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Inmunobiología de las Enfermedades Infecciosas
Responsable del Programa: Dr. Francisco Javier Sánchez García
No. Registro SAPPI: 741
Título: Efecto del genotipo del virus dengue sobre la respuesta
proinflamatoria a la infección.
Director del Proyecto: Dra. Ma. Isabel Salazar Sánchez
Objetivo: Establecer los niveles de activación y producción de citocinas
proinflamatorias (IL-1β, NF-κB y IL-6) en células infectadas con dos diferentes
genotipos de virus dengue tipo 2 (Americano y Americano/Asiático).
RESUMEN
Desde 1980 se han suscitado en América Latina aproximadamente cinco
veces más el número de casos de fiebre hemorrágica por dengue (FHD) que
los que se produjeron en los 30 años previos a 1980. A la fecha se carece de
una vacuna autorizada o de terapias efectivas para tratar este padecimiento y el
control del mosquito vector se dificulta debido a la emergencia de cepas
resistentes del mosquito vector. Adicionalmente, la patogénesis del dengue es
compleja y multifactorial, ya que aunque existen hipótesis ampliamente
aceptadas como la del ADE (“antibody dependent enhancement”) que explican
algunos datos clínicos, sus predicciones no se ajustan a algunas de las
características epidemiológicas observadas durante las epidemias de dengue.
Se han identificado 4 diferentes serotipos de virus dengue, de los cuales
el serotipo 2 parece ser el más virulento y ampliamente distribuido. Dentro de
este serotipo 2 existen múltiples variantes genotípicas que difieren en su
virulencia (Americano, Americano /Asiático, Asiático y Cosmopolitan). Los
genotipos Asiático y Americano/Asiático se asocian a casos más severos de
dengue. Mientras el genotipo Americano se ha relacionado solamente con
casos de fiebre por dengue.
Nosotros hemos caracterizado cepas de virus dengue aisladas en la
Península de Yucatán correspondientes a dos genotipos virales (Americano y
Americano/Asiático). Habíamos establecido que estos virus difieren
ampliamente en sus eficiencias de diseminación en el mosquito vector e incluso
en sus niveles de replicación y la inducción del efecto citopatico en cultivo de
celulares. Es probable que la intensidad con la que las células de mamífero
producen una respuesta inflamatoria contra estos tipos virales sea también
diferente. Nuestra propuesta es examinar algunas de las proteínas participantes
en la respuesta proinflamatoria en células infectadas con genotipos del virus
dengue (el Americano y el Americano/Asiático).
INTRODUCCIÓN
Situación del dengue en México
El dengue es una enfermedad viral transmitida por mosquitos que tiene
una gran importancia en la salud pública a nivel global. La situación del dengue
se ha agravado en las últimas décadas, cada año se presentan casos de
dengue en al menos 100 países de diversas regiones del mundo que incluyen
naciones de África, el sureste asiático, las islas del pacífico sur, el este del
mediterráneo y el continente americano (Derouich et al. 2003). La Organización
Mundial de la salud estima que un total de 50 millones de casos ocurren
anualmente, de los cuales unos 500,000 requieren hospitalización y 22,000
terminan por ser fatales. En nuestro continente la reemergencia del dengue ha
sido particularmente dramática (Gubler, 1998, 2002).
Las manifestaciones clínicas del dengue son la fiebre por dengue (FD),
la fiebre hemorrágica por dengue (FHD) y el choque hipovolémico por dengue
(CHD). Estas diferentes manifestaciones de la enfermedad pueden ser
observadas en infecciones virales con cualquiera de los cuatro serotipos
conocidos para el virus del dengue. La FHD/CHD son formas severas de la
enfermedad y sus principales características son las hemorragias en la piel
(petequias), encías, nariz e internas; la cavidad abdominal y pleural pueden
llenarse del plasma que escapa de los vasos sanguíneos hacia estos sitios.
Esto es el resultado del incremento significativo y masivo en la permeabilidad
vascular que ocurre como consecuencia de la infección con el virus y del cual
se desconoce el mecanismo.
En México, desde 1995 se ha suscitado un constante y alarmante
incremento en los casos de FHD. Tan sólo del 2006 al 2007, el número de
casos de FHD prácticamente se duplicó. La constante introducción o
reintroducción de genotipos y serotipos a zonas endémicas como la Península
de Yucatán (Díaz et al. 2006, Loroño-Pino et al. 2004), así como la existencia
de cepas de mosquito notablemente susceptibles (Bennett et al. 2002,
Richardson et al. 2006, Salazar et al. 2007) dificulta el control de la
enfermedad. Este panorama se agrava aún más ya que a la fecha no existen
vacunas autorizadas, ni terapias efectivas para su tratamiento. Por esta razón,
un mejor entendimiento de los mecanismos detrás de la patogénesis del
dengue contribuiría significativamente al diseño de mejores estrategias para
contrarrestar los fatales efectos de esta enfermedad.
La patogénesis del dengue
El incremento en la permeabilidad vascular durante los cuadros de FHD
y SHD conlleva a una repentina y masiva extravasación del plasma a los tejidos
y cavidades, estas incluyen la pleura y la cavidad abdominal. La inducción de
quimiocinas/citocinas y la activación del complemento por anticuerpos
preexistentes (cuando se dan en infecciones secundarias) bien puede contribuir
a la extravasación masiva observada en los cuadros de FHD y SHD (Avirutnan
et al. 1998). Sin embargo, el mecanismo preciso por el que este evento ocurre
continua siendo desconocido.
Se ha reportado que los niveles de virus circulante en sangre durante la
viremia correlacionan con la severidad de la enfermedad (Vaughn et al. 2000).
Estudios retrospectivos en pacientes indican también que los niveles
plasmáticos de la proteína viral NS1 correlacionan no solo con los niveles de
viremia sino que éstos son más altos en los pacientes que desarrollan FHD que
en aquellos con sólo DF (Libraty et al. 2002, Avirutnan et al. 2006).
La inmunidad preexistente contra alguno de los cuatro serotipos virales
constituye uno de los factores de riesgo más importantes para desarrollar FHD
o SHD, pero no el único. La potenciación de la respuesta mediada por
anticuerpos (ADE o antibody depended enhancement) explica esta
característica y es ampliamente aceptada para explicar la patogénesis del
dengue (Halstead 1983, Halstead, et al. 1983, Ferguson et al. 1999). Sin
embargo, esta teoría falla en explicar los múltiples casos severos de la
enfermedad que ocurren en infecciones primarias (Whichmann et al. 2004,
Loroño-Pino, com. pers.). Es claro que existen genotipos virales que están más
relacionados con la producción de casos de DHF, de hecho en el continente
Americano, la emergencia de la FHD/SHD se relacionan con la introducción de
variantes del sureste asiático (Loroño-Pino et al. 2004, Armstrong and RicoHesse 2001, Rico-Hesse et al. 1997).
La infección con dengue media una inusual activación de CD4+/CD8+ en
los pacientes, ésta parece responder a la sobreproducción de algunas
citocinas; se ha reportado que un cambio de respuesta del tipo Th1 al tipo Th2
puede resultar en manifestaciones severas de la enfermedad. Este cambio es
regulado por los niveles relativos de IFN-γ, IL-10, IL-12 y TGF-β [15]. Los altos
niveles de IL-8 claramente se asocian a casos de FHD [16-19]. Algunos otros
mediadores inmunes que se han asociado con la inmunopatología del dengue
son el MIP-1α y MIP-1β, los cuales pudieran contribuir a la supresión de la
medula ósea observada en los pacientes (Spain-Santana et al. 2001).
La NF-kB y la respuesta proinflamatoria
La respuesta inmune innata es la primera línea de defensa en contra de
los patógenos invasores. Esta depende de la activación de los receptores de
tipo Toll (TLRs), los cuales actúan como los sensores primarios reconociendo
una amplia variedad de componentes que son únicos a los diferentes tipos
microorganismos (e.j. LPS, dsRNA, peptidoglicano, etc).
Una vez que los patógenos han sido detectados por las células infectadas
se activan vías de señalización que inician la defensa del hospedero. Una red
efectiva de regulación genética es necesaria para modular una respuesta
celular efectiva y controlada en contra de los patógenos. Las vías de
señalización que son iniciadas por los TLRs culminan todas ellas en la
activación del factor nuclear NF-κB, el cual controla el perfil de la expresión de
citocinas activadas específicamente por la presencia del invasor.
Para la activación de genes relacionados con la respuesta
proinflamatoria, es esencial que NF-kB se transloque del citoplasma al núcleo
de la célula. La respuesta inmune contra la infección provocada por el virus del
dengue involucra la activación de linfocitos B, T, NKs y macrófagos así como la
producción de citocinas como: IL-2, IL-6, IL-8, IL10, IL-13, IL-18, interferones,
TNF-α, MCP-1 (Lin et al. 2005), además de la activación del complemento. El
balance entre los elementos de esta respuesta juega un papel central en la
severidad de las infecciones. La inmunidad preexistente contra alguno de los
cuatro serotipos virales constituye uno de los factores de riesgo más
importantes para desarrollar FHD o SSD. La potenciación de la respuesta
mediada por anticuerpos (ADE por antibody dependent enhancement) explica
esta característica y es ampliamente aceptada para explicar la patogénesis del
dengue (Chareonsirisuthigul et al. 2007, Halstead et al. 1983, Ferguson et
al.1999).
La infección con dengue media una inusual activación de CD4+/CD8+ en los
pacientes, relacionada con la sobreproducción de algunas citocinas. Se ha
reportado que un cambio de respuesta del tipo Th1 al tipo Th2 puede resultar
en manifestaciones severas de la enfermedad. Este cambio es regulado por los
niveles relativos de IFN-γ, IL-10 , IL-12 y TGF-β (Chaturvedi et al. 2008). Los
altos niveles de IL-8 claramente se asocian a casos de FHD (Lin et al. 2005,
Medin et al. 2006, Moreno-Altamirano et al. 2004, Raghupathy et al. 1998).
Algunos otros mediadores de la inmunopatología del dengue son el MIP-1α y
MIP-1β (Spain-Santana et al. 2001).
MATERIALES Y MÉTODOS
1) Obtención del virus del dengue
Los virus empleados pertenecen al serotipo 2 (genotipo americano/ asiático
y americano) y fueron aislados de pacientes infectados durante una epidemia
de dengue de 2002 en la Península de Yucatán. Estos virus se caracterizaron
y se utilizaron para generar los abastos virales de trabajo. Para ello se
infectaron células C6/36 las cuales son muy permisivas a la infección viral y
originan generalmente títulos virales entre 6-8 Log10 PFU/ml. Las células
C6/36 se crecen rutinariamente en medio L-15 Leibovitz con suero fetal bovino
al 10% y 1% L-glutamina.
El virus se colecto del sobrenadante de células infectadas a los 8 o10 días
post-infección dependiendo del efecto citopatico observado en las monocapas.
Se hicieron alícuotas y se procedió a caracterizarlas en cultivos. Estos abastos
virales fueron empleados en los estudios subsecuentes. La multiplicidad de
infección utilizada para la propagación de los virus fue de 0.01.
2) Diseño de los oligonucleótidos
Las secuencias de los primers que fueron utilizados para la amplificación
de las interleucinas, se tomaron del reporte de Nakamura y cols (Nakamura et
al., 2002). Estas fueron: 5'-GCA GTC TAC ACA GCT TCG GG-3' (primer para
IL-1ß 1S; nucleotidos [nt] 88 a 107 en el mRNA del factor IL-1ß inducido por
interferon γ; DDBJ/EMBL/GenBank no. D49950) y 5'-CCG CCT CAG CCT CCC
AAA G-3' (primer IL-1ß 1R; nt 820 to 810), 5'-GCC TTC GGT CCA GTT GCC
TT-3' (primer IL-6 1S; nt 22 to 41 en el mRNA humano IL-6;
DDBJ/EMBL/GenBank no. X04602) y 5'-GCA GAA TGA GAT GAG TTG TC-3'
(primer IL-6 1R; nt 586 a 567), y 5'-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GT-3'
(primer IL-8 1S; nt 102 a 122 en el mRNA para TNFα humano;
DDBJ/EMBL/GenBank no. M10988) y 5'-TCC TTG GCA AAA CTG CAC CT-3'
(primer IL-8 1R; nt 164 a 183) (12). Otros primers que se usaran para continuar
las amplificación incluyen el MCP-1 5'-ATG AAA GTC TCT GCC GCC CT CA-3'
(primer MCP-1 S1; nt 598 a 617 en el mRNA para el gene MCP humano;
DDBJ/EMBL/GeneBank no. M10988) y 5'-GAG ATC TGT GCT GAC CCC AA-3'
(primer MCP-1 R1; nt 197 a 216) y 5'-AGG CGC TCC CCA AGA AGA CA-3'
(primer TNF- S2; nt 129 a 148 en el mRNA para el TNF humano;
DDBJ/EMBL/GenBank no. M10988) y 5'-TCC TTG GCA AAA CTG CAC CT-3'
(primer TNF- R1; nt 164 to 183). Las muestras de RNA se obtuvieron de
células monocíticas THP-1 infectadas con el virus del dengue. Los cDNAs
correspondientes fueron amplificados por PCR en una mezcla de reacción (30
µl) conteniendo 10 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl2,
200 mM de cada dNTP, 1.0 U de Taq polymerase (Takara, Kyoto, Japan), y 2.5
µM de cada par de plasmidos. La amplificación se llevo a cabo por 40 ciclos
que consistieron de una desnaturalización de (1 min a 94°C), alineamiento (1
min a 55°C), y extensión (2 min a 72°C). Los productos de PCR se resolvieron
en geles de agarosa al 3% (IL-1ß, IL-6 y IL-8) y al 2% (MCP-1 y TNF- ) y se
tiñeron con bromuro de etidio y se digitalizaron en un fotodocumentador.
3) Tiempo real RT-PCR
Se obtuvo RNA total de cultivos celulares infectados de la siguiente manera:
a) con el virus de genotipo americano/asiático, b) con virus del genotipo
americano y c) solo medio (células testigo). Esta colecta se realizo a los
siguientes tiempos: 1, 3, 5 y 7 días post-infección. Se llevo a cabo la extracción
de RNA total usando Trizol. La concentración total
Empleando la reacción de la trascripción reversa se sintetizará ADN
complementario. La amplificación de los productos de PCR y la determinación
del nivel de expresión de las citocinas se realizará en un termociclador de PCR
en tiempo real 7500 de Applied Biosystems. En la amplificación se empleó un
protocolo universal diseñado para sondas TaqMan (Applied Biosystems). Las
sondas fueron especifícas los mensajeros de las citocinas IL-1β, IL-6, IL-8, IL10, INFγ y TNF-α prediseñadas por Applied Biosystems. La subunidad 18S del
ARN ribosomal será utilizada como control endógeno para normalizar los
niveles de expresión de las citocinas. En estos ensayos se utilizó IL-8 como
control positivo, ya que se sabe que esta citocina aumenta in vivo en las
infecciones con dengue.
4) Western blots para detectar Erk1/2.
Para llevar a cabo los Western blots para detectar pErk1/2, se lisaron tanto
cultivos infectados con el virus como los controles no infectados, a estos se les
realizó una inmunotinción y se observo en el microscopio confocal para ver la
relocalización de la forma fosforilada de Erk1/2, la cual indica activación.
Para los Western se llevo a cabo la lisis de los cultivos infectados usando
colorante de Laemli e hirviendo por 7 min. Estas muestras se corrieron en geles
de SDS-PAGE al 10 %. Se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se
incubaron con el anticuerpo anti Erk 1/2.
RESULTADOS
Inicialmente se llevo a cabo la caracterización de las infecciones con los
diferentes aislados valorando el efecto citopatico en los cultivos celulares de
C6/36. Estos cultivos se utilizaron para llevar a cabo la propagación inicial de
los virus estudiados y generar los stocks de trabajo. Se puede observar en la
Fig 1, que ambos virus difieren en el efecto citopatico producido. La aparición
de células fusionas es más prominente en el virus del genotipo americano/
asiático que en americano solo.
Figura 1. Efecto citopatico observado producido por los dos tipos de virus de
dengue en las monocapas de células C6/36, 9 días después de la infección
inicial al utilizar una MOI de 0.001.
Posteriormente estos virus fueron titulados en placa utilizando células
LLC-MK2, donde tambien se observo una significativa diferencia en la
morfologia de las placas liticas como se aprecia en la Figura 2.
Se llevo a cabo la extracción de RNA de las células THP-1 para
estandarización de la detección de las citocinas en estudio. Estas células se
incluyeron sin tratamiento y solo para observar el buen fucionamiento de los
primers antes de proceder a hacer las detecciones por tiempo real RT-PCR en
las células infectadas (Figura 3).
Figura 3. Producto de las amplificaciones obtenidas en un ensayo de
disociación empleando primers específicos para diferentes citocinas. Los
productos fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 3 %.En
el carril 1 se observa el marcador de peso molecular (MM) y los carriles
siguientes el TNF-α (115pb), IL-2 (117pb), 4 MCP-1 (114pb), MIP-1 (112pb), e
IL-6 (145pb).
Se observo la activación de la proteina Erk 1/2 principalmente con el
virus del genotipo amaericano/asiático (Figura 4 y 5).
Figura 4. Activación de la MAPK Erk1/2. Esta es una molécula de señalización
cuya fosforilación esta relacionada con la activación de la respuesta
proinflamatoria.
IMPACTO
El presente trabajo establece un avance significativo en la evaluación de
la respuesta inmune a la infección por dengue, esto nos permite tener una
manera de evaluar diferentes serotipos y genotipos virales e incluso abre la
posibilidad a examinar otros tipos celulares.
Permitio la realización del servicio social y el avance el la tesis de
Licenciatura de la estudiante de QBP Marisol Terreros Tinoco, quien al finalizar
su tesis podrá presentar sus resultados en el Congreso Nacional de Virología
que tendrá lugar en la Ciudad de Merida Yucatán en Noviembre de 2009.
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