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MI-0507
Aproximaciones proteómicas y genómicas en la
identificación de bacilos gram negativos pigmentados
anaerobios
Fernández Canigia L1, Fox B1, Berger M.A1, Costa A1, Ibañez M.E1, Gonzalez Fraga S1, Radice M2, Gutkind G2
1- Lab. microbiología, Laboratorio Central, Hospital Alemán 2- Facultad de Farmacia y Bioquímica- UBA, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
[email protected]
Introducción:
Los bacilos gram-negativos pigmentados anaerobios (BGNPA) pertenecen principalmente a dos géneros, Prevotella y
Porphyromonas. Forman parte de la microbiota de las mucosas, especialmente orofaríngea y del tracto genitourinario.
Se asocian a infecciones odontógenas, de piel y partes blandas, abdominales y genitales. La identificación por pruebas
fenotípicas es dificultosa ya que en los últimos años se han descripto nuevas especies que las comparten, lo que hace
difícil su diferenciación.
Objetivo:
Evaluar la capacidad de la espectrometría de masa (MALDITOF MS)
y de la secuenciación del gen 16S rRNA para la identificación (ID) de
BGNPA.
P. gingivalis
Materiales y métodos:
Aislamientos: Se incluyeron 66 aislamientos de BGNPA identificados a nivel fenotípico basados en la producción de
pigmento marrón-negro, patrón de sensibilidad empleando discos de antibióticos (Colistin 30 g, Vancomicina 5 g,
Kanamicina 1000 g) y la producción de lipasa e indol:
Prevotella intermedia (Pi)/nigrescens (Pn):44
Prevotella spp.:2
Porphyromonas spp.: 20
ID por secuenciación del gen ARNr 16S: Los aislamientos fueron identificados mediante la amplificación y
secuenciación del gen ARNr 16S (ARNr16SSec). Se utilizaron los primers: 27F-5´AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´
(posición 8 a 27 en Escherichia coli ARNr) y 1492-R 5´-GYTACCTTGTTACGACTT-3´ (posición 1492 a 1509 de E. coli).
El tamaño esperado del amplicón fue de 1501 pb. El análisis se realizó con la herramienta BLAST V2.0 del NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Se consideró una divergencia >0,8% para identificar a nivel de especie (CLSI MM18-A).
ID por MALDITOF MS: se realizó con el método de extracción en tubo. Los resultados se analizaron con el Sistema
Bruker Microflex LT versión 3.1. Se consideró como ID confiable a nivel de especie un score ≥1,7 y una diferencia >10%
entre los scores del primer taxón de la lista y el siguiente. Scores <1,5 se consideraron ID no confiable.
Resultados:
Identicación presuntiva
MALDI-TOF MS
Secuenciación del
ID
Media score
Ingresos en la base de
gen ARNr 16S (n) correcta
(rango) o
datos Bruker
calidad espectro
2 (1,8-2,3)
P. Intermedia (26)
26
Prevotella
melaninogenica
/jejuni/histicola (2)
Porphyromonas.
asaccharolytica/
uenonis (17)
P. asaccharolytica (3)
Porphyromonas
gingivalis (3)
18
< 1,3/Buena
0 (ID no
confiable)
0 (ID no
confiable)
0 (ID no
confiable)
Prevotella intermedia DSM
20706T DSM
Prevotella spp.
2 (1,8-2,5)
P. nigrescens (18)
Porphyromonas spp.
< 1,3/Buena
< 1,3/Buena
1,8
3
Prevotella nigrescens DSM
13386T DSM
Prevotella nigrescens
P9flue_16_2AN USH
Prevotella melaninogenica
110706_C3 LUMC
Prevotella melaninogenica
110706_G7 LUMC
Prevotella melaninogenica
DSM 7089T DSM
Prevotella melaninogenica
IBS_MS_43 IBS
MALDI-TOF MS
Secuenciación del gen ARNr 16S
Porphyromonas
asaccharolytica 29_644 IBS
Porphyromonas gulae DSM
15663T DSM
Porphyromonas levii
1347_D337 AHVLA
Porphyromonas macacae
110324_35 PNU
Porphyromonas sp
110324_98 PNU
Porphyromonas gingivalis
CCM 3985 CCM
Porphyromonas gingivalis
DSM 20709T DSM
Dendograma de los espectros de BGNPA ingresados a la base de
datos de MALDI-TOF MS.
No se observa variación intra especie en el género Prevotella y en P. gingivalis.
Se observa mayor variación en P. asaccharolytica/uenonis,
sin embargo no se pueden diferenciar las especies entre si
Conclusiones y discusión:
 La tecnología MALDITOF MS permitió la obtención de espectros de calidad en todos los BGNPA analizados.
 Tanto la ARNr16SSec como el MALDITOF MS permitieron diferenciar todos los aislamientos de Pi y Pn así como Pg.
 Las limitaciones en la ID de Pau y Pm no se deberían a interferencias debidas al pigmento o a la extracción de
proteínas, sino a una base de datos incompleta y al escaso poder discriminativo de la ARNr16SSec. En estos dos
últimos grupos sería necesaria una mejor definición taxonómica para lograr identificar a nivel de especie.
ALAM 2016