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CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO
CON LOS SÍNTOMAS DE MOTEADO AMARILLO DE LA OKRA
(Abelmoschus esculentus) EN MÉXICO
CHARACTERIZATION OF A NEW GEMINIVIRUS ASSOCIATED WITH
OKRA (Abelmoschus esculentus ) YELLOW MOTTLE SYMPTOMS IN MÉXICO
Rodolfo De La Torre-Almaráz1, Alejandro C. Monsalvo-Reyes1, Jesús Méndez-Lozano2 y Rafael F. Rivera-Bustamente3
1
Unidad de Biotecnología y Prototipos. ENEP-Iztacala.UNAM. México, D. F. Apartado Postal 54090.
([email protected]). 2CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. Apartado Postal 280, Guasave, Sinaloa.
3
CINVESTAV-IPN-IRAPUATO. Km 9.5 Carr. Irapuato-León. Guanajuato.
RESUMEN
ABSTRACT
En 2000 y 2001, en campos de producción de okra (Abelmoschus
esculentus (L.) Moench) en los Estados de Guerrero y Morelos, se
observó una enfermedad que causa un rayado amarillo y distorsión severa del fruto, moteado y mosaico amarillo brillante, distorsión y reducción del tamaño de hojas. En algunas ocasiones y
en pocas plantas de okra con síntomas, se logró identificar variantes de los virus AMV, TBSV, INSV y a un potyvirus desconocido, por transmisión mecánica en plantas indicadoras y diferenciales, así como por ensayos serológicos ELISA. Sin embargo, ninguno de ellos causó síntomas visibles en plantas de okra sanas en
pruebas de transmisión mecánica, sugiriendo que estos virus de
ARN no son responsables de la sintomatología observada en campo. El injerto de plantas de okra enfermas a plantas sanas, causó
síntomas de rayado en fruto y moteado foliar, confirmando la presencia de un agente patogénico no transmisible de manera mecánica pero sí por injerto. El injerto de segmentos de plantas de
Datura stramonium y Capsicum annuum previamente inoculadas
por biobalística, utilizando ADN total procedente de plantas de
okra enfermas, causó rayado y moteado amarillo en plantas de
okra sanas sugiriendo la presencia de un virus de ADN. El análisis de hibridación tipo Dot blot, usando una sonda general (gen de
la proteína de la cápside del Pepper huasteco virus) y el ensayo de
PCR (utilizando oligonucleótidos degenerados para amplificar el
gen de la proteína de la cápside), confirmaron la presencia de un
geminivirus en todas las plantas de okra con los síntomas de moteado amarillo procedentes de campo y de las injertadas en el
invernadero. Un fragmento de ADN viral de 632 bp, obtenido de
los ensayos de la PCR, fue clonado y secuenciado (Número de
acceso AF349113). El análisis de la secuencia sugiere que este virus es un nuevo begomovirus que muestra relaciones filogenéticas
con el Squash leaf curl virus y el Sida golden mosaic virus. Se sugiere el nombre de Okra yellow mottle virus (OYMV) para este
patógeno.
During 2000 and 2001, in okra (Abelmoschus esculentus L.
Moench) production units in the States of Guerrero and Morelos,
México, a disease was detected which causes yellow streaking
and severe distortion of the fruit, bright yellow mottle and
mosaic, distortion and reduction of leaf size. On certain
occasions, in a few symptomatic okra plants, it was possible to
identify variants of the viruses AMV, TBSV, INSV and an
unknown potyvirus, by means of mechanical transmission to
indicator and differential plants, as well as through ELISA
serological assays. However, none of the above caused visible
symptoms in healthy okra plants in mechanical transmission
tests, which suggests that these RNA viruses are not responsible
for the symptoms observed in the field. When healthy okra plants
were graft-inoculated with scions from symptomatic okra plants,
symptoms of streaking in the fruit and foliar mottling were
observed, which confirms the presence of a pathogenic agent
that is not transmissible by mechanical means, but which is
transmitted by grafting. The grafting of Datura stramonium and
Capsicum annum plant segments, which had been previously
inoculated by means of biobalistics with DNA from diseased okra
plants, caused yellow streak and mottling in healthy okra plants,
suggesting the presence of a DNA virus. Results from a Dot blot
hybridization analysis using a general probe (protein gene of
the Pepper huasteco virus capsid), and the PCR-based assay
(using degenerated oligonucleotides to amplify the protein gene
of the capsid) confirmed the presence of a geminivirus in all of
the okra plants presenting symptoms of yellow mottle from the
field and those which had been grafted in the greenhouse. A
fragment of 632bp viral DNA, obtained from the PCR assays,
was cloned and sequenced (Access No. AF349113). The sequence
analysis suggests that this virus is a new begomovirus showing
phylogenetic relationship to the Squash leaf curl virus and Sida
golden mosaic virus. The name Okra yellow mottle virus (OYMV)
Palabras clave: Angú, virus ADN.
is proposed for this pathogen.
Recibido: Diciembre, 2002. Aprobado: Diciembre, 2003.
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 38: 227-238. 2004.
Key words: Angú, DNA virus.
227
228
AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2004
INTRODUCCIÓN
INTRODUCTION
a okra, angú o gombo (Abelmeschus esculentus.
Malvaceae), es un cultivo de origen africano, introducido en México probablemente a mediados
de la década de 1970 desde los Estados Unidos. Su cultivo se inició en Iguala, Guerrero, y después se extendió a
Baja California Sur, Jalisco, Michoacán, Morelos
Tamaulipas y Yucatán. La superficie total cultivada es
cercana a 15 000 ha, de temporal y riego, con un rendimiento promedio de fruto de 6.0 t ha−1. Los principales
Estados productores por superficie y por producción son
Tamaulipas, Guerrero y Morelos. El fruto de okra se exporta a los Estados Unidos y Francia. La superficie total
sembrada y el rendimiento promedio es 216 ha y 6.0 t
ha−1 en Guerrero, y 252 ha con 12.4 ton ha−1 en Morelos.
En ambas entidades la superficie cosechada de okra se
duplica o triplica, por las siembras de temporal y riego
(DGEA. SARH, 1990).
La producción y superficie cultivada de okra ha disminuido en Guerrero, al extremo de que varias
empacadoras han cerrado por falta de producción, y en
Morelos hay una tendencia similar. La disminución del
rendimiento de la okra puede ser causada por enfermedades, entre las que destaca una que causa moteado y
mosaico foliar de color amarillo intenso (Figura 1A), que
luego causa deformación y reducción severa de la lámina
foliar (Figura 1B).
Los frutos de las plantas enfermas presentan rayas
o bandas alargadas de color amarillo, deformación y
enrollamiento, así como pequeñas protuberancias o granos en la epidermis (Figura 1C). Esta enfermedad además de afectar el rendimiento, reduce la calidad de frutos, que son desechados si presentan un exceso de cualquiera de los síntomas descritos, particularmente del
rayado amarillo, aún teniendo el tamaño comercial
apropiado.
Por el tipo de síntomas observados en las plantas de
okra, cultivadas en Morelos y Guerrero, a esta enfermedad se le denomina moteado amarillo de la okra. Es probable que los síntomas observados en okra, en el campo,
sean de naturaleza viral por agentes aún no caracterizados en México. Por tanto, el objetivo del presente trabajo
fue determinar la etiología de la enfermedad del moteado amarillo de la okra que se cultiva en los Estados de
Guerrero y Morelos.
kra, angú, or gumbo (Abelmeschus esculentus.
Malvaceae), is a crop of African origin, probably
introduced into México in the mid 1970s from
the United States. It was first cultivated in Iguala,
Guerrero, and later in Baja California Sur, Jalisco,
Michoacán Morelos, Tamaulipas and Yucatán. The total
cultivated area is nearly 15 000 ha of both rainfed and
irrigated land, with an average fruit yield of 6.0 t ha−1.
The main producer States, in both area and production,
are Tamaulipas, Guerrero, and Morelos. The produce is
exported to the United States and France. The total
cultivated area and average yield in Guerrero is 261 ha
and 6.0 t ha−1, and in Morelos, 252 ha with 12.4 t ha−1. In
both States, the harvested area is doubled or tripled,
because of rainfed and irrigated production (DGEA,
SARH, 1990).
In Guerrero, okra production and cultivated area have
decreased to the point that several packing plants have
closed due to lack of production, and in Morelos there is
a similar tendency. The decrease in okra yield may be
due to diseases, an outstanding example of which causes
an intense yellow mottle and mosaic on leaves (Figure
1A), and later causes deformation and severe reduction
of the leaf lamina (Figure 1B).
The fruit of the diseased plants present yellow streaks
or long yellow bands, deformation and curling, in addition
to small protuberances or granulation in the epidermis
(Figure 1C). Besides affecting yield, this disease reduces
the quality of the fruit, which is rejected when it presents
an excess of any of the described symptoms, especially
the yellow streak, even when it has reached the appropriate
commercial size.
Because of the type of symptoms observed on okra
plants cultivated in the States of Morelos and Guerrero,
the disease was named okra yellow mottle virus. It is likely
that the symptoms observed on okra in the field are of a
viral nature caused by agents that have not yet been
characterized in México. Therefore, the objective of this
study was to determine the etiology of the yellow mottle
disease in okra cultivated in the States of Guerrero and
Morelos.
L
O
MATERIALS AND METHODS
Separation of the virus
MATERIALES Y MÉTODOS
Mechanical transmission
Separación de virus
Transmisión mecánica
Porciones de hojas, tallos, raíces y flores de plantas de okra con
síntomas del moteado amarillo, fueron maceradas en solución
Portions of leaves, stems, roots and flowers of okra plants with
yellow mottle symptoms were macerated in a buffer solution of
phosphates 0.02 M pH 7.0-DIECA (1g 10−1 mL). The macerate of
each portion of affected plant was used independently to rub onto
leaves of seedlings (three to four true leaves) of the following
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA
A
B
229
C
Figura 1. Síntomas virales en plantas de okra en parcelas comerciales de los Estados de Guerrero y Morelos. A) Síntomas de moteado
amarillo en plántulas; B) síntomas de moteado amarillo, reducción y deformación de hojas de plantas maduras; C) rayado
amarillo y deformación de frutos.
Figure 1. Viral symptoms in okra plants at commercial plots of the States of Guerrero and Morelos. A) Symptoms of yellow mottle in
seedlings; B) symptoms of yellow mottle, reduction and deformation of leaves of mature plants; C) yellow streaking and deformation
of fruits.
amortiguadora de fosfatos 0.02 M pH 7.0-DIECA (1g 10 mL−1). El
macerado de cada porción de planta afectada fue utilizado en forma
independiente para frotar hojas de plántulas (tres a cuatro hojas verdaderas) de las siguientes especies indicadoras: Gomphrena globosa,
Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Beta vulgaris, Cucumis sativus,
C. melo, Cucurbita pepo var. Gray Zucchini, Pisum sativum var. Sta
Elena, Vigna unguiculata var. Blackeye, V. unguiculata subsp.
sisquepedalis, Phaseolus vulgaris var. Madero, Datura stramonium,
Nicotiana glutinosa, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N.
benthaminana, Lycopersicon esculentum var. Royal Ace, Capsicum
annuum var. Ancho y Abelmoschus esculentus. Las plantas se mantuvieron en invernadero (25 a 30 oC) hasta la aparición de síntomas
(Dijkstra y De Jager, 1998).
Transmisión por injerto
Plantas de tomate, chile, D. stramonium y okra con cinco a seis
hojas verdaderas y 20 cm de altura (cinco plantas por especie, todas
producidas por semilla en invernadero), fueron injertadas lateralmente con púas procedentes de plantas de okra, recolectadas en campo, y
con síntomas del moteado amarillo. El injerto se fijó al portainjerto
con cinta parafilm, las plantas se cubrieron con bolsas de plástico por
10 d y se mantuvieron en invernadero (25 a 30 oC) hasta la aparición
de síntomas. Las plantas injertadas con síntomas de origen viral fueron utilizadas para injertar posteriormente plantas de okra sanas producidas en invernadero (Dijkstra y De Jager, 1998).
Ensayo serológico ELISA
Hojas y flores de okra recolectadas en campo con los síntomas de
moteado amarillo fueron analizadas con el ensayo serológico ligado a
enzimas en doble sandwich (DAS-ELISA) en dos días, para la detección de diferentes tipos de virus de ARN. Las plantas indicadoras y
diferenciales utilizadas en la separación de virus en invernadero, que
manifestaron algún síntoma de probable origen viral también fueron
indicator
species:
Gomphrena
globosa,
Chenopodium
amaranticolor, C. quinoa, Beta vulgaris, Cucumis sativus, C. melo,
Cucurbita pepo var. Gray Zucchini, Pisum sativum var. Sta Elena,
Vigna unguiculata var. Blackeye, V. unguiculata subsp.
sisquepedalis, Phaseolus vulgaris var. Madero, Datura stramonium,
Nicotiana glutinosa, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N.
benthaminana, Lycopersicon esculentum var. Royal Ace, Capsicum
annuum var. Ancho, and Abelmoschus esculentus. The plants were
kept in a greenhouse (25 to 30 oC) until symptoms appeared
(Dijkstra and De Jager, 1998).
Transmission by grafting
Tomato, chili, D. stramonium and okra plants 20 cm tall with five
to six true leaves (five plants per species, all produced from seed in a
greenhouse) were grafted laterally with scions from okra plants with
yellow mottle symptoms collected in the field. The graft was attached
to the rootstock with parafilm tape, the plants were covered with plastic
bags for 10 d and kept under greenhouse conditions (25 to 30 oC) until
symptoms appeared. The grafted plants with viral symptoms were later
used to graft onto healthy okra plants produced in a greenhouse
(Dijkstra and De Jager, 1998).
ELISA serological assay
Okra leaves and flowers with yellow mottle symptoms collected
in the field were analyzed with the double sandwich enzyme-linked
serological assay (DAS-ELISA) on two days for the detection of
different types of RNA virus. The indicator and differential plants used
in the separation of the virus in a greenhouse that exhibited some
symptom of likely viral origin, were also analyzed by ELISA.
Commercial polyclonal antiserums were used to detect the Tomato
spotted wilt virus (TSWV), Impatiens necrotic spotted virus (INSV),
Alfalfa mosaic virus (AMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco
mosaic virus (TMV), Tobacco ringspot virus (TRSV), Tobacco streak
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AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2004
analizadas por ELISA. Se utilizaron antisueros policlonales comerciales para la detección de los virus de la marchitez manchada del
tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), de la mancha necrótica
del Impatiens (Impatiens necrotic spotted virus, INSV), del mosaico
de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV), del mosaico del pepino
(Cucumber mosaic virus, CMV), del mosaico del tabaco (Tobacco
mosaic virus, TMV), de la mancha anular del tabaco (Tobacco ringspot
virus, TRSV), del estriado del tabaco (Tobacco streak virus, TSV), del
enanismo arbustivo del tomate (Tomato bushy stunt virus, TBSV) y
del jaspeado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV). Los antisueros y
procedimientos de uso fueron adquiridos en Agdia Co. (EE.UU.) La
absorbencia de las posibles reacciones antígeno anticuerpo fueron registradas en un Microlector con filtro de 492 nm, 20 y 60 min después
de la adición del sustrato. La reacción fue considerada positiva si la
absorbencia era igual ó superior a la lectura de los testigos positivos
para cada virus, incluidos en el equipo de detección serológica (Clark
y Adams, 1977).
Extracción y análisis de ADN viral
Dado que los síntomas de origen viral pueden ser causados por
geminivirus, virus cuyo genoma está constituido de ADN, se realizó
la extracción de ADN total de 1g de hojas de las muestras de okra
recolectadas en campo, así como de plantas sanas de okra cultivadas
a partir de semilla en invernadero y que se utilizaron como testigos
negativos (Dellaporta et al., 1983). Veinte microlitros del extracto
de ADN fueron fraccionados por electroforesis en geles de agarosa
(1.0 %), conducida en solución amortiguadora TBE 1x (0.089 M
Tris-base, 0.082 M ácido bórico, 0.002 M EDTA pH 8.0), a 100 V,
por 1 h. En la electroforesis, además del ADN extraído de plantas de
okra enfermas, se incluyó ADN total de plantas infectadas con el
virus huasteco del chile PHV (Pepper huasteco virus. Familia
Geminiviridae, Género Begomoviridae) como testigo positivo, ADN
A del PHV (monómero), linearizado con la enzima Hind III, y como
referencia ADN total de plantas sanas y el marcador de peso
molecular 1 kb (Sambrook et al., 1989; Torres-Pacheco et al., 1996).
Transmisión por biobalística
Plántulas con dos a cuatro hojas verdaderas de chile, tomate, N.
rustica, N. tabacum var. xanthi, N. glutinosa y N. benthamiana, así
como C. quinoa, C. amaranticolor fueron inoculadas por biobalística
usando micropartículas de tungsteno (50 µL), mezcladas con 5 µL de
ADN viral (1 µL L−1) que se obtuvo de las plantas indicadoras inoculadas por transmisión mecánica y por injerto en el invernadero, pero sólo
de las que se confirmó por hibridación tipo Dot-blot (descrita más adelante) que estaban infectadas con geminivirus. Las partículas de tungsteno impregnadas con ADN viral fueron proyectadas hacia la parte superior de las plántulas con presión de helio a 800 o 1200 psi usando un
acelerador Du Pont (PDS-1000). Las hojas de las plantas bombardeadas fueron lavadas brevemente con agua destilada para retirar el exceso de desechos del bombardeo. El ensayo de transmisión por biobalística
se realizó por triplicado. Las plantas bombardeadas fueron mantenidas
en laboratorio por 12 h, después transferidas a una cámara bioclimática
virus (TSV), Tomato bushy stunt virus (TBSV), and Tobacco etch virus
(TEV). The antiserums and procedures were acquired from Agdia Co.
(USA). Absorbance of the possible antigen antibody reactions were
recorded in a Microlector with a 492 nm filter, at 20 and 60 min after
the addition of the substrate. The reaction was considered positive if
absorbance was equal to or above the reading of the positive controls
for each virus included in the serological detection equipment (Clark
and Adams, 1977).
Viral DNA extraction and analysis
Given that symptoms of viral origin can be caused by geminivirus,
whose genome is constituted of DNA, total DNA was extracted from
1 g of leaves of okra samples collected in the field, as well as from
healthy okra plants grown from seed in the greenhouse, which were
used as negative controls (Dellaporta et al., 1983). Twenty microliters
of the DNA extract were fractioned by electrophoresis in agar gels
(1.0%), conducted in a TBE buffer solution 1x (0.089 M Tris-base,
0.082 M boric acid, 0.002 M EDTA pH 8.0), at 100 V for 1 h. In the
electrophoresis, in addition to the DNA extracted from diseased okra
plants, total DNA of plants infected by the Pepper huasteco virus,
family Geminiviridae, genus Begomoviridae (PHV), was included as
a positive control, DNA A from PHV (monomer), linealized with the
enzyme Hind III, and as a reference total DNA from healthy plants
and the molecular weight marker 1 kb (Sambrook et al., 1989; TorresPacheco et al., 1996).
Transmission by biobalistics
Chili, tomato, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N. glutinosa
and N. benthamiana, as well as C. quinoa, C. amaranticolor seedlings,
with two to four true leaves, were inoculated by biobalistics using
microparticles of tungsten (50 µL), mixed with 5 µL of viral DNA
(1 µL L−1) obtained from the indicator plants inoculated by mechanical
transmission and by grafting in the greenhouse, but only from those
that were confirmed to be infected by geminivirus by Dot-blot type
hybridization (described below). The tungsten particles impregnated
with viral DNA were projected onto the upper part of the seedlings
with helium pressure at 800 or 1200 psi using a Du Pont accelerator
(PDS-1000). The leaves of the bombarded plants were washed briefly
with distilled water to remove the excess of residues from the
bombardment. The assay of transmission by biobalistics was performed
in triplicate. The bombarded plants were kept in laboratory conditions
for 12 h and later transferred to a bioclimatic chamber with white light
and a uniform temperature of 25 oC until symptoms appeared. The
plants were transferred to the greenhouse (25 to 30 oC) where they
were kept for the mechanical transmissions and grafting tests (Garzon
et al., 1993).
Leaves of chili plants bombarded with DNA obtained from okra
plants with yellow mottle symptoms and exhibiting some symptom
of probable viral origin were used for mechanical transmission in
okra seedlings with two to four true leaves and transmission by
grafting on 20-cm tall okra plants, as described above, until symptoms
appeared.
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA
con luz blanca y temperatura de 25 oC continua, hasta la aparición de
síntomas. Las plantas se transfirieron al invernadero (25 a 30 oC), donde se conservaron para realizar ensayos de transmisión mecánica y por
injerto (Garzón et al., 1993).
Hojas de plantas de chile bombardeadas con el ADN obtenido de
plantas de okra con síntomas de moteado amarillo, y que manifestaron algún síntoma de probable origen viral, fueron utilizadas para la
transmisión mecánica en plántulas de okra con dos a cuatro hojas verdaderas, y transmisión por injerto en plantas de okra de 20 cm de alto,
como se describió previamente, hasta la aparición de síntomas.
Hibridación molecular
Para detectar la presencia de geminivirus en las muestras recolectadas en campo, así como en el material vegetativo inoculado mecánicamente, por injerto o por biobalística, se realizó una hibridación
molecular tipo Dot-blot y después una del tipo Southern para precisar
el tamaño molecular del virus involucrado. Como sonda se utilizó el
fragmento del gen clonado de la proteína de la cápside del virus
huasteco del chile (PHV). La sonda fue marcada con el kit “Genes
Images random prime labelling” (Amersham Life Science).
Para el ensayo Dot-blot, el ADN de las muestras fue transferido
directamente a membranas de Nylon Hybond (+), aunque también fue
fraccionado por electroforesis en geles de agarosa y posteriormente
transferido por capilaridad a una membrana de Nylon Hybond (+).
Las membranas fueron prehibridadas e hibridadas a 65 oC, en condiciones de alta astringencia, usando en su oportunidad la sonda respectiva. Las autoradiografias fueron preparadas colocando las membranas hibridadas en casetes para exposición utilizando película Kodak
X-Omat. Durante la exposición la película y membrana fueron almacenadas a temperatura ambiente por 2 h (Surzycki, 1999; Sambrook et
al., 1989).
Amplificación de ADN viral por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
La prueba de la PCR se realizó únicamente con el ADN de las
muestras de okra que mostraron síntomas del moteado amarillo y que
estaban infectadas por geminivirus según los ensayos de hibridación
tipo Dot-blot.
La amplificación del ADN viral por la PCR se hizo con los
oligonucleótidos MOT/CP, que amplifican un segmento de 650 pb del
componente A de geminivirus y que incluye la región común (RC) y
parte del gen de la proteína de la cápside (CP) (Ascencio-Ibañez et al.,
2002).
La mezcla final de reacción de la PCR (50 µL volumen total)
tenía 2.5 mM MgCl2, buffer de reacción 1x, 200 µM mezcla de dNTP’s,
0.2 µM de cada oligonucleótido, 2.5 unidades de Taq ADN polimerasa
(Amplitaq ADN polimerasa Perkin-Elmer), y 1 µL (100 ng) de las
muestras de okra sospechosas de estar infectadas con geminivirus, de
muestras de malezas que crecen junto a la okra y de aquellas que se
utilizaron como testigos negativos y positivos. La mezcla de reacción
fue incubada en un termociclador Perkin Elmer para 35 ciclos de reacción. Cada ciclo consistió en la incubación por 1 min a 94 oC, 1 min a
231
Molecular hybridization
To detect the presence of geminivirus in the samples collected in
the field, as well as in plant material mechanically inoculated with
biobalistics or grafting, initially a Dot-blot type molecular hybridization
was performed, and later one of the Southern type, to precisely
determine the molecular size of the virus involved. As a primer, a
fragment of the cloned gene of the protein capsid of the PHV was
used. The primer was marked with the “Genes images random primer
labeling” kit (Amersham Life Science).
For the Dot-blot assay, DNA from the samples was directly
transferred to Nylon Hybond (+) membranes, although it was also
fractionated by electrophoresis in agarosa gel and later transferred
by capilarity to Nylon Hybond (+) membrane. The membranes were
prehybridized and hybridized at 65 oC, under conditions of high
astringency, with the timely use of the respective primer. The autoradiographs were prepared by placing the hybridized membranes in
cassettes for exposure, using Kodak X-Omat film. During exposure,
the film and membrane were stored at room temperature for 2 h
(Surzycki, 1999; Sambrook et al., 1989).
Amplificiation of viral DNA by polymerase (PCR) chain reaction
The PCR test was performed only with DNA from the okra samples
that exhibited symptoms of yellow mottle and, in the dot-blot
hybridization tests, were shown to be infected by geminivirus.
For amplification of the viral DNA by PCR, MOT/CP
oligonucleotides were used. These amplify a 650 pb segment of
the A component of geminivirus and include a common region
(CR) and part of the capsid protein gene (CP) (Ascencio-Ibañez et
al., 2002).
The final PCR reaction mixture (50 µL total volume) consisted
of 2.5 mM MgCl2, 1x reaction buffer, 200 µM mixture of dNTP’s,
0.2 µM of each oligonucleotide, 2.5 units of Taq DNA polymerase
(Amplitaq DNA polymerase Perkin-Elmer), and 1 µL (100 ng) of
the okra samples suspected of being infected by geminivirus, of
samples of weeds that grow near the okra, and of those that were
used as negative and positive controls. The reaction mixture was
incubated in a Perkin Elmer thermocycler for 35 cycles of reaction.
Each cycle comprised incubation for 1 min at 94 oC, 1 min at 56 oC
and 1 min at 72 oC for 35 cycles. The amplified products were
analyzed directly by electrophoresis in 1.4% agar gels (Mehta et
al., 1994).
Cloning and sequencing
The product of amplification was separated from the agar matrix
(GenClean) and cloned in E. coli strain DH5a, using the vector pCR
TOPOII (Invitrogen) (Sambrook et al., 1989). The cloned products
were analyzed in a sequencer, Applied Biosystem Genetic Analyzer
377. The nucleotide sequence was compared for identification with
sequences available in the GenBank database using the Clustal
method (MegAlign, DNA Star software, Madison, WI) (Sanger et
al., 1977).
232
AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2004
56 oC y 1 min a 72 oC por 35 ciclos. Los productos amplificados fue-
RESULTS AND DISCUSSION
ron analizados directamente por electroforesis en geles de agarosa a
1.4% (Mehta et al., 1994).
Separation of the virus
Clonación y secuenciación
El producto de amplificación fue separado de la matriz de agarosa
(GenClean) y clonado en E. coli cepa DH5a utilizando el vector pCR
TOPOII (Invitrogen) (Sambrook et al., 1989). Los productos clonados
fueron analizados en un secuenciador Applied Biosystem Genetic
Analizer 377. La secuencia nucleotídica fue comparada para su identificación con secuencias disponibles en la base de datos del GenBank,
utilizando el método Clustal (MegAlign, DNA Star software, Madison,
WI) (Sanger et al., 1977).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Separación de virus
Transmisión mecánica
Los casos donde se separó algún virus por transmisión mecánica, se caracterizaron considerando los síntomas obtenidos por inoculación mecánica en plantas
indicadoras y después en plantas diferenciales (algunas se
incluyen en las figuras respectivas). Además, se confirmó
su identidad mediante ensayos serológicos tipo ELISA.
Se separó e identificó al virus mosaico de la alfalfa
(AMV), que causó lesiones locales necróticas y mosaico
en Gomphrena globosa y C. amaranticolor con mosaico
sistémico; además de lesiones locales cloróticas en Vigna
sinnensis (Figura 2A). En plantas de okra no se observó
ningún tipo aparente de síntomas. Este virus se separó
fácilmente de los pétalos frescos de la okra, pero no se
logró separar de hojas, tallos o raíz, recolectadas en campo (Van Vloten, 1981).
Otro virus que se separó de flor y follaje fue el virus
de la mancha necrótica del Impatiens (INSV), cuyos daños más significativos fueron la aparición de un mosaico
y moteado suave, después patrones perineales, primero
cloróticos y al final necróticos, en las hojas inoculadas
de D. stramonium, C. annuum y N. rustica (Figura 2B).
La necrosis de las hojas pronto se generalizó hasta causar
la muerte de la planta. El INSV tampoco indujo síntomas
por transmisión mecánica en plantas de okra en el invernadero (Brunt, 1995).
Un tercer virus detectado fue el del enanismo arbustivo del tomate (TBSV), el cual fue propagado a partir
de hojas y raíces de plantas de okra. TBSV causó lesiones locales necróticas, manchas irregulares de color blanquecino y deformación severa de hojas en Datura
stramonium; lesiones locales necróticas y deformación
de hojas en chile; y pequeñas lesiones locales necróticas
en forma de anillo, hiponastia y deformación en hojas
Mechanical transmission
The cases in which a virus was separated by
mechanical transmission were characterized considering
the symptoms obtained by mechanical inoculation in
indicator plants and later in differential plants (some are
included in the respective Figures). Also, their identity
was confirmed with ELISA-type serological assays.
The alfalfa mosaic virus (AMV) was separated and
identified; this virus caused localized necrotic lesions
and mosaic in Gomphrena globosa and C. amaranticolor,
with systemic mosaic as well as local chlorotic lesions
in Vigna sinensis (Figure 2A). In okra plants, no apparent
type of symptoms was observed. This virus was easily
separated from fresh okra petals, but it could not be
separated from leaves, stems or roots collected in the
field (Van Vloten, 1981).
Another virus that was separated from flower and
foliage was the Impatiens necrotic spot virus (INSV). The
most significant damage this virus caused was the
appearance of a soft mosaic and mottle; later oak-leaf
patterns appeared, first chlorotic and finally necrotic, on
inoculated D. stramonium, C. annuum and N. rustica
leaves (Figure 2B). The leaves necrosis soon generalized
until causing death of the plant. However, INSV
transmitted mechanically did not induce symptoms in okra
plants in the greenhouse (Brunt, 1995).
A third virus detected was the Tomato bushy stunt virus
(TBSV), which was propagated from leaves and roots of
okra plants. TBSV caused localized necrotic lesions,
irregular whitish spots and severe deformation in Datura
stramonium leaves, localized necrotic lesions and
deformation of leaves in chili, and small localized necrotic
ring-shaped lesions, hyponasty, and deformation of leaves
in tomato (Figure 2C). This virus did not cause any type
of symptom in okra plants inoculated in the greenhouse
(Martelli, 1990).
Finally, a fourth virus was separated by mechanical
transmission. This virus caused small necrotic semicircular spots, mosaic, and leaf deformation in N. tabacum
var. Xanthi. In D. stramonium, it caused severe
deformation of leaves, yellow chlorotic mottle, and
multiple small pale yellow spots (Figure 3A). In N.
benthamiana plants, the virus caused a light yellow
mosaic, severe deformation and reduction in size of the
rest of the inoculated leaves (Figure 3B). The
characteristics of the induced symptoms in inoculated
hosts, principally D. stramonium and N. benthamiana,
indicate that these plants were infected by at least one
potyvirus, similar to the Tobacco etch virus (TEV).
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA
A
B
233
C
Figura 2. Síntomas inducidos por virus separados de okra por transmisión mecánica en plantas diferenciales: A) Lesiones locales cloróticas
por virus mosaico de la alfalfa (AMV) en Vigna unguiculata; B) mosaico por virus de la mancha necrotica del Impatiens (INSV)
en N. rustica; C) anillos necróticos por virus enanismo arbustivo del tomate (TBSV) en tomate, en invernadero.
Figure 2. Symptomps induced by virus separated from okra by mechanical transmission in differential plants: A) Localized chlorotic
lessions by Alfalfa mosaic virus (AMV) in Vigna unguiculata; B) mosaic by Impatiens necrotic spotted virus (INSV) in N. rustica;
C) necrotic rings by Tomato bushy stunt virus (TBSV) in tomato, in the greenhouse.
de tomate (Figura 2C). Este virus no causó ningún síntoma en plantas de okra inoculadas en invernadero
(Martelli, 1990).
Finalmente, se separó, por transmisión mecánica, un
cuarto virus que causó pequeñas manchas semicirculares
necróticas, mosaico y deformación foliar en N. tabacum
var. Xanthi. En D. Stramonium este virus causó deformación severa de hojas, moteado clorótico amarillo y múltiples manchas pequeñas amarillas pálidas (Figura 3A). En
plantas de N. benthamiana este virus causó un mosaico
amarillo claro, deformación severa y reducción del tamaño del resto de las hojas inoculadas (Figura 3B). Las
características de los síntomas inducidos en los
hospedantes inoculados, principalmente en D. stramonium
y N. benthamiana, indican que estas plantas estaban infectadas por al menos un potyvirus, semejante al virus
jaspeado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV). Sin embargo, este virus no causó síntomas en plantas de okra
por inoculación mecánica (Purcifull, 1981).
En resumen, ninguno de los virus de ARN separados
por transmisión mecánica en plantas indicadoras y diferenciales, fue capaz de reproducir los síntomas observadas en plantas de okra en el campo.
However, this virus did not cause symptoms in okra plants
inoculated mechanically (Purcifull, 1981).
Summarizing, none of the RNA viruses separated by
mechanical transmission from indicator and differential
plants, were able to reproduce the symptoms observed in
okra plants in the field.
Transmisión por injerto
ELISA serological assays
El injerto de ramas con hojas de okra recolectadas en
campo causó moteado y mosaico amarillo, con ligera
deformación y reducción de la lámina foliar, en plantas
de okra producidas por semilla en el invernadero (Figura
4A). El injerto de ramas de okra enfermas causó
amarillamiento y deformación ligera de hojas en tomate,
mientras en chile se observaron síntomas de mosaico,
moteado, deformación severa de hojas y enanismo; en D.
With ELISA, direct detection of virus in field okra
plants with yellow mottle symptoms was negative in all
of the cases. Therefore, with this technique it was not
possible to identify any known virus related to the
symptoms observed in the okra plants from the field or in
material obtained by grafting in the greenhouse. However,
in the few cases in which separation of a virus from okra
plants was achieved by mechanical transmission to host
Transmission by grafting
Grafting scions with leaves of okra collected in the
field caused yellow mottle and mosaic, with slight leaf
deformation and reduction of the leaf lamina, in okra
plants produced from seed in the greenhouse (Figure
4A). Grafting scions of diseased okra caused yellowing
and slight deformation in tomato leaves, while in chili,
symptoms of mosaic, mottle, severe deformation of
leaves, and stunting were observed. In D. stramonium,
it caused mosaic, yellow mottle and leaf deformation.
Therefore, the symptoms associated with the disease of
okra yellow mottle were reproduced only by grafting
on healthy greenhouse okra plants. The ELISA
serological assays did not indicate infection by an RNAtype virus.
234
AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2004
A
B
A
B
Figura 3. Síntomas inducidos por geminivirus y un potyvirus en
asociación, separados de okra por transmisión mecánica: A) Moteado y lesiones locales necróticas en D.
stramonium; B) mosaico y deformación de hojas en N.
benthamiana, en invernadero.
Figure 3. Symptoms induced by geminivirus and a potyvirus in
association, separated from okra by mechanical
transmission: A) Motting and localized necrotic lessions
in D. stramonium; B) mosaic and deformation of leaves
in N. benthamiana, in the greenhouse.
Figura 4. Síntomas inducidos por un geminivirus separado de
okra: A) por injerto, moteado, mosaico amarillo y deformación de hojas en okra; B) por biobalística, deformación apical de hojas en chile, en condiciones de invernadero.
Figure 4. Symptoms induced by a geminivirus separated from
okra: A) By grafting, motting, yellow mosaic and
deformation of leaves in okra; B) by biobalistics,
apical deformation of leaves in chili, in the
greenhouse.
stramonium causó mosaico, moteado amarillo y deformación de hojas. Por tanto, los síntomas asociados con la
enfermedad del moteado amarillo de la okra sólo se reprodujeron por injerto en plantas de okra sanas en invernadero. Los ensayos serológicos con ELISA no indicó la
infección de virus del tipo ARN.
indicator and differential plants, it was only in these that
infections by the AMV, INSV, TBSV and TEV viruses
were detected.
It is likely that the high content of mucilaginous
substances, obtained when okra tissue is macerated,
affected the serological detection of these viruses, but not
their mechanical transmission to other hosts.
Ensayos serológicos de ELISA
Extraction and analysis of viral DNA
La detección directa de virus en plantas de okra, del
campo, con síntomas de moteado amarillo, utilizando
ELISA, fue negativa en todos los casos. Por tanto, con esta
técnica no se pudo establecer la identidad de algún virus
conocido que se relacionara con los síntomas observados
en las plantas de okra en campo o en el material obtenido
por injerto en invernadero. Sin embargo, en los pocos casos donde se logró separar algún virus de plantas de okra,
por transmisión mecánica a plantas de hospedantes
indicadoras y diferenciales, sólo en éstas se detectaron
infecciones por los virus AMV, INSV, TBSV y TEV.
Es probable que el alto contenido de sustancias
mucilaginosas, que se obtienen al macerar los tejidos de
okra, afectó la detección serologica de estos virus, pero
no su transmisión mecánica a otros hospedantes.
Extracción y análisis de ADN viral
Transmisión por biobalística
La transmisión por biobalística causó síntomas severos en plantas de chile: amarillamiento y epinastia en
Transmission by biobalistics
Transmission by biobalistics caused severe symptoms
in chili plants: yellowing and epinasty in leaves, as well
as deformation of branches and reduction of plant size
(Figure 4B). In some plants of N. tabacum var. Xanthi,
N. benthamiana and N. glutinosa tenuous light yellow
mosaic was observed, localized only in inoculated leaves,
the rest of the new leaves did not exhibit symptoms.
Because of the severity of the symptoms, chili plants
inoculated by biobalistics were selected to conduct tests
of transmission by grafting in new chili and okra plants.
Molecular hybridization
Infections by geminivirus were detected by dot-blot
type hybridization in all of the okra plants with yellow
mottle symptoms collected in Iguala, Guerrero, and
Mazatepec, Morelos. This assay permitted the rapid and
reliable analysis of a large number of okra samples with
yellow mottle symptoms, before performing the PCR.
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA
hojas, deformación de ramas y reducción del tamaño de
la planta (Figura 4B). En algunas plantas de N. tabacum
var. xanthi, N. benthamiana y N. glutinosa se observó un
mosaico tenue amarillo claro, localizado sólo en las hojas inoculadas; el resto de las nuevas hojas no presentó
síntomas. Por la severidad de síntomas, se seleccionaron
las plantas de chile inoculadas por biobalística, para realizar pruebas de transmisión por injerto a plantas nuevas
de okra y chile.
Hibridación molecular
Se detectaron infecciones por geminivirus en todas
las plantas de okra con los síntomas de moteado amarillo, recolectadas en Iguala, Guerrero, y Mazatepec,
Morelos, mediante el ensayo de hibridación del tipo Dotblot. Este ensayo permitió un análisis rápido y confiable
de un gran número de muestras de okra con los síntomas
de moteado amarillo, antes de realizar la PCR. Se detectaron infecciones por geminivirus en las plantas de okra
injertadas con material del campo, así como en plantas
de D. stramonium y N. benthamiana inoculadas mecánicamente y en las plantas inoculadas por bombardeo (Figura 5).
Infections by geminivirus were detected in okra plants
grafted with material from the field, as well as on D.
stramonium and N. benthamiana plants inoculated
mechanically and in plants inoculated by bombardment
(Figure 5).
Amplification of viral DNA by polymerase chain
reaction (PCR)
The electrophoretic analysis of the PCR products of
total DNA obtained from okra plants with yellow mottle
symptoms collected in the field, exhibited an expected
650 pb band when the oligonucleotides Mot/CP were
used; these direct the amplification of the intergene region
and the capsid protein gene (Figure 6. Track 2). Also,
bands of the same weight were obtained in okra and
differential host plants inoculated by grafting and
inoculated by bombardment, as well as from a weed
(Melampodium divaricatum), which grows abundantly in
okra crops (Figure 6, Track 4).
Also, bands of the same weight were detected in D.
stramonium and N. benthaminana plants inoculated
mechanically with macerates of okra leaves with yellow
mottle; these plants were infected by TEV (data not shown).
Amplificación de ADN viral por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
El análisis electroforético de los productos de la PCR
del ADN total obtenido de plantas de okra con síntomas
de moteado amarillo y recolectadas en campo, mostró
una banda 650 pb, predicha para los oligonucleótidos
Mot/CP que amplifican partes de la región intergenética
y del gen de la proteína de la cápside de geminivirus
(Figura 6, Carril 2). Además, se obtuvo bandas del mismo peso en las plantas de okra y de los hospedantes
diferenciales inoculadas por injerto y bombardeo, así
como de una maleza (Melampodium divaricatum) que
crece abundantemente en el cultivo de okra (Figura 6,
Carril 4).
También se detectaron bandas del mismo peso en las
plantas de D. stramonium y N. benthamiana inoculadas
mecánicamente con macerados de hojas de okra con
moteado amarillo; estas plantas estaban infectadas por
TEV (datos no mostrados).
Clonación y secuenciación
El producto obtenido por la PCR se clonó y posteriormente se estableció su secuencia, misma que se depositó en el Genbank con el número de acceso
AF349113. El análisis por comparación de un fragmento de 200 bases, que corresponde al gen de la proteína de
la cápside (CP), sugiere que el virus aislado de plantas
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A
B
C
D
E
Figura 5. Ensayo de hibridación del tipo Dot-blot, utilizando como
sonda el gen CP de Pepper huasteco virus. Muestras de
okra positivas para geminivirus: A2, A5, C1 y C2; muestras de tomate y chile infectadas con geminivirus, utilizadas como testigos positivos: A3, A6, B4, B6, D5, D6,
E3 y E5; muestras E2 y E6 plantas sanas testigos negativo; muestra E1 testigo positivo de PHV para la sonda.
El resto son muestras negativas de okra.
Figure 5. Dot-blot hybridization test, using the CP gene of Pepper
huasteco virus as a probe. Samples of okra tested positive
for geminivirus: A2, A5, C1 and C2; samples of tomato
and chili infected with geminivirus used as positive
controls: A3, A6, B4, B6, D5, D6, E3, and E5; samples
E2 and E6 healthy plants negative controls; sample E1
positive control of PHV for the probe. The rest are
negative okra samples.
236
AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2004
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3
4
5
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Cloning and sequencing
8
650 pb
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa (0.8 %) de productos
de la PCR, utilizando los oligonucleótidos Mot/CP, con
ADN total de plantas de okra y en varias malezas de
este cultivo. Carril 1 MPM 1 Kb; carril 2 Okra (producto de 650 pb); carril 3 Poinsettia pulcherrima (negativo); carril 4 Melampodium divaricatum (producto
de 650 pb); carril 5 Sida accuta (negativo); carril 6
PHV (testigo positivo); carril 7 testigo negativo (sin
banda de 650 pb); carril 8 MPM 1 kb.
Figure 6. Electrophoresis in agar gel (0.8%) of PCR products,
using Mot/CP oligonucleotides, with total DNA from
okra plants and several weeds of this crop. Track 1 MPM
1 Kb; track 2 Okra (product of 650 pb); track 3
Poinsettia pulcherrima (negative); track 4 Melampodium
divaricatum (product of 650 pb); track 5 Sida accuta
(negative); track 6 PHV (positive control); track 7
negative control (no 650 pb band); track 8 MPM 1 kb.
de okra con moteado amarillo, pertenece a los
begomovirus. El análisis de la secuencia de los primeros
64 aminoácidos del fragmento correspondiente a la CP
(la región menos conservada dentro del gen de la CP en
las especies de geminivirus), mostró el mayor porcentaje de identidad (89%) con el Squash leaf curl virus, pero
suficiente para considerarlo como un geminivirus diferente. El análisis de sólo la parte derecha de la región
intergenética (de la orquilla a CP) indicó una identidad
de 85% con el Sida golden mosaic virus, pero aún diferente ésta y otras especies de geminivirus conocidos
(Brown et al., 1999; Padidam et al., 1995; Regenmortel
et al., 1997).
Según los análisis de la secuencia del fragmento
clonado del geminivirus causante del moteado amarillo
de la okra, éste pudiera eventualmente ser una especie
diferente de virus no reportada previamente, Por tanto,
se sugiere el nombre de Okra yellow mottle virus para
The product obtained by PCR was cloned and later
its sequence was established and deposited in the Genbank
with access number AF349113. The analysis by
comparison with a fragment of 200 bases, corresponding
to the protein caspid (PC) gene, suggests that the virus
separated from okra plants with yellow mottle belongs to
the group of begomoviruses. The analysis of the sequence
of the first 64 amino acids of the fragment corresponding
to the PC (the least preserved region within the PC gene
in species of geminiviruses) had the highest percentage
of identity (89%) with Squash leaf curl virus, but it was
sufficient to consider it a different geminivirus. The
analysis of only the right side of the intergene region (from
the loop to the PC) indicated an 85% identity with Sida
golden mosaic virus, but still different from this and other
known species of geminiviruses (Brown et al., 1999;
Padidam et al., 1995; Regenmortel et al., 1997).
According to the analysis of the sequence of the cloned
fragment of the geminivirus that causes okra yellow mottle
virus, this could eventually be a different, previously
unreported virus. Therefore, the name Okra yellow mottle
virus is proposed to designate this pathogen, although it
is necessary to continue molecular analysis of the entire
genome.
In other countries it has been determined that okra is
susceptible to the viruses Abelia latent tymovirus, Abutilon
mosaic begomovirus, Alfalfa mosaic alfamovirus, Beet
curly top curtovirus, Beet mosaic potyvirus, Beet western
yellows luteovirus, Bhendi yellow vein mosaic
begomovirus, Clitoria yellow vein tymovirus, Cotton leaf
curl begomovirus, Cucumber mosaic cumovirus, Epirus
cherry ourmiavirus, Okra leaf curl begomovirus,
Rhynchosia mosaic begomovirus, Sweet potato ringspot
nepovirus, Tobacco ringspot nepovirus, Tobacco streak
ilarvirus and Watermelon mosaic 2 potyvirus (Brunt et
al., 1997).
In the present study, the viruses INSV, TBSV and TEV
are reported for the first time to be infecting okra in
México; only AMV had been described in other regions
of the world. All of these viruses were characterized after
separation and mechanical transmission to indicator and
differential hosts. However, these viruses could not be
detected in the macerates of okra tissue by serology
(ELISA), nor did they cause apparent symptoms in the
okra plants inoculated mechanically in the greenhouse.
It is possible that mechanical transmission of these viruses
from okra to okra is blocked by some chemical element
present in the leaves of this plant. This allows us to
conclude that natural infection of these viruses occurs
through the intervention of insect vectors.
It was determined that the symptoms of the yellow
mottle disease in okra, observed in the field, were induced
DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA
designar este patógeno, aunque es necesario continuar
con el análisis molecular del genoma completo.
En otros países se ha determinado que la okra es susceptible a los virus Abelia latent tymovirus, Abutilon mosaic
begomovirus, Alfalfa mosaic alfamovirus, Beet curly top
curtovirus, Beet mosaic potyvirus, Beet western yellows
luteovirus, Bhendi yellow vein mosaic begomovirus,
Clitoria yellow vein tymovirus, Cotton leaf curl
begomovirus, Cucumber mosaic cumovirus, Epirus cherry
ourmiavirus, Okra leaf curl begomovirus, Rhynchosia
mosaic begomovirus, Sweet potato ringspot nepovirus,
Tobacco ringspot nepovirus, Tobacco streak ilarvirus y
Watermelon mosaic 2 potyvirus (Brunt et al., 1997).
En este trabajo se reporta por primera vez los virus
INSV, TBSV y TEV que infectan la okra en México;
sólo el AMV se había descrito en otras regiones del mundo. Todos estos virus se caracterizaron después de separarlos por transmisión mecánica a hospedantes
indicadoras y diferenciales. Sin embargo, estos virus no
se pudieron detectar en los macerados de tejidos de okra
por serología (ELISA), ni causaron síntoma aparente
en las plantas de okra inoculadas mecánicamente en invernadero. Es posible que la transmisión mecánica de
estos virus de okra a okra, sea bloqueada por algún elemento químico presente en las hojas de esta planta. Esto
permite concluir que la infección natural de estos virus
es por intervención de insectos vectores.
Se determinó que los síntomas de la enfermedad del
moteado amarillo de la okra, observados en campo, fueron inducidos consistentemente en plantas de okra producidas en el invernadero, sólo por injerto o biobalística.
En estas plantas siempre se determinó la presencia de un
geminivirus utilizando el ensayo de PCR o por hibridación molecular.
El análisis molecular de la Región Común completa
y parte del gen CP, del geminivirus asociado con la enfermedad del moteado amarillo de la okra, indicó que se
trata, al parecer de un geminivirus no descrito previamente. Por tanto, se justifica la caracterización completa
de su genoma.
Eventualmente, se logró transmitir mecánicamente al
geminivirus en plantas de D. stramonium y N.
benthamiana, pero siempre en asociación con un
potyvirus semejante a TEV. Esta situación tendrá que estudiarse más a fondo, dado que TEV no es un patógeno
reconocido de okra y la transmisión mecánica es relativamente baja en la mayoría de los geminivirus. Además,
este tipo de interacciones (sinergismo en la transmisión)
tendría implicaciones epidemiológicas para ambos
patógenos en el cultivo de la okra.
CONCLUSIONES
Aunque se separaron los virus AMV, INSV, TBSV y
un potyvirus semejante a TEV de plantas de okra con los
237
consistently in okra plants produced in the greenhouse
only by grafting or biobalistics. In these plants, the
presence of a geminivirus was always determined using
the PCR assay or molecular hybridization.
The molecular analysis of the complete Common
Region and part of the CP gene of the geminivirus
associated with the yellow mottle disease of okra indicates
that we are apparently dealing with a geminivirus not
previously described. Therefore, the complete
characterization of its genome is justified.
Occasionally, mechanical transmission of the
geminivirus was achieved in D. stramonium and N.
benthamiana plants, but always in association with a
potyvirus similar to TEV. This situation will have to be
studied more in detail, given that TEV is not a recognized
pathogen of okra and mechanical transmission is relatively
low in most geminiviruses. Moreover, this type of
interactions (synergism in transmission) could have
epidemiological implications for both pathogens in the
cultivation of okra.
CONCLUSIONS
Although the viruses AMV, INSV, TBSV, and a
potyvirus similar to TEV were separated from okra plants
with symptoms of yellow streak of the fruit and yellow
mottle leaves, none of them caused symptoms in okra
plants after mechanical and independent inoculation.
However, it is not ruled out that these viruses could be
related to part of the complex symptomatology of viral
origin observed in the field.
It was determined that the principal causal agent of
the symptoms of yellow mottle in okra is a geminivirus
belonging to the genus Begomovirus and related to
Squash leaf curl virus and Sida golden mosaic virus.
The molecular analyses indicated that this virus could
be a new, different viral species not previously reported.
Therefore, the name Okra yellow mottle virus is
proposed to designate this pathogen. The determination
of this characteristics of the complete genome of this
geminivirus, its origin and natural reservoirs, as well as
the characteristics of possible mechanical transmission
in co-infection with other viruses, are important aspects.
—End of the English version—
síntomas de rayado amarillo del fruto y moteado amarillo foliar, ninguno de ellos causó síntomas en plantas de
okra después de una inoculación mecánica e independiente. Sin embargo, no se descarta que estos virus puedan
estar relacionados con parte de la compleja sintomatologia
de origen viral observada en campo.
238
AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2004
Se determinó que el principal agente causal de los
síntomas de moteado amarillo en la okra es un
geminivirus, perteneciente al género Begomovirus y relacionado con el Squash leaf curl virus y con el Sida
golden mosaic virus. Los análisis moleculares indicaron
que este virus pudiera ser una especie viral diferente no
reportada previamente. Por tanto, se propone el nombre
de Okra yellow mottle virus para designar este patógeno.
La determinación de las características del genoma completo de este geminivirus, su origen y reservorios naturales, así como las características de la posible transmisión
mecánica en coinfección con otros virus, son aspectos
importantes.
RECONOCIMIENTOS
Esta investigación fue totalmente financiada por el Programa de
Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)
de la UNAM, México, Proyecto IN207601 “Movilidad celular de un
nuevo geminivirus por coinfección con una variante del tobacco etch
virus”. Se contó también con el apoyo logístico del Departamento de
Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo.
LITERATURA CITADA
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