas, S: severas, ddi: días después de la infección………………………………………………………………………………………….. 35 Cuadro 2.4 Tamaño de la nervadura central de las plantas inoculadas con EuMV-YP….40 Cuadro 2.5 Análisis estadístico de las mediciones del grosor de la lámina foliar en S. lycopersicum, plantas sanas y plantas inoculadas con EuMV-YP…………………………..43 Cuadro 2.6 Número de células por micrómetro cuadrado en el mesófilo de plantas de tomate inoculadas con EuMV-YP……………………………………………………………….44 Cuadro 3.1 Secuencia de cebadores para el análisis de expresión genética…………. 52 Cuadro 3.2 Cuantificación del ARN total obtenido……………………………………………54 vii INDICE viii ABREVIATURAS ABREVIATURAS AC1/AL1/Rep Proteína tipo replicasa AC2/AL2/Trap Proteína transactivadora (trans-activator protein) AC3/AL3/REn Proteína potenciadora de la replicación (Replication enhancer protein) ADN Ácido desoxirribonucleico ADNcd ADN de cadena doble ADNcs ADN de cadena sencilla ARN Ácido ribonucleico BC1/BL1/MP Proteína del movimiento (Movement protein) BV1/BR1/NSP Proteína transportadora nuclear ( Nuclear shuttle protein) CDK Proteína transportadora nuclear ( Nuclear shuttle protein) EuMV Virus mosaico de la Euphorbia EuMV-YP Virus mosaico de la Euphorbia aislado de la península de Yucatán ICTV Comité internacional de taxonomía de virus PCNA Antígeno nuclear de células en proliferación pRBR Proteína de retinoblastoma en plantas RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa acoplado a transcripción reversa TYLCSV Virus del rizado amarillo del tomate aislado de la sardina TYLCV Virus del rizado y amarillamiento del tomate ix ABREVIATURAS VIGS Vector de silenciamiento génico basado en virus x RESUMEN RESUMEN Los geminivirus son virus de ADN circular de cadena sencilla, que se replican en el núcleo de las células infectadas y son causantes de enfermedades en las plantas. Los pertenecientes al género Begomovirus son los más representados, éstos pueden ser de uno o dos componentes genómicos, y son también llamados mono y bipartitas respectivamente. Para replicar su genoma los begomovirus bipartitas reprograman la expresión de genes del ciclo celular para estimular la replicación del ADN en las células diferenciadas, sin pasar por la mitosis en un proceso conocido como endorreduplicación. Por el contrario los begomovirus monopartitas son capaces de inducir la proliferación celular cuando están asociados a B-satélites. Recientemente, se encontró que el aislado de la península de Yucatán del Virus del mosaico de la Euphorbia (EuMV-YP) invade las células del mesófilo e induce la proliferación celular causando pérdida de identidad tisular en plantas de Nicotiana benthamiana. En virtud de que la localización y el efecto citopático causado por diferentes aislados de EuMV, parecen ser dependientes del hospedero, en éste trabajo se evaluó el efecto causado por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum, y se estudió la expresión de genes asociados con la mitosis. Los resultados obtenidos mostraron que EuMV-YP tiene un comportamiento diferente a los demás begomovirus bipartitas, ya que las células del mesófilo presentaron proliferación celular, estos resultados se muestran en el capítulo II. Además se observó la inducción de la expresión de los genes CDKB1 y CDKB2, confirmando que EuMV-YP es capaz de inducir la mitosis, estos resultados se presentan en el capítulo III. 1 RESUMEN 2 ABSTRACT ABSTRACT The Geminiviruses are circular single-stranded DNA viruses which replicate in the nucleus of infected cells and are responsible for several plant diseases. Those belonging to the genus begomovirus are the most represented, they can be one or two genomic components, and are also called mono and bipartite respectively. In order to replicate its genome begomovirus reprogram the bipartite expression of cell cycle genes to stimulate DNA replication in differentiated cells, and they do this without going through mitosis in a process known as endoreduplication. Conversely the monopartite begomoviruses are capable of inducing cell proliferation when associated with B-satellites. Recently, it was found that the isolated Yucatan Peninsula Mosaic Virus Euphorbia (EuMV-YP) invades mesophyll cells and induces cell proliferation, causing loss of tissue identity in Nicotiana benthamiana plants. Given that the location and the cytopathic effect caused by different isolates of EuMV seems to be dependent on the host, in this work the effect caused by EuMV-YP (Chapter II) in Solanum lycopersicum plants was evaluated and studied genes associated expression with mitosis. The results showed that EuMV-YP has a different behavior to others bipartite begomovirus since mesophyll cells showed cell proliferation, these results are shown in EuMV-YP also induces the expression of the CDKB1 CDKB2 genes was observed, confirming that EuMV-YP is capable of inducing mitosis, these results are shown in Chapter III 3 ABSTRACT 4 INTRODUCCION INTRODUCCIÓN La familia Geminiviridae incluye virus que infectan a una gran variedad de especies de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, produciendo en muchos casos pérdidas significativas en cultivos de importancia económica. Los virus pertenecientes a esta familia son caracterizados estructuralmente por la morfología geminada de las partículas del virión (18-30 nm) y genéticamente por un genoma que consta de una o dos moléculas de ADN circular de cadena sencilla; esta característica es poco común entre los virus de plantas (Fondong, 2013). Para poder replicarse los virus de esta familia reprograman el ciclo celular de su hospedero, sin embargo, se ha visto que miembros de diferentes géneros reprograman el ciclo celular de forma diferente (Gutierrez, 2000). El género begomovirus es uno de los 7 géneros de la familia Geminiviridae, su genoma puede ser; monopartita o bipartita, además es el género con más especies virales dentro de la familia Geminiviridae. Los virus pertenecientes a este grupo requieren de la maquinaria de las células que infectan para poder replicarse (Fondong, 2013; RuizHerrera et al., 1997) Cuando una célula se encuentra en estado quiescente se ha reportado que los begomovirus intervienen en la activación del ciclo celular provocando división celular anormal (Hanley-Bowdoin et al., 2013). Los begomovirus bipartitas al igual que los mastrevirus inducen la reentrada del ciclo celular, en vez de pasar por la mitosis activando el endociclo (Hanley-Bowdoin et al., 2013). El Virus del mosaico de la Euphorbia aislado de la península de Yucatán (EuMV-YP) es un begomovirus bipartita que tiene un amplio rango de hospederos, incluso plantas de interés comercial como chile, tomate y frijol (Villanueva-Alonzo et al., 2013).En estudios recientes en nuestro grupo de trabajo, se observó que el EuMV-YP induce la expresión de genes de la mitosis en plantas de N. benthamiana, infecta células del mesófilo e induce hiperplasia causando pérdida de identidad tisular (Gamboa-Tec et al., 2015; Fondong, 2013), ésta es una alteración inusual debido a que EuMV-YP es un begomovirus bipartita y los begomovirus bipartitas inducen la reentrada al endociclo, no la mitosis. Para determinar si esta respuesta inusual está dada por determinantes genéticos virales, en 5 INTRODUCCION este trabajo se infectaron plantas de S. lycopersicum variedad Saladette con EuMV-YP y se estudiaron los cambios morfológicos y la expresión de los genes del ciclo celular que pudieran estar involucrados en la infección viral. 6 CAPÍTULO I CAPÍTULO I 1.1 ANTECEDENTES 1.1.1. Generalidades de los Virus Los virus son partículas submicroscópicas de una o más moléculas de ADN o ARN de cadena doble o sencilla, normalmente encapsuladas en cubiertas de proteínas o lipoproteínas, capaces de organizar su propia replicación dentro de una célula hospedera (Ruiz-Herrera et al., 1997). Durante millones de años los virus han interactuado con los mecanismos moleculares de la célula que parasitan, llamada célula hospedera para su propio beneficio y han evolucionado con ella para explotar sus fuentes de energía y su maquinaria biosintética (Kang et al., 2005). Los virus infectan a casi todos los organismos vivientes, multicelulares o unicelulares como por ejemplo bacterias, hongos, plantas y animales. Son clasificados en jerarquías por el comité internacional de taxonomía de virus (ICTV) (Gutierrez, 2000). Esta clasificación se basa en las propiedades físicas del virus; como el tamaño y la forma, además, en factores involucrados en la replicación como el número de componentes genómicos, el tipo y naturaleza de los ácidos nucleicos, la estructura del genoma (lineal o circular) (Fauquet y Stanley, 2005). Los virus de plantas se han clasificado en 20 familias y 88 géneros, el 90% de los virus de plantas tienen genomas de ARN y el 10% restante posee genomas de ADN (Fauquet et al., 2008). En las plantas las enfermedades virales están influenciadas por varios factores, tales como ambientales, replicación del viroide, modo de dispersión del virus, niveles de agresividad del virus y niveles de resistencia de la planta hospedera (Torres-Pacheco et al., 1996). Existen diferentes vías de transmisión viral, por ejemplo; a) Mecánica: por contacto de parte de plantas infectadas con plantas sanas (transmisión por maquinaria agrícola contaminada, las manos de los operadores o animales). b) Por vectores, que pueden ser insectos, ácaros, nematodos, etc. y c) a través de las partes de la planta usadas para la propagación, ya sea semillas o tubérculos (Jones, 2003). Sin embargo, la transmisión por vectores es la más eficiente y tiene mayor repercusión, por lo tanto se 7 CAPÍTULO I usan diversos insecticidas químicos para controlarlos. Esto repercute de manera importante en los costos de producción agrícola y en la contaminación ambiental. 1.1.2. Familia Geminiviridae; clasificación taxonómica La familia Geminiviridae es una de las familias de virus más grandes y más importantes que infectan a una gran variedad de especies de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas (Fondong, 2013), ocasionando daños y pérdidas de importancia económica. La incidencia y severidad de las enfermedades ocasionadas por geminivirus se ha incrementado considerablemente en los últimos 20 años (Varsani et al., 2014). Los geminivirus se caracterizan estructuralmente por la morfología de las partículas icosaédricas geminadas del virión y genéticamente por la conformación de su genoma que consiste en uno o dos moléculas de ADN de cadena simple circular sencilla (Fauquet et al., 2008). El ADN de doble cadena (ADNdc) (formas replicativas) es transcrito en el núcleo de las células infectadas de las plantas (Fondong, 2013), donde también se lleva a cabo la replicación. El genoma de estos virus es pequeño, con un tamaño promedio de 2.5 a 3 X 103 nucleótidos, y puede ser monopartitas o bipartitas (Hanley-Bowdoin et al., 2013). Los miembros representativos de esta familia son los géneros Mastrevirus, Curtovirus y los Begomovirus, debido a la organización de su genoma (Gutierrez, 2000) (Figura 1.1). Los miembros pertenecientes a la familia de los geminivirus se replican por círculo rodante y por replicación dependiente de la recombinación (Hanley-Bowdoin et al., 2013). En base a la organización de su genoma, el insecto vector y el rango de plantas hospederas, los geminivirus, son clasificados por el comité internacional de taxonomía de virus (ICTV) en 7 géneros; Mastrevirus, Curtovirus, Begomovirus, Topocuvirus, Becurtovirus, Eragrovirus, y Turncurtovirus (Figura 1.2) (Varsani et al., 2014). Los miembros del género Mastrevirus tienen un componente genómico (monopartitas), son transmitidos por varias especies de chicharritas que infectan plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, los miembros del género Curtovirus tienen un solo componente genómico, son transmitidos por chicharritas del género Circulifer y son exclusivos de plantas dicotiledóneas, los miembros del genero Begomovirus pueden presentar un genoma monopartita o doble genoma (bipartita), son transmitidos por la mosquita blanca (Bemisia 8 CAPÍTULO I tabaci),e infectan a plantas dicotiledóneas, los Topocuvirus tienen un solo componente genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y son transmitidos por insectos de la familia Membracide. Los Becurtovirus, Eragrovirus, y Turncurtovirus son los géneros de reciente incorporación en la familia Geminiviridae (Varsani et al., 2014). Los Becurtovirus tienen un componente genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y son transmitidos por chicharritas (Circulifer haematoceps). Los Eragrovirus contienen un solo componente genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y de igual forma son transmitidos por chicharritas. Los Turncurtovirus tiene un componente genómico, infectan a plantas dicotiledóneas y son transmitidos por chicharritas (Varsani et al., 2014) (Cuadro 1.1). Cuadro 1.1 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus basada en los hospederos naturales, insecto vector y organización genómica Género Hospedero Vector Genoma Mastrevirus Monocotiledóneas y Chicharritas Monopartita dicotiledóneas (Cicadellidae) Dicotiledóneas Chicharritas Curtovirus Monopartita (Cicadellidae) Begomovirus Topocuvirus Dicotiledóneas Dicotiledóneas Mosca blanca Monopartita y (Aleyrodidae) bipartita Chicharritas Monopartita (Membracidae) Becurtovirus Dicotiledóneas Chicharritas Monopartita (Cicadellidae) Eragrovirus Dicotiledóneas Chicharritas Monopartita (Cicadellidae) Turncurtovirus Dicotiledóneas Chicharritas Monopartita (Cicadellidae) 9 CAPÍTULO I Figura 1.1 Organización genómica de los miembros representativos de la familia Geminiviridae. La región (LIR, IR, CR) contiene señales requeridas para la replicación y la transcripción del ADN viral. Figura 1.2 Clasificación taxonómica de la familia Geminiviridae (Varsani et al., 2014). 10 CAPÍTULO I 1.1.3. Begomovirus El género Begomovirus es el de mayor importancia dentro de la familia de los geminivirus, por ser el más abundante (contiene 288 especies virales), con un amplio rango de hospederos e infecta a plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, produciendo pérdidas de importancia económica (Fondong, 2013). Los begomovirus se han diseminado rápidamente por el planeta debido fundamentalmente a la propagación de su vector, la mosquita blanca (Bemisa tabaci) (Nawaz-ul-Rehman y Fauquet, 2009). Con base en la organización del genoma, diversidad genética y distribución geográfica los begomovirus han sido divididos en dos grupos; begomovirus del viejo mundo (OW), los cuales se encuentran en algunos países de Europa, África, Asia y Australia y los begomovirus del nuevo mundo (NW), exclusivos del continente Americano (Varsani et al., 2009). Los begomovirus del viejo mundo son bipartitas y monopartitas y los pertenecientes al nuevo mundo, solo se han identificado virus representativos del genoma bipartita (Varsani et al., 2009). El genoma de los begomovirus está compuesto de ADN circular de cadena simple de aproximadamente 2.8 kb (monopartita) y 5.2 kb (bipartita) (Gregorio-Jorge et al., 2010). Los virus bipartitas tienen dos componentes circulares denominados ADN-A y ADN-B. El componente A, contiene toda la información que las proteínas virales requieren para la replicación, transcripción y encapsulación del ADN del virus, mientras que el componente B codifica para las proteínas involucradas en el movimiento (Cuadro 1.2) (Ruiz-Herrera et al., 1997). Los dos componentes que integran el genoma de un virus bipartita son heterólogos entre si y solo comparten una región de 200 nucleótidos con un alto porcentaje de identidad (Gregorio-Jorge et al., 2010), este fragmento denominado región común (RC) está dentro de la región intergénica y contiene un segmento de 30 nucleótidos capaz de formar la estructura de tallo-asa, la cual está involucrada con el inicio de la replicación viral (Gregorio-Jorge et al., 2010). El begomovirus monopartita está constituido de un solo componente genómico de ADN circular que es equivalente a los componentes ADN-A y ADN-B de los begomovirus bipartitas (Gregorio-Jorge et al., 2010). 11 CAPÍTULO I Cuadro 1.2 Clasificación taxonómica establecida por el ICTV para geminivirus NOMENCLATURA FUNCIÓN GENOMA AC1 AL1 Rep Iniciación de la replicación A AC2 AL2 Trap Activación de la transcripción de genes tardíos A AC3 AL3 Ren Replicación A AC4 AL4 Replicación A AV1 AR1 CP Proteína de la cápside A BC1 BL1 MP Movimiento viral Célula-célula B Movimiento viral hacia el núcleo B BV1 BR1 NSP 1.1.4. Virus Mosaico de la Euphorbia (EuMV) El EuMV, es un begomovirus bipartita cuyo hospedero natural es la planta silvestre E. heterophylla, este virus fue descubierto y descrito desde los años 50, sin embargo, fue hasta los años 80 que se logró clasificar con base a sus factores biológicos, bioquímicos y propiedades físicas dentro de la familia Geminividae (Kim y Lee, 1992). Debido al desarrollo de nuevas herramientas moleculares y los servicios de secuenciación a escala industrial a bajo costo (Sanger y una variedad de técnicas de secuenciación de nueva generación) se ha logrado identificar diversos aislados de este virus como el aislado de Yucatán (EuMV-YP), Jalisco (EuMV-Jal), Cuba (EuMV-CU: Tb y EuMV-CU: Hav) Jamaica (EuMV-JM), Estados Unidos (EuMV-EU4) y Brasil (EuMV-MGS1 y EuMVMGS 2). (Fiallo-Olivé et al., 2012; Fiallo-Olivé et al., 2010; Gregorio-Jorge et al., 2010; Collins y Roye, 2007; Hernández-Zepeda et al., 2007). 12 CAPÍTULO I 1.1.5. EuMV-YP El aislado de la península de Yucatán del virus del mosaico de la Euphorbia (EuMV-YP) fue identificado en plantas de E. heterophylla en el 2007 (Hernández-Zepeda et al., 2007), siendo la primera vez que se reportó la secuencia completa del ADN-B. La Obtención de las secuencias de ambos componentes genómicos, permitió su clasificación dentro el clado del Virus mosaico de la calabaza (SqMV) (Hernández-Zepeda et al., 2007). Con las clonas infectivas obtenidas en este trabajo se inocularon plantas mediante biobalística, encontrándose hospederos experimentales pertenecientes a las familias Euphorbiaceae, Malvaceae y Solanaceae incluyendo algunas especies de importancia agronómica como Capsicum chinense, Nicotiana tabacum, S. lycopersicum, Arabidopsis thaliana, N. benthamiana (Hernández-Zepeda et al., 2007). Los síntomas observados fueron: mosaicos dorados, enrollamiento de las hojas y moteados amarillos (Figura 1.3) Figura 1.3 Síntomas de las plantas infectadas con EuMV-YP, inoculadas por biobalística (A) chile (C. chinense), (B) Frijol (P.vulgaris) y (C) Euphorbia (E. heterophylla). 13 CAPÍTULO I El EuMV-YP fue utilizado para la construcción de un vector de silenciamiento inducido por virus tipo (VIGS), el cual permitió estudiar la respuesta de genes relacionados con la patogenicidad en plantas de N. benthamiana y C. chinense (Villanueva-Alonzo et al., 2013). Empleando el gen de la subunidad I del magnesio quelatasa se encontró que el silenciamiento inducido por este vector era inicialmente mayor en el floema, lo que llevó a sugerir que EuMV-YP estaba restringido a este tejido (Villanueva-Alonzo et al., 2013). Se ha visto que los aislados de Florida y Costa Rica de EuMV inducen cambios en la arquitectura tisular de Datura stramonium, un hospedero experimental, pero no en el hospedero natural E. heterophylla (Kim y Fulton, 1984). Gamboa-Te, recientemente identificó que el EuMV-YP induce cambios en la arquitectura tisular e hiperplasia en tejido foliar de N. benthamiana (Gamboa-Tec et al., 2015). Utilizando técnicas de inmunofluorescencia se observó, que éste virus se localiza tanto en las células del mesófilo como en el floema. Esto es interesante, ya que en estudios anteriores se reportó que el aislado de Costa Rica se encuentra restringido al floema en E. heterophylla (Kim y Lee, 1992); mientras que el aislado de Florida se encontró en células de la epidermis y del mesófilo en plantas de Datura stramonium (Kim y Lee, 1992) Esto podría sugerir que la afinidad tisular de los distintos aislados de EuMV depende del hospedero. Cabe mencionar que en la época en la que se estudió a los aislados de Florida y Costa-Rica el diagnóstico se realizaba por la morfología de las partículas virales, ya que no se contaba con sus secuencias virales. Por lo que no está claro si dichos aislados realmente correspondan a EuMV o si pudiesen tratarse de aislados de otra especie de geminivirus causante de mosaicos en E. heterophilla. Por lo tanto, es necesario determinar si EuMV-YP es capaz de invadir el mesófilo de otros hospederos, así como determinar si puede provocar hiperplasia y cambios en su estructura tisular. 1.1.6. Ciclo celular En las plantas la división celular constituye un proceso de importancia vital, no solo para el crecimiento vegetal sino también para el desarrollo. En todos los organismos las células llevan a cabo un patrón predeterminado de crecimiento. En las células eucariotas este patrón de crecimiento es realizado a manera de ciclos (Vázquez, 2006) El ciclo celular en las plantas es similar al de otros organismos superiores, sin embargo, 14 CAPÍTULO I existen diferencias importantes con respecto al de los animales, ya que la vía en que la división celular se integra dentro del desarrollo es diferente; en los animales la forma del organismo está determinada en el embrión y lo que ocurre es una migración celular en el organismo maduro, la división celular reemplaza células pérdidas o dañadas (EchevarríaMachado et al., 2002). Las plantas pueden continuar creciendo y alterar su forma a través de su ciclo de vida por división celular en regiones especializadas conocidas como meristemos y por el subsecuente desarrollo de tejidos y órganos (Echevarría-Machado et al., 2002). El ciclo celular está dividido en dos etapas conocidas como interface y fase M. La interface consta de 3 partes; 1) G1; en esta fase la célula crece, acumula nutrientes y se prepara para que, en el caso de que las condiciones sean adecuadas, el ADN sea duplicado, 2) S o fase de síntesis; el material genético es duplicado, 3) G2, en esta fase la célula continua creciendo y lleva a cabo una preparación y organización para que el material genético se segregue adecuadamente en la fase M, la fase M; de mitosis o división celular, sucede la división equitativa del material genético a las células hijas (Vázquez, 2006). Existen señales que inducen la entrada a la división celular y otras que detienen el ciclo en la fase G1, lo que provoca la interrupción de la proliferación celular; es en este proceso, denominado estado quiescente (G0), en donde la célula queda metabólicamente activa pero no prolifera (Muller et al., 1993). La transición de una fase a otra dentro del ciclo celular es regulada por ciclinas (CYC). Las ciclinas, son proteínas que se acumulan continuamente a través del ciclo celular, y son proteolíticamente destruidas en la mitosis. En las plantas se han descrito 60 ciclinas, 49 en A. thaliana, más que en algún otro organismo eucariótico. Las ciclinas en los mamíferos se clasifican en; A, B1, B2, C, D1, D2, D3, E, F, G1, G2, H, I, K, T1, y T2; las ciclinas de plantas son clasificadas en 5 grupos: A, B, C, D y H. Las ciclinas de tipo A y B conocidas como ciclinas mitóticas, se acumulan durante las fases S, G2 y la fase temprana M. Las ciclinas de tipo D, controlan la progresión a través de la fase G1 en respuesta a factores de crecimiento y nutrientes. Las ciclinas de tipo H y C, han sido caracterizadas en álamo y arroz (Renaudin et al., 1996). Las ciclinas contienen una región común conocida como cyclin box, de aproximadamente 150 aminoácidos, un dominio 15 CAPÍTULO I conservado responsable de la unión y activación de las cinasas dependientes de ciclinas (CDK’s) (Renaudin et al., 1996). Las CDK’s, son una familia de proteínas cinasas que también intervienen en el ciclo celular, estas fosforilan en residuos de serina/treonina y requieren asociarse a las ciclinas para realizar su función (Renaudin et al., 1996). Los efectores a través de una cascada de señalización, pueden modificar la actividad de estas cinasas, regulando de esta manera los eventos del ciclo celular. 1.1.7. Retinoblastoma y Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) El ciclo celular involucra a diversas proteínas que participan regulando sus diferentes fases, como por ejemplo; la proteína relacionada con el retinoblastoma (pRBR) que regula la transición de la fase G1/S en mamíferos (Echevarría-Machado et al., 2002). En plantas, el homólogo animal de pRBR es un regulador clave del ciclo celular (Hanley-Bowdoin et al., 2013; Echevarría-Machado et al., 2002). pRBR es un inhibidor de la actividad de la familia de factores de transcripción E2F, los cuales son reguladores maestros de la expresión de genes involucrados en la transición entre las fases G0/G1. Los complejos pRBR-E2F detiene el inicio del ciclo celular, esta inhibición se revierte cuando pRBR es fosforilada (Hanley-Bowdoin et al., 2013). El avance hacia las diferentes fases del ciclo celular esta mediado por la familia de proteínas cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuya actividad está regulada por la interacción con diferentes ciclinas. La degradación y síntesis de las ciclinas durante el ciclo celular es un proceso altamente regulado. Lo cual, aunado a la acción de los inhibidores de cinasas constituyen al control del ciclo celular (Renaudin et al., 1996). El antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) es otro componente esencial de la maquinaria de replicación, recombinación y reparación del ADN ya que participa en proporcionar posesividad a la DNA polimerasa durante la replicación. PCNA interactúa con proteínas celulares involucradas en la regulación del ciclo celular (Keiman, 1997). 16 CAPÍTULO I 1.1.8. Los Geminivirus y el ciclo celular Existen reportes que sugieren que los geminivirus intervienen en el ciclo celular de las células de las plantas que infectan. Se ha visto que los dsDNA de geminivirus son 20 veces más abundantes en los núcleos de las células en la fase S que en la células situadas en otras fases del ciclo (Accotto et al., 1993), esto llevó a la conclusión de que la replicación del ADN de los geminivirus está sincronizada con la capacidad de la célula hospedera para replicar su ADN durante la fase S (Accotto et al., 1993). La proteína Rep y REn de los geminivirus, interactúan con PCNA y pRBR del hospedero para inducir la replicación viral (Castillo et al., 2003). Durante la infección viral se inactiva la pRBR, desensamblando los complejos con los factores E2F, permitiendo la reentrada a la fase S, lo cual es una característica de muchos virus de ADN pequeños que infectan a plantas y animales (Hanley-Bowdoin et al., 2013). La interferencia de geminivirus con reguladores del ciclo celular, conduce a una progresión anormal a través de la fase-S, eventualmente lleva a la división celular con el consecuente aumento en el número de células, fenómeno conocido como proliferación celular. Trabajos anteriores sugieren que los miembros de los géneros Mastrevirus, Begomovirus y Curtovirus reprograman el ciclo celular cuando infectan a células maduras en estado quiescente para inducir la replicación tanto del ADN viral como del cromosómico (HanleyBowdoin et al., 2013). Los Curtovirus inducen la proliferación celular en las plantas infectadas, mientras que los Begomovirus y Mastrevirus provocan el aumento del tamaño de las células debido a la síntesis continua de ADN cromosómico en las células infectadas, sin llevarse a cabo la división celular, en un proceso conocido como endorreduplicación o endociclo (Hanley-Bowdoin et al., 2013). En estudios del transcriptoma de A. thaliana de plantas infectadas con CaLCuV se reportó el aumento de la expresión de genes que participan en la transición entre las fases S/G2 y la inhibición de la expresión de genes de la transición entre las fases M/G1 del ciclo celular (AscencioIbáñez et al., 2008) Por otra parte se ha reportado que los begomovirus monopartitas inducen proliferación y diferenciación celular cuando están asociados a genomas satélites (Alberter et al., 2005; Idris et al., 2005; Cui et al., 2004). Estudios realizados en plantas de algodón revelaron 17 CAPÍTULO I que DNA satélite asociado al genoma del virus del enrollamiento de la hoja del algodón de Multan (CLCuGV) es requerido para el desarrollo de síntomas en las plantas infectadas, la planta de algodón inoculadas con clonas infectivas de CLCuGV-DNAβ presentaron hiperplasia en las células del floema, similar a lo reportado en plantas de N. benthamiana y N. tabacum que fueron infectadas con el Curtovirus BCTV (Idris et al., 2005). Se ha demostrado que la DNAβ asociado al virus del enrollamiento de la hoja amarilla de tomate (TYLCCNV) es requerida para la inducción de la enfermedad del enrrollamiento de las hojas en plantas de tabaco, tomate y petunia, y el gen βC1 del DNAβ es responsable de la inducción de síntomas en las plantas infectadas(Cui et al., 2004). Recientemente en nuestro grupo de trabajo se identificó que EuMV-YP, un begomovirus bipartita, provoca cambios en la expresión de genes que participan en la inducción de la mitosis en N. benthamiana (Gamboa-Tec et al., 2015). Realizando ensayos de microscopía se observó que las plantas con síntomas moderados y severos produjeron hiperplasia en el tejido foliar. Está respuesta es interesante ya que no se espera que esto ocurra en infecciones con begomovirus bipartitas. Figura 1.4 Reprogramación del ciclo celular en plantas. Los begomovirus bipartitas reprograman el ciclo celular del hospedero, induciendo la replicación del genoma sin pasar por la mitosis, en un proceso conocido como endociclo o endorreduplicación (Tomado de (Hanley-Bowdoin et al., 2013). 18 CAPÍTULO I 1.1.9. Generalidades de S. lycoperscum El tomate (S. lycopersicum) es una planta herbácea, originaria de América y cultivada en todo el mundo para su consumo principalmente gastronómico, pertenece a la familia de las Solanaceae (Nuez, 1995). Las plantas tienen un tamaño variable según las distintas variedades, poseen tallos ramificados semileñoso con un grosor mediano que oscila entre 2 a 4 cm en su base, en el que se van desarrollando las hojas, tallos secundarios e inflorescencias (Lucero-Flores et al., 2012). Las hojas son compuestas e imparipinnadas, con foliolos peciolados, lobulados, con borde dentado, recubiertos de pelos glandulares y se disponen de forma alternada sobre el tallo (Lucero-Flores et al., 2012). Las flores son pequeñas, constan de 5 o más sépalos con igual número de pétalos de color amarillo dispuestos de forma helicoidal. Las flores se agrupan en inflorescencias en forma de racimos. El fruto de la planta de tomate puede alcanzar un peso aproximado de 600 g dependiendo de la variedad. Está constituido por el pericarpio, el tejido placentario y las semillas (Nuez, 1995). El genoma completo de la planta de tomate fue secuenciado y reportado por primera vez en el 2012. Se identificó que el genoma tiene un tamaño de 900 Mb, contiene 12 cromosomas, 35004 genes que codifican para proteínas. Hasta el momento se han reportado 56 genes que codifican proteínas que pertenecen a la familia de las ciclinas. El tomate es una planta de interés comercial, además, es el segundo cultivo hortícola más importante después de la papa. La producción mundial actual es de 100 millones de toneladas de fruto fresco por 3.7 millones de hectáreas en el mundo (Gennari et al., 2013). Su producción en el 2008 se distribuyó de la siguiente manera: China fue el principal país productor (36%), seguido de Estados Unidos (14%), Turquía (12%), y la India (11%). México ocupó el décimo lugar con una producción del 3% (Lucero-Flores et al., 2012). En México durante el 2008, se produjeron 2.26 millones de toneladas de tomate, siendo el estado de Sinaloa el principal productor, seguido de Baja California, Michoacán, San Luis Potosí y Jalisco (Lucero-Flores et al., 2012). Las plantaciones de tomate al igual que muchos otros cultivos son vulnerables a diversas enfermedades ocasionadas por bacterias, hongos y virus. Sin embargo, el tomate es una planta altamente de interés comercial y susceptible a infecciones virales. Las 19 CAPÍTULO I enfermedades virales son las que ocasionan mayor pérdida económica entre los cultivos de importancia comercial, por ejemplo: el Virus del enrollamiento de la hoja amarilla de tomate (TYLCV) que causa pérdidas devastadoras de hasta el 100% (Fauquet y Stanley, 2005; Picó et al., 1996) 20 CAPÍTULO I 1.2 HIPÓTESIS El EuMV-YP posee determinantes genéticos que le permiten inducir la proliferación celular en S. lycopersicum. 1.3 OBJETIVOS 1.3.1. Objetivo general Determinar si EuMV-YP se localiza en el mesófilo e induce proliferación celular en S. lycopersicum. 1.3.2. • Objetivos específicos Determinar si EuMV-YP induce la proliferación celular en los tejidos foliares de S. lycopersicum. • Estudiar si EuMV-YP induce cambios en el nivel de expresión de genes asociados a la mitosis en el mesófilo de S. lycopersicum. 21 CAPÍTULO I 1.4 JUSTIFICACIÓN En nuestro grupo de trabajo se encontró recientemente que EuMV-YP induce la proliferación celular en el mesófilo de N. benthamiana. Este virus posee un amplio rango de hospederos, incluyendo a plantas de tomate (S. lycopersicum). Se ha reportado hasta el momento que los begomovirus bipartitas inducen el endociclo, no la mitosis, por lo tanto, EuMV-YP debe tener características genéticas únicas que le permiten llevar a cabo este proceso. Por otro lado, se ha encontrado que el tropismo de los diferentes aislados de EuMV es dependiente del hospedero, por lo tanto es necesario determinar si EuMV-YP es capaz de inducir la división celular en el mesófilo de otros hospederos, como S. lycopersicum. En virtud de que los begomovirus bipartitas inducen el endociclo en las plantas mediante un mecanismo de activación transcripcional de la expresión de genes del ciclo celular en las plantas infectadas, es necesario identificar si EuMV-YP utiliza este mismo mecanismo para inducir la expresión de genes asociados a la mitosis en S. lycopersicum. 22 CAPÍTULO I 1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL La estrategia experimental consiste en dos puntos que se resumen en la siguiente imagen. Figura 1.5 Estrategia experimental de acuerdo a los objetivos del proyecto. 23 CAPÍTULO I BIBLIOGRAFÍA Accotto, G. P., P. M. Mullineaux, S. C. Brown y D. Marie (1993). Digitaria streak geminivirus replicative forms are abundant in S-phase nuclei of infected cells. Virology, 195, 257-259. Alberter, B., M. A. Rezaian y H. Jeske (2005). Replicative intermediates of Tomato leaf curl virus and its satellite DNAs. Virology, 331, 441-448. Ascencio-Ibáñez, J. T., R. Sozzani, T. J. Lee, T. M. Chu, R. D. Wolfinger, R. 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Biotechnology letters, 35, 811-823. 26 CAPÍTULO II CAPITULO II EFECTO CITOPÁTICO CAUSADO POR EL VIRUS DEL MOSAICO DE LA EUPHORBIA AISLADO DE LA PENÍNSULA DE YUCATÁN EN PLANTAS DE Solanum lycopersicum 2.1 INTRODUCCIÓN Los begomovirus como grupo infectan a una amplia variedad de cultivos de importancia económica como: algodón, frijol, chile y tomate entre otros, así como a especies silvestres (Hernández-Zepeda et al., 2007). La respuesta de las plantas a las infecciones se manifiesta por el desarrollo de síntomas característicos de una particular combinación de virus-hospedero. Estudios anteriores han reportado diversos síntomas ocasionados por los begomovirus como son: retraso del crecimiento que puede conducir a enanismo, clorosis, mosaicos amarillos, abultamientos y enrollamientos en las hojas y otras anormalidades en los tejidos (Brown et al., 2002). Los cambios en la morfología celular causada por infección viral se denominan efecto citopático (Baron et al., 1996). Existen diversos tipos de efectos citopáticos, en algunos tejidos enfermos aparecen estructuras intracelulares llamadas cuerpos de inclusión en el núcleo o citoplasma de la célula infectada (Baron et al., 1996). Un efecto citopático particularmente característico de algunas infecciones virales es la formación de sincitios o policariocitos; que son grandes masas citoplasmáticas que contienen muchos núcleos y por lo general se producen por la fusión de células infectadas (Baron et al., 1996). Las infecciones por geminivirus tienen como resultado alteraciones en las células, organelos celulares, y la aparición de estructuras celulares asociadas al virus en las plantas enfermas (Stanley et al., 2001), también se ha reportado en varios estudios que los geminivirus regulan el ciclo celular de las células que infectan, lo cual conduce a una progresión anormal a través de la fase-S (Stanley et al., 2001; Gutierrez, 2000). En algunos casos, el efecto citopático está asociado a cambios morfológicos tales como abultamientos o ampollas en las hojas, conocidas como enaciones, enchinamiento de la hoja e hiperplasia, estos síntomas están directamente relacionados al ciclo celular 27 CAPÍTULO II anormal (Hanley-Bowdoin et al., 2013; Gutierrez, 2000). Las enaciones son pequeños tumores que se presentan en el limbo de las hojas infectadas por virus, en algunos géneros como es el caso de los Curtovirus, por ejemplo: la infección del Virus del rizado apical de la remolacha (BCTV) donde se han observado estas alteraciones (Park et al., 2004). En plantas de A. thaliana infectadas con Curtovirus BCTV, se observó la presencia de hiperplasia en células del floema y el aumento de los transcritos de genes marcadores de la mitosis (Park et al., 2004). Recientemente, se ha caracterizado a la proteína C4 como la responsable de la severidad de síntomas en plantas infectadas por Curtovirus (Hanley-Bowdoin et al., 2013). Estudios realizados en plantas transgénicas de A. thaliana y N. benthamiana, indican que la proteína C4 del BCTV y el Virus del rizado apical severo de la remolacha (BSTV) tiene un efecto directo en la inducción de la división celular anormal cuando expresan esta proteína. Por otra parte se identificó que la proteína C2 del BCTV actúa como un reactivador del ciclo celular de las células infectadas y proporciona un entorno favorable para la replicación de geminivirus. Cuando se expresó la proteína C2 en plantas de A. thaliana, se observó el aumento de genes de reentrada del ciclo celular, estos resultados sugirieron que C2 actúa como proteína promotora de la activación del ciclo celular, sin embargo, esto no ocurrió en la infección de A. thaliana con begomovirus monopartita. Estudios del transcriptoma de A. thaliana infectadas con CaLCuV indican que los begomovirus bloquean la fase mitótica e inducen la endorreduplicación activando el ciclo celular de las células que infectan. Por otra parte, se ha reportado que los begomovirus monopartitas, cuando están asociados a genomas satélites de ADN inducen la proliferación y diferenciación celular, produciendo una nueva hoja pequeña que sale de la nervadura central de las hojas de plantas infectadas (Cui, 2004; Idris, 2005). Estudios recientes en plantas de N. benthamiana infectadas con begomovirus bipartitas EuMV-YP, se observó la presencia de hiperplasia en células del mesófilo y el aumento de la expresión de genes marcadores de la mitosis (Gamboa-Tec et al., 2015), sin embargo se desconoce si esta respuesta es dependiente del hospedero, esto es particularmente importante de determinar en virtud de que N. benthamiana es hipersusceptible a infección por virus (Goodin et al., 2008), por tanto los efectos observados en esta planta pudiesen ser un reflejo del hospedero y no del virus. Para saber si EuMV-YP es capaz de inducir la mitosis en otro hospedero se estudiaron los efectos de la infección del EuMV-YP en 28 CAPÍTULO II plantas de S. lycopersicum variedad Saladette. En este capítulo se describe la correlación entre la severidad de síntomas y el efecto citopático observado, particularmente en la inducción de la proliferación celular. 29 CAPÍTULO II 2.2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.2.1 Material vegetal Se utilizaron semillas de tomate (S. lycopersicum) de la variedad Saladette. Las semillas fueron desinfectadas utilizando etanol al 70 % y cloro comercial al 30 %. Las semillas desinfectadas fueron germinadas in vitro en cajas magenta utilizando medio MS (Murashige & Skoog) suplementado con 30 g de sacarosa y vitaminas. Las plantas se inocularon una vez que presentaron dos pares de hojas verdaderas, es decir alrededor de 15 días después de la germinación. Las plantas se mantuvieron a 25 °C + 3 bajo condiciones de fotoperiodo de 16/8 horas-luz/oscuridad en el cuarto de crecimiento del laboratorio. 2.2.2. Inoculación de plantas La inoculación de las plantas se realizó mediante biobalística a alta presión (1100 psi) empleando una cámara Bio-Rad conectada a un tanque de helio. Para ello se prepararon partículas de oro marca Bio-Rad de 0.6 μm. El EuMV-YP fue inoculado utilizando 1 μg de ADN de las clonas infectivas de cada genoma viral (ADN-A y ADN-B) en forma de hemidímeros clonados en pBluescribell SK+ (Villanueva-Alonzo et al., 2013). Se inocularon un total de 20 plantas con EuMV-YP. Como testigo negativo se utilizó el vector vacío, inoculando 10 plantas para diferenciar los posibles efectos ocasionados por el daño mecánico causado por el bombardeo, las plantas inoculadas se mantuvieron in vitro en el cuarto de crecimiento hasta el momento de su análisis. 2.2.3 Seguimiento de síntomas y colecta de material vegetal Se realizó un seguimiento de los síntomas en las plantas inoculadas, los cuales fueron clasificados de acuerdo al grado se severidad, como: asintomáticos, atenuados, moderados y severos. La descripción de los síntomas se resume en el cuadro 2.1. Este seguimiento visual fue acompañado de un registro fotográfico a los 7, 14 y 21 ddi. Al mismo tiempo se colectaron las hojas número 9 y 10 de cada planta a los 14 ddi, enumerándolas a partir de la primera hoja verdadera. 30 CAPÍTULO II Cuadro 2.1 Severidad de síntomas de S. lycopersicum (Gamboa-Tec et al., 2015). Características Descripción Asintomáticas (As) Sin síntomas Atenuada (A) Moderada (M) Mosaicos cloróticos Torsión del margen de la hoja, mosaicos cloróticos, enrollamiento foliar. Torsión del margen de la hoja, mosaicos Severa (S) cloróticos, enrollamiento foliar hacia el envés y retraso de crecimiento 2.2.4 Cortes histológicos Los tejidos foliares colectados se fijaron en solución FAA (10 % formaldehído, 5 % ácido acético, 50 % etanol absoluto) por 72 h a 4 °C. Se removió el fijador y las muestras se deshidrataron a 4 °C tratándolas por tres horas bajo concentraciones crecientes de etanol (30, 50, 70, 80, 90 %), seguido de 3 cambios en etanol absoluto de 3 horas cada uno. Después del tiempo de deshidratación las muestras se empaparon en una mezcla de butanol al 100 % y parafina, se incubaron a temperatura ambiente por un tiempo de 48 h, transcurrido ese tiempo se incubaron a 60 °C haciendo 6 cambios con parafina líquida cada tres horas. Las muestras se colocaron en moldes de aluminio calentados previamente a 60 °C, se le adicionó más parafina y se cubrieron con soportes de plástico. Los moldes se dejaron secar por 4 horas a temperatura ambiente; después de las cuatro horas se eliminó el soporte de aluminio. Se realizaron cortes transversales a un grosor de 5 µm de la región media de la hoja de la planta que presentaron síntomas moderados y severos, así como de las que fueron inoculadas con el vector vacío (testigo negativo). Para ello se emplearon cuchillas de bajo 31 CAPÍTULO II perfil (Thermo Scientific, 1407060) y un micrótomo (modelo HE340E). Los cortes histológicos se colocaron en baño maría con agua a 50 °C para permitir la extensión del corte y luego se colocaron en un portaobjetos, se dejaron secar, incubando a 37 °C por 3 h y luego se mantuvieron a 4 °C hasta su desparafinación. Para retirar la parafina, las laminillas se incubaron a 65 °C por 15 min, después se realizaron tres incubaciones en xileno por 10 min, y una, por 30 min a temperatura ambiente, finalmente se realizó la rehidratación utilizando concentraciones decrecientes de etanol (100, 96, 80, 50 y 30 %) por 5 min. 2.2.5 Tinción con azul de toluidina Se realizó la tinción mediante inmersión en una solución de 2.5 mg/mL de azul de toluidina durante 10 s. El exceso de colorante se retiró incubando por 10 s con agua desionizada seguido por un lavado con etanol (100 % por 30 s) y finalmente uno con agua (por 10 s). 2.2.6 Captura de imágenes y análisis de medición Utilizando toda la longitud del corte transversal de la hoja, se seleccionaron cuatro regiones para realizar las mediciones del grosor de la lámina foliar y las dimensiones de la nervadura central (Figura 2.1). Para realizar el registro de las imágenes se tomaron varias fotografías con el fin de cubrir el corte transversal completo de cada planta estudiada (Figura 2.1). Las imágenes se capturaron utilizando una cámara INFINITY acoplada a un microscopio estereoscopio NIKON modelo ECLIPSE utilizando el objetivo 4X para seleccionar los portaobjetos y luego analizar las regiones de interés de los cortes, posteriormente se utilizó el microscopio estereoscopio NIKON modelo ECLIPSE E200 utilizando el objetivo 5X, el cual fue previamente calibrado utilizando una regla milimétrica. Para el grosor de la lámina foliar se midieron cuatro puntos del corte transversal, incluyendo tanto regiones cercanas a las nervaduras centrales como hacia las regiones proximales al margen de la hoja. De igual forma se contó el número de células por µm2 en cuatro puntos de la lámina foliar (Figura 2.1) utilizando el software INFINITY ANALYSIS versión 5.0.3 (Lumera corporation) disponible en línea. 32 CAPÍTULO II Figura 2.1 Ejemplo del corte transversal de una hoja sana de S. lycopersicum, armado a partir de varias fotografías. Las líneas punteadas indican las inserciones de las fotos, las flechas indican las regiones seleccionadas para las mediciones del grosor de la lámina foliar y de la nervadura central. NC; nervadura central, EL; fragmentos laterales, CB; regiones más cercanas a los márgenes de la lámina foliar. Imágenes capturadas con objetivo 4X. 33 CAPÍTULO II 2.3 RESULTADOS 2.3.1 Síntomas evaluados en plantas inoculadas con EuMV-YP Se inocularon 20 plantas de tomate variedad Saladette con EuMV-YP y 10 con el vector vacío como testigo negativo A partir de los siete días después de la inoculación se observaron síntomas atenuados, moderados y severos de acuerdo a lo reportado previamente (Gamboa-Tec et al., 2015). En este trabajo de tesis se obtuvieron en total dos plantas asintomáticas, siete con síntomas atenuados, cinco con síntomas moderados y seis con síntomas severos (Cuadro 2.3). Cuadro 2.2 Resultado de la severidad de síntomas observados en plantas inoculadas con EuMV-YP a los 21 ddi. Se evaluó la proporción y el porcentaje de infección observado y los resultados se 34 CAPÍTULO II presentan en el Cuadro 2.3. La mayor severidad de síntomas de EuMV-YP se presentó a los 14 ddi, obteniéndose cinco plantas con infección severa de las 20 plantas inoculadas. Entre los síntomas observados en las plantas con infección severa fueron: mosaicos cloróticos en las hojas, enrollamiento y torsión del margen de la hoja y retraso del crecimiento. Posteriormente se observó una reducción en la severidad de síntomas a los 21 ddi ya que solo una planta presentó síntomas severos. No fue necesario evaluar el porcentaje de severidad a los 7 ddi ya que la mayoría de las plantas eran asintomáticas o con síntomas atenuados. Cuadro 2.3 Síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum. As; Asintomáticas, A: Atenuadas, M: Moderadas, S: severas, ddi: días después de la infección. La infección viral se monitoreó hasta los 21 ddi, las plantas asintomáticas y las que presentaron síntomas atenuados a los 7 ddi, incrementaron su severidad a los 14 y 21 ddi. Entre los síntomas identificados en las plantas inoculadas con EuMV-YP se pudieron observar: mosaicos en el plano de la hoja, deformación en los márgenes de las hojas, enrollamiento hacia el envés de la hoja (figura 2.2), tal como fue reportado anteriormente (Gamboa-Tec et al., 2015). 35 CAPÍTULO II Figura 2.2 Ejemplo de síntomas producidos por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum cultivadas bajo condiciones in vitro. Planta sana número N-1 (A-C). Planta con síntomas severos número N-6 (D-F) Las plantas que presentaron síntomas severos como mosaicos en el plano de la hoja, deformación en los márgenes de las hojas, enrollamiento hacia el envés de la hoja, abultamientos (enaciones) en las hojas, también se pudo observar que presentaron alteraciones en el desarrollo de la planta, como el retraso de crecimiento (internodos cortos) (Figura 2.3). La planta SEVERA-7 mostró un enrollamiento completo en el borde de las hojas (Figura 2.3 B) a diferencia de la planta SEVERA-1 y SEVERA-5 (Figura 2.3 C-D). El mayor grado de severidad de síntomas se observó a los 21 ddi. 36 CAPÍTULO II Figura 2.3 Retraso del crecimiento en S. lycopersicum ocasionado por EuMV-YP. Las plantas con síntomas severos de EuMV-YP a los 21 ddi mostraron deformaciones de los peciolos y reducción de los internodos. Planta sana (A), diferentes plantas con síntomas severos (B-D): (B) SEVERA-7, (C) SEVERA-1, (D) SEVERA-5. 2.3.2 Alteraciones producidas por EuMV-YP Para identificar los posibles efectos en la arquitectura tisular, es decir, cambios anatómicos ocasionados por EuMV-YP en las plantas de S. lycopersicum se compararon reconstrucciones de cortes histológicos completos de plantas que presentaban síntomas moderados y severos a los 14 ddi (tres plantas para cada caso) con las plantas testigo (Figura 2.4). Se observaron cambios en la forma, tamaño y organización celular. En la planta seis, que presentó síntomas severos, se observó una nervadura lateral muy cerca a la nervadura central, sin embargo, no se lograron observar las demás nervaduras laterales (Figura 2.4 B); por el contrario, en la planta sana, se observan adecuadamente las estructuras de las nervaduras laterales (Figura 2.4 A). Otras plantas con síntomas severos presentaron cambios en la epidermis inferior y engrosamiento en las regiones cercanas al borde de hoja (Figura 2.4 C). 37 CAPÍTULO II Figura 2.4 Reconstrucción de cortes transversales de hojas de S. lycopersicum inoculadas con EuMV-YP. Planta sana (A), planta con síntomas severos (B-C). los número y las líneas indican la inserción de las fotos para la reconstrucción del corte. Imágenes capturadas con objetivo 4x. 2.3.3. Distorsiones en las nervaduras Uno de los efectos más notorios observados fue un mayor desarrollo en las nervaduras centrales de las plantas que presentaron síntomas moderados y severos (Figura 2.5), también se observaron cambios en la forma, tamaño y número de células en las plantas con infección severa. La planta SEVERA-1 mostró hipertrofia en las células del mesófilo provocando un alargamiento en el área vascular (Figura 2.5 F), a diferencia de la 38 CAPÍTULO II SEVERA-7 donde se observó hiperplasia en las células del haz vascular y deformación en las células de parénquima en empalizada (Figura 2.5 E). Las plantas SEVERA-5 y SEVERA-6 presentaron engrosamiento en la parte lateral de la nervadura (Figura 2.4 B). Las plantas con síntomas moderados, no presentaron daños significativos, sin embargo, se pudo observar un incremento en el tamaño de las células de mesófilo (Figura 2.5 C-D) comparado con el de la planta sana (Figura 2.5 A-B). Figura 2.5 Alteraciones en la nervadura foliar causada por EuMV-YP en S.lycopersicum. Sección de nervaduras centrales, plantas sanas (A-B), nervaduras con síntomas de infección moderada (C-D), nervadura central de plantas con infección severa con alteraciones en el tamaño y forma de las células (E-F). Imágenes capturadas con objetivo 5X. Barra de medición de 100 µm. 39 CAPÍTULO II Utilizando el software INFINITY ANALYSIS, se midió la longitud (grosor y altura) de las nervaduras centrales de las hojas de plantas con síntomas moderados y severos, comparando con la planta sana. Las plantas con síntomas moderados presentaron un tamaño similar a la nervadura central de las hojas de plantas sanas, sin embargo, cuando se analizaron las nervaduras de las hojas de plantas con síntomas severos se observó un incremento notorio en comparación con la planta sana (Cuadro 2.4) . Cuadro 2.4 Tamaño de la nervadura central de las plantas inoculadas con EuMV-YP. Las alteraciones en las nervaduras también se observaron en las nervaduras laterales de plantas con síntomas moderados y severos. Las nervaduras laterales de las plantas con síntomas severos mostraron alteraciones morfológicas en el área vascular, ocasionando deformación de la nervadura (Figura 2.6 E-F), comparada con las hojas de plantas sanas (Figura 2.6 A-B). En la nervadura lateral de la hoja de la planta SEVERA-1 (Figura 2.6 F) se observó un incremento en el tamaño de las células del mesófilo, y este mismo fenotipo 40 CAPÍTULO II se observó en la nervadura central (Figura 2.5 F). En el extremo izquierdo de la nervadura lateral de la hoja de la planta SEVERA-7 se observó la presencia de hiperplasia y cambios morfológicos en las células del parénquima en empalizada, también se observó un cambio dramático en la forma y tamaño de las células del parénquima esponjoso. La presencia de hiperplasia en las células del parénquima en empalizada dificultó la observación del área vascular; también se observaron cambios en las células de la parte abaxial de la hoja, que posiblemente corresponden a la epidermis, sin embargo su forma está tan alterada que es difícil de aseverarlo (Figura 2.6 E). En las nervaduras laterales de las hojas de las plantas MODERADAS 4 y 12 se observaron cambios en las forma, tamaño y disposición de las células del parénquima en empalizada (Figura 2.6 C-D) e hipertrofia en las células del colénquima (Figura 2.6 C). Figura 2.6 Alteraciones en las nervaduras laterales de las hojas de S. lycopersicum inoculadas con EuMV-YP. Nervadura lateral planta sana (A-B), nervadura lateral planta con síntomas moderados (C-D), nervaduras laterales de plantas con síntomas severos (E-F). Imágenes capturadas con objetivo 5X. Barra de medición 100 μm. 41 CAPÍTULO II 2.3.4 Alteraciones en la región proximal al margen de la hoja e hiperplasia Las alteraciones en la estructura tisular también se observaron en las regiones proximales al margen de la hoja de las plantas con infección severa (Figura 2.7). En la región proximal al margen de la hoja de la planta SEVERA-1 (Figura 2.7 B) se observó un incremento en las células del parénquima empalizada en comparación con la sana, en la cual dicha organización está formada de una capa simple de células epidérmicas en cada extremo de la lámina foliar, una capa anticlinal de células del parénquima empalizada y de 4 a 5 capas de células poco uniformes (células alargadas y redondas) que conforman el parénquima esponjoso (Figura 2.7 A). La región proximal al margen de la hoja de la planta SEVERA-6 presentó hiperplasia (Figura 2.7 C), y en la región proximal al margen de la hoja de la planta SEVERA-7 se observaron cambios en la forma de la célula del parénquima empalizada y deformación en la epidermis inferior de la hoja (Figura 2.7 D). La región proximal al margen de la hoja de las plantas con síntomas moderados no presentó cambios observables en su estructura y arquitectura tisular. Figura 2.7 Alteraciones del EuMV-YP en la región próxima al margen de la hoja en S. lycopersicum. Alteraciones morfológicas en las células de las plantas con síntomas severos. La región proximal al margen de la hoja de las plantas con síntomas severos (B-D), comparados con las de una planta sana (A). Imagen capturada al objetivo 5x. Barra de medición 100 µm. De acuerdo a los resultados de las mediciones del grosor de la lámina foliar, las plantas sanas presentaron un grosor uniforme, en contraste al de las plantas con síntomas moderados y severos, de la cuales las plantas con síntomas severos presentaron un mayor incremento de dichas láminas foliares. Al realizar un análisis estadístico t Student de las dimensiones del grosor de la lámina foliar de plantas sanas comparado con el de las plantas que presentaron síntomas severos se puede concluir que estas diferencias son significativas [P (T<=t) = 0.009290] (cuadro 2.5). 42 CAPÍTULO II Cuadro 2.5 Análisis estadístico de las mediciones del grosor de la lámina foliar en S. lycopersicum, plantas sanas y plantas inoculadas con EuMV-YP. Columna 1 Media Varianza Observaciones P(T<=t) dos colas Valor crítico de t (dos colas) SANA 99.1667 97.4242 12.0000 0.009290 2.2010 SEVERA 123.333333 405.151515 12 En el mesófilo de dos de las seis plantas con infección severa se observó proliferación celular (hiperplasia), a diferencia de las plantas sanas que mostraron un número y tamaño normal de células (Cuadro 2.6). Se cuantificó el número de células en dos regiones afectadas y en dos de aspecto normal, tanto en tres plantas sanas como en las dos que presentaron hiperplasia. La planta SEVERA-5 presentó hiperplasia en el parénquima en empalizada (Figura 2.8-B). La SEVERA-7 presento hiperplasia tanto en el parénquima en empalizada como en el esponjoso (Figura 2.7-C), y mayor proliferación celular (Cuadro 2.7); también presentaron distorsiones en la parte abaxial, en lo que parecen ser células de la epidermis inferior, pero también es posible que se deba a la proliferación celular en el colénquima o parénquima esponjoso (Figura 2.7). Figura 2.8 Cambios en la arquitectura tisular e hiperplasia en S. lycopersicum inducidos por la inoculación con EuMV-YP. Sección transversal de hoja sana (A) con síntomas virales severos (B-C). Mesófilo de plantas sanas (A), mesófilo con desorden celular en el parénquima empalizada (B) y en el parénquima esponjoso (C). Imágenes capturadas al objetivo 5X. MP; parénquima en empalizada, ME; parénquima esponjoso, ES; epidermis superior, EI; epidermis inferior. Barra de medición 100 μm. 43 CAPÍTULO II Cuadro 2.6 Número de células por micrómetro cuadrado en el mesófilo de plantas de tomate inoculadas con EuMV-YP. -; Región normal +; Región con alteración moderada ++; Región con alteración severa 44 CAPÍTULO II 2.4. DISCUSIÓN En este trabajo se observó que EuMV-YP produce alteraciones en las nervaduras centrales de las hojas de plantas con síntomas severos, aumentando el tamaño de la nervadura, también se observaron cambios en las células del mesófilo como hiperplasia e hipertrofia. En estudios anteriores se había reportado que el EuMV-YP ocasionaba alteraciones en la nervadura central en plantas de N. benthamiana, los efectos observados fueron: distorsiones en nervaduras de plantas con síntomas moderados y severos, reducción del haz vascular, disminución del número de células del colénquima y células epidérmicas de mayor tamaño. Los síntomas observados en este trabajo son similares a los reportados en N. benthamiana, sin embargo, en las plantas de N. benthamiana se observó mayor severidad (Gamboa-Tec et al., 2015). El EuMV-YP ocasionó hiperplasia en las células del mesófilo de S. lycopersicum, lo cual resulta interesante ya que este síntoma no se había observado anteriormente en plantas infectadas con geminivirus bipartitas. Sin embargo, se ha visto que tanto los Curtovirus como Begomovirus bipartitas pertenecientes a la familia Geminiviridae son capaces de reprogramar el ciclo celular completo, es decir inducir la mitosis y producir hiperplasia (Hanley-Bowdoin et al., 2013). La hiperplasia inducida por geminivirus se reportó por primera vez en plantas de Beta vulgaris infectadas con el BCTV, un geminivirus perteneciente al género Curtovirus (Park et al., 2004). EuMV-YP es un virus de ADN que requiere división celular activa para tener disponibles los elementos necesarios para poder replicarse, por lo que posiblemente presente algún mecanismo que induzca la hiperplasia. Se ha demostrado que la proteína viral C4 de los curtovirus está involucrada en la inducción de la hiperplasia, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis y N. benthamiana que sobre expresaban la proteína C4 de BCTV, en las cuales se observó hiperplasia y enaciones (ampollas) características de las plantas infectadas con BCTV (Latham et al., 1997).También la proteína C2 de este virus influye en la inducción de la expresión de genes del ciclo celular que conducen a la replicación del ADN viral (LozanoDuran et al., 2012). Sin embargo, estas proteínas son filogenéticamente distintas de las ortólogas en los begomovirus bipartitas (Fondong, 2013). 45 CAPÍTULO II Previamente se observó que las plantas de N. benthamiana infectadas con EuMV-YP con síntomas moderados y severos presentaron hiperplasia en el tejido foliar (Gamboa-Tec et al., 2015). En el presente trabajo de un total de 20 plantas de S. lycopersicum inoculadas con EuMV-YP, seis presentaron infección severa a los 21 ddi, de las cuales únicamente dos presentaron hiperplasia. Ninguna de las plantas con síntomas moderados presentó este mismo fenotipo. El grado de hiperplasia observada en plantas de S. lycopersicum fue del 30% en comparación con N. benthamiana que fue del 50 %, en donde se pudo observar hiperplasia en plantas que presentaron síntomas moderados y severos (Gamboa-Tec et al., 2015). Esta diferencia pudiese deberse a que N. benthamiana tiene mayor susceptibilidad a infecciones virales. Por otra parte, con base en el análisis estadístico se observaron diferencias significativas en las mediciones del grosor en las láminas foliares de las plantas sanas con respecto a las plantas con síntomas severos. Igual que en N. benthamiana, en S. lycopersicum la hiperplasia se presentó en regiones discretas y no en toda la longitud del corte de la lámina foliar (Gamboa-Tec et al., 2015). Sin embargo la proporción observada, tanto de plantas moderadas como de plantas severas con hiperplasia fue menor para el caso de S. lycopersicum. Mientras que en N. benthamiana si se encontraron plantas con síntomas moderados que presentaron hiperplasia, esto no se observó en S. lycopersicum. Con base en estos resultados, se pudiera considerar que la inducción de la proliferación celular por EuMV-YP está determinada por componentes genéticos del virus, ya que este fenotipo ha sido observado en dos especies diferentes de plantas (N. benthamiana y S. lycopersicum). Es probable que EuMV-YP induzca la división celular empleando mecanismos moleculares similares a los de los Curtovirus, por ejemplo BCTV. 46 CAPÍTULO II BIBLIOGRAFÍA Baron, S., T. Albrecht, M. Fons, I. Boldogh y A. S. Rabson (1996). Effects on Cells. Brown, J. K., J. A. Khan y J. Dijkstra (2002). The molecular epidemiology of begomoviruses. Plant viruses as molecular pathogens, 279-315. Cui, X., X. Tao, Y. Xie, C. M. Fauquet y X. Zhou (2004). A DNA-B associated with Tomato yellow leaf curl China virus is required for symptom induction. Journal of Virology, 78, 13966-13974. Fondong, V. N. (2013). Geminivirus protein structure and function. Molecular plant pathology, 14, 635-649. Gamboa-Tec, N., A. Ku-Gonzalez, L. Pacheco-Gutierres, E. Castaño de la Serna y L. A. López-Ochoa (2015). Euphorbia mosaic virus Yucatan Peninsula to the mesophyll of infected Nicotiana benthamiana plants inducing hyperplasia, cell shape and tissue structure alterations. Gen Mol Res 4: en prensa, Goodin, M. 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Biotechnology letters, 35, 811-823. 48 CAPÍTULO III CAPÍTULO III EuMV-YP INDUCE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS A LA MITOSIS EN S. lycopersicum 3.1 INTRODUCCIÓN El ciclo celular eucariota es controlado por la acción ordenada de un complejo de proteínas compuestas de una subunidad catalítica denominada cinasa dependiente de ciclina (CDK) y elementos reguladores positivos nombrados ciclinas. La asociación de cierta CDK con una ciclina, determina la actividad del complejo, su estabilidad, localización y especificidad de sustrato (Renaudin et al., 1996). Las proteínas de los geminivirus propician un ambiente celular favorable para la replicación del ADN utilizando la maquinaria de la célula que infectan, para ello reprograman la entrada al ciclo celular de la células diferenciadas que infectan (HanleyBowdoin et al., 2013; Gutierrez, 2000). Los miembros de los géneros Begomovirus y Mastrevirus inducen la reentrada al ciclo celular, activando la fase de síntesis (S) pero en vez de continuar con la mitosis, las células entran a un estado de endociclo, mientras que los pertenecientes al género Curtovirus inducen el ciclo celular completo, es decir concluyen la mitosis (Hanley-Bowdoin et al., 2013; Fondong, 2013). En las plantas de A. thaliana infectadas por BCTV y BSTV, que son especies del género Curtovirus, se observó el aumento de los transcritos de genes marcadores de la mitosis (CDK1) y la presencia de hiperplasia (Park et al., 2004). Por otra parte se encontró que la infección con el virus del enrollamiento foliar de la col (CaLCuV) especie del género begomovirus, causó el aumento de la expresión de los transcritos de los genes de la fase S/G2 y la inhibición de transcritos involucrados en la fase M/G1 del ciclo celular. Resultados similares se observaron en este mismo hospedero infectado con Virus sudafricano del mosaico de la Yuca (SACMV) otro virus perteneciente al género begomovirus (Pierce y Rey, 2013). Estos y otros resultados indican que los begomovirus bipartitas bloquean la fase mitótica e inducen la endorreduplicación de las células infectadas. Sin embargo, en estudios recientes de nuestro grupo de trabajo se observó 49 CAPÍTULO III que el begomovirus bipartita EuMV-YP, induce la expresión de los transcritos de genes que codifican proteínas involucradas en la mitosis, tales como CYCA1, CYCA2 y CDKB2 a los 15 y 21 ddi en plantas de N. benthamiana (Gamboa-Tec et al., 2015). En este capítulo se describen los resultados de la investigación tendientes a elucidar si EuMV-YP es capaz de inducir la expresión de los genes tales como: CDKB1 y CDBK2, que son considerados marcadores de la mitosis en plantas de S. lycopersicum, así como del gen PCNA. Estos resultados constituyen un complemento importante al hallazgo de la inducción de la proliferación celular en plantas de tomate que se presentan en el capítulo II. 50 CAPÍTULO III 3.2 MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.1 Material vegetal Se colectaron las hojas verdadera #9 y 10 de plantas de S. lycopersicum inoculadas con EuMV-YP a los 14 ddi, así como de plantas inoculadas con el vector vacío, tal como se describió en el capítulo anterior. Se pesaron 100 mg de tejido foliar de tres plantas que presentaron síntomas moderados, tres con síntomas severos, así como de tres plantas sanas, este material se envolvió en papel aluminio, se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso. 3.2.2 Extracción de ARN de tejido foliar de S. lycopersicum. Para la extracción ARN total se utilizó tejido foliar congelado, se realizó un pool de 3 plantas sanas, 3 con síntomas moderados y 3 plantas con síntomas severos. Se pulverizaron 100 mg de tejido con nitrógeno líquido en un mortero, el macerado fue depositado en un tubo de microcentrífuga. La extracción de ARN se realizó utilizando un estuche comercial (RNeasy plant mini kit, QIAGEN) siguiendo las recomendaciones del fabricante, e incluyendo un tratamiento con 10 U de DNAsa I (Invitrogen), la pastilla se resuspendió en 25 µL con agua desionizada estéril. El ARN total obtenido se cuantificó en un espectrofotómetro tipo Nanodrop (Thermo Scientific, modelo 2000C) y mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % teñido con GelRed (Biotium). Se distribuyó en 5 alícuotas de 5 µL y se almacenó en congelación a 80 °C hasta su uso. 3.2.3 RT-PCR La síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó a partir de 250 ng de ARN total con 0.5 µL de oligo DT, 4 µL de una mezcla de dNTPs a una concentración de 10 mM en un volumen total de reacción de 16 µL. Una vez realizada la mezcla de reacción se incubaron a 70 °C por 5 minutos para la desnaturalización, posteriormente se colocó en hielo por 1 minuto. Se añadió la segunda mezcla de reacción que contenía 200 U de transcriptasa reversa, 2 µL de amortiguador RT 10X, 2 U de inhibidor de RNAsa (New England 51 CAPÍTULO III BioLabs), la mezcla de reacción se llevó a un volumen de 20 µL. Se realizó una incubación por 1 hora a 42 °C y 5 minutos a 80 °C. Una vez concluida esta incubación la reacción se ajustó a un volumen de 50 µL. El ADNc obtenido se almacenó a -20 °C. Para la síntesis de la segunda cadena de ADNc se utilizaron los cebadores específicos previamente reportados para los genes CDKB1 y CDKB2 de tomate (Joubés et al., 2001), como testigo se utilizaron cebadores para los genes PCNA (Pasumarthy et al., 2011) y Actina de tomate (Correa-Aragunde et al., 2006) (Cuadro 3.1). Se preparó la mezcla de reacción de PCR con los siguientes componentes; 20 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de mezcla de dNTPs, 2.5 µL de amortiguador thermopol 10X, 1.25 U de Taq DNA polimerasa y 2 µL de la primera cadena de ADNc, la mezcla de reacción se llevó a un volumen final de 25 µL. Cuadro 3.1 Secuencia de cebadores para el análisis de expresión genética. GEN SECUENCIA 5’GCTAAACCAATCAATCAAGCTT3’ CDKB1 5’CTATGGCAGTGAGCAACCC3’ 5’GGAGGCTGCTAAAAATGCTG3’ CDKB2 5’GTATAAGCTCTGCCAAGTCC3’ 5´GTTCTAGAATCGATTAAGGATC3’ PCNA 5’CCATTAGCTTCATCTCAAAATC3’ 5’AAGAGCTATGAGCTCCCAGA3’ Actina 5’TAATCTTCATGCTGCTAGGAG3’ 52 CAPÍTULO III Se realizaron las amplificaciones del ADNc utilizando diferentes condiciones de temperatura. El programa de la reacción de PCR para analizar la expresión del gen que codifica a la actina constó de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a 57 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 25 segundos. Para el gen CDKB1 se utilizó 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a 54 por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos. Para el gen CDKB2 se utilizó 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a 56 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos. Para el gen PCNA se utilizó 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, alineamiento a 57 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos. El ADN obtenido se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se corrió a 60 volts por 50 minutos. 53 CAPÍTULO III 3.3 RESULTADOS 3.3.1 Extracción de ARN Total Se extrajo ARN total de las muestras colectadas a los 14 ddi y se midió la absorbancia a 260/280 nanómetros para medir la concentración y pureza del ARN obtenido (Cuadro 3.3). Cuadro 3.2 Cuantificación del ARN total obtenido Muestra Concentración Absorbancia [ng/μL] 260/280 Sana 134.9 2.16 Moderada 55.2 2.17 Severa 1524.9 2.12 Las extracciones se encontraron en el rango óptimo de pureza y se obtuvo un patrón similar en todos los ARN obtenidos, con la salvedad de que en el ARN de las plantas con síntomas moderados se obtuvo menor concentración (Cuadro 3.3). Para verificar la integridad del ARN total aislado se corrió un gel de agarosa (Figura 3.1) donde se observa que en las plantas con síntomas severos presentaron una ligera degradación comparado con las plantas sanas y las plantas con síntomas moderados. 54 CAPÍTULO III Figura 3.1 Muestras de ARN total de los explantes foliares de S. lycopersicum de plantas sanas, con síntomas moderados y severos a los 14 ddi. Gel agarosa 1 %, 80 volts/40 min. SA; Planta sana, M; Planta con síntomas moderada, S; planta con síntomas severos. 3.3.2 Perfiles de expresión para los genes CDKB1, CDKB2, PCNA y Actina Para comprobar si EuMV-YP provoca cambios en la expresión de los genes que regulan la entrada a la mitosis y por tanto pudieran tener una relación con la hiperplasia observada en el capítulo anterior, se realizó el perfil de expresión de dos genes marcadores de la mitosis: CDKB1 y CDKB2 (Joubés et al., 2001). Como resultado se observó el aumento en la expresión de ambos genes en las plantas con síntomas moderados y severos en comparación con la expresión en plantas sanas, en las cuales se obtuvo una expresión basal apenas detectable de estos genes mediante electroforesis en el gel de agarosa (Figura 3.2). Las plantas con síntomas severos presentaron mayor expresión de los genes de la mitosis, en comparación con las plantas con síntomas moderados. Por su parte, PCNA es una proteína que interviene en el ciclo celular participando en la 55 CAPÍTULO III fase de síntesis, sin embargo se ha visto que ciertos geminivirus inducen su expresión para activar el ciclo celular de su hospedero y poder replicarse. En este trabajo se observó la expresión de PCNA tanto en plantas sanas como en moderadas y severas, sin embargo, se observó un incremento significativo en su expresión en las plantas con síntomas severos. El gen constitutivo que codifica para actina se utilizó como testigo de carga, y como se esperaba se observó el mismo nivel de expresión en plantas sanas, moderadas y severas. Figura 3.2 El EuMV-YP aumenta la expresión de genes asociados a la mitosis. RT-PCR de los genes CDKB1, CDKB2, PCNA, Actina en plantas sanas, moderadas y severas de S. lycopersicum a los 14 ddi. 56 CAPÍTULO III 3.4 DISCUSIÓN En este trabajo se estudió la infección causada por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum se observó un incremento en la expresión de los transcritos de los genes CDKB1 y CDKB2, en plantas de S. lycopersicum que presentaron síntomas moderados y severos y como se presentó en el capítulo anterior, se observó una respuesta de hiperplasia en las plantas con síntomas severos. Previamente, en plantas de N. benthamiana infectadas con EuMV-YP se observó un aumento de la expresión de los genes CYCA1, CYCA2 y CDKB2, cuya expresión se incrementa al inicio de la mitosis y que por lo tanto son considerados marcadores de la mitosis; estos cambios de expresión genética se asocian con la inducción de hiperplasia (Gamboa-Tec et al., 2015). Los resultados de este trabajo confirman los resultados previamente observados en plantas de N. benthamiana en un hospedero distinto, por lo que sugiere que EuMV-YP contiene elementos genéticos en su genoma para inducir la proliferación celular. Esta respuesta es similar a la de los curtovirus, con la diferencia de que en las infecciones causadas por los curtovirus la hiperplasia ocurre en las células de los haces vasculares particularmente las asociadas al floema (Park et al., 2004; Latham et al., 1997); mientras que la hiperplasia causada por EuMV-YP ocurre en el parénquima en empalizada y esponjoso (Gamboa-Tec et al., 2015). El curtovirus BCTV induce la expresión del gen del ciclo celular CDKB1 en plantas infectadas de A. thaliana (Park et al., 2004). Sin embargo, en este mismo hospedero, infectado con el Begomovirus bipartita CaLCuV, se observó el aumento de la expresión de genes de la transición entre las fases S y G2 (S/G2) y la disminución de la expresión de genes de la transición entre la Mitosis y la fase G1 (M/G1) del ciclo celular (Ascencio-Ibáñez et al., 2008). El EuMV-YP es el primer begomovirus bipartita reportado que induce la expresión de genes asociados con la activación de la mitosis en las plantas infectadas. Nuestros resultados sugieren que el EuMV-YP comparte mecanismos moleculares con el curtovirus BCTV, por lo que representa un modelo interesante para el estudio de genes celulares implicados en las infecciones virales en las plantas. Por otra parte, también se analizó la expresión del gen PCNA, observándose la expresión basal en plantas sanas y en las que presentaron síntomas moderados, sin embargo, se obtuvo un aumento notorio de su expresión en las plantas con síntomas severos. PCNA es una proteína multifuncional, que participa en la fase S del ciclo celular, cuya expresión 57 CAPÍTULO III a nivel de transcritos permanece reprimida en células diferenciadas (Pasumarthy et al., 2011; Keiman, 1997), sin embargo se ha observado que los geminivirus inducen su expresión. También se sabe que las proteínas REn del TGMV y Rep del Virus del rizado amarillo del tomate aislado Sardina (TYLCSV), ambos begomovirus interactúan con la proteína PCNA del tomate durante la infección para inducir la replicación del ADN cromosómico y viral en la planta hospedera (Castillo et al., 2003). Al estudiar mecanismos de replicación por círculo rodante se observó que PCNA es responsable del número de copias de ADN viral dentro de las plantas hospederas infectadas (Bagewadi et al., 2004). Por tanto, los resultados de este trabajo sobre la inducción en la expresión del gene de PCNA por EuMV-YP en plantas de tomate que presentaron síntomas severos de infección, fueron los esperados. No obstante, se esperaba una mayor inducción en las plantas con síntomas moderados; la falta de activación en la expresión de este gen puede deberse a que se colectó el material a los 14 ddi, que fue una etapa tardía en la infección. Para resolver este problema se deberían hacer ensayos de expresión del gen PCNA en plantas a los 7 y 9 ddi como se realizó para otros geminivirus (Pierce y Rey, 2013; Ascencio-Ibáñez et al., 2008). Por lo tanto, los resultados obtenidos en el capítulo III, sugieren que EuMV-YP es capaz de inducir la proliferación celular, por lo que éste aislado viral debe contener elementos genéticos en su genoma para generar esta respuesta en el hospedero. En este sentido, la respuesta inducida por EuMV-YP es similar a la de los Curtovirus y Begomovirus monopartitas. 58 CAPÍTULO III BIBLIOGRAFÍA Ascencio-Ibáñez, J. T., R. Sozzani, T. J. Lee, T. M. Chu, R. D. Wolfinger, R. Cella y L. Hanley-Bowdoin (2008). 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Plant cyclins: a unified nomenclature for plant A-, B-and D-type cyclins based on sequence organization. Plant molecular biology, 32, 1003-1018. 60 CAPÍTULO IV CAPÍTULO IV CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS 4.1 CONCLUSIONES GENERALES EuMV-YP es capaz de provocar síntomas severos como abultamientos, enrollamientos y retraso del crecimiento en plantas de S. lycopersicum. EuMV-YP causa cambios en la arquitectura tisular en las hojas de S. lycopersicum con síntomas moderados y severos. EuMV-YP induce hiperplasia en células del mesófilo en plantas de S. lycopersicum con síntomas severos. La proliferación observada, esta correlacionada con la inducción de la expresión de genes marcadores de la mitosis. EuMV-YP que es un begomovirus bipartita, debe contener determinantes genéticos para inducir la mitosis en plantas infectadas. 61 CAPÍTULO IV 4.2 PERSPECTIVAS En este trabajo se estudió el efecto citopático y la expresión de los genes marcadores de la mitosis causado por EuMV-YP en plantas de S. lycopersicum. Como resultado se reportó que este virus fue capaz de causar proliferación celular en plantas infectadas que presentaron síntomas severos. Igualmente se observó un incremento en la expresión de genes del ciclo celular que participan en la inducción de la mitosis. Los resultados observados en este trabajo confirman lo previamente observado en N. benthamiana corroborando que este virus se comporta de manera diferente a otros begomovirus bipartitas, por lo que sería de gran interés utilizar esté mismo virus como modelo para: Caracterizar el efecto citopático en plantas de E. heterophilla y D. stramonium para verificar si se presenta el mismo efecto en el hospedero natural. Realizar pruebas moleculares cuantitativas como PCR en tiempo real, para medir la expresión de los transcritos de los genes del ciclo celular de la fase mitótica. Así como en etapas tempranas de la infección, a los 7 y a los 9 ddi. Caracterizar el efecto citopático en otros órganos de la planta con infección severa ocasionado por EuMV-YP. Identificar si otro aislado de EuMV (Jalisco, Cuba, Puerto Rico, etc.) causa efecto citopático similares a los producidos por EuMV-YP. 62