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NEURONAS NEGRAS; ESTADO METABÓLICO DE LA NEURONA
O ARTEFACTO EN RATA WISTAR.
Silva Silva S.1; Carabez Trejo A.2
1
Universidad Autónoma de Zacatecas; 2Instituto de Neurobiología, UNAM
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo es analizar la argirofília de las neuronas negras (DNs),
de acuerdo al tipo y tiempo de fijación, Su origen es provocado por diferentes factores
dentro de la célula, como lo son elementos intracelulares (p.ej; cuerpos de Nissl),
cambios energéticos (deficiencia en la producción de ATP, anoxia, hipoxia, etc.),
deficiencia de la función de los transportadores, y un metabolismo alterado, que lleva a
un stress metabólico, y como consecuencia una recuperación o la muerte celular. En el
SNC, se ha descrito la presencia de las llamadas “neuronas obscuras” (dark neurons),
descritas por Gallyas y Zoltay; 2003. Estas células se describieron inicialmente en el
hipocampo de ratas sometidas a diversos tipos de stress, entre ellos la hipoxia. Estos
estudios han permitido demostrar que el grado de compactación citoplásmica observada
se debe a un estado metabólico, más que a un artefacto de tinción, con lo que se les
había asociado anteriormente en la histología normal y en la patología.
INTRODUCCIÓN
La formación de neuronas negras puede ser iniciada por fuerza física, así como lesiones
en la cabeza (Gallyas et al., 1992), o shock eléctrico (Gallyas et al., 1993), o por
condiciones patometabólicas, incluyendo hipoglicemia (Auer et al., 1985), estado
epiléptico (Igvar et al., 1998) e isquemia (Petito and Pulsinelli, 1984).
Independientemente de la naturaleza del estado iniciado, una proporción de neuronas
negras se recuperan, mientras que otras mueren (Auer et al., 1985; Csordás et al., 2003).
La mayoría de la información sobre la basofilia, acidofilia y argirofilia de neuronas
negras ha sido obtenida mediante experimentos que inician la formación de neuronas
negras en un individuo en puntos marcados a diferentes tiempos. Consecuentemente en
algún tiempo y punto dado, siguiendo el estado de iniciación, pueden estar presentes
neuronas negras en diferentes etapas de recuperación o muerte. (Gallyas et al., 2005).
Las características morfológicas de las células afectadas, que son tradicionalmente
llamadas negras, son: (a) hiperbasofilia de el citoplasma, (b) picnósis nuclear, (c) grave
encogimiento de la célula, (d) aumento de la densidad electrónica, (e) compactación de
los elementos ultraestructurales, y (f) agregación de la cromatina nuclear con un modelo
no apoptótico. (Gallyas et al., 2004).
La formación de las células negras se ha reportado que ocurre en las células
somatotrópicas de la adenohipófisis, células reticulares de el timo, células principales
del cuerpo carotido, células corticales de la glándula suprarrenal, células epiteliales de la
cornea, células de los túbulos del riñón, los queratinocitos de la epidermis, células
hepáticas y neuronas (review by Harmon, 1987), y también en astrocitos (Tóh et al.,
1997). En las neuronas, la formación de las células negras es iniciada en muchas
enfermedades humanas, así como hipoglicemia, isquemia, estados epilépticos y lesiones
en la cabeza, y puede ser iniciada en animales experimentales por excesiva
estimulación, shock hiperosmótico, intoxicación con ácido fólico, metoxipiridoxina, 6hidroxidopamina, 3-acetilpiridina, colchicina, 3-aminopiridina, ácido 3-nitropropionico
(reviewed by Gallyas et al., 1990), y también por shock eléctrico (Csordás et al., 2003).
Las neuronas son particularmente objetos apropiados de explicación de los mecanismos
de formación de células negras. Debido a que poseen largas, y ramificadas dendritas que
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siempre están envueltas en la compactación ultraestructural (Gallyas et al., 2004). La
tinción argirofília III es un método útil para la detección de neuronas negras (DNs) y
proporciona una medida anticipada de estados histopatológicos después de varios
insultos cerebrales.
MÉTODOS
Ratas Wistar control con peso de entre 180 hasta mas de 700 g, (se presentan resultados
de 2 ratas de 280 g) fueron anestesiadas con pentobarbital 40 mg /Kg de peso. Bajo
anestesia profunda se expone el corazón y por cánula intracardiaca en la aorta se
perfunden con solución salina fisiológica (NaCl al 0.9%) por 30 segundos seguido de la
solución fijadora que consiste en: 300ml de cacodilato de sodio 0.2 M, 100 ml de
paraformaldehído al 20 %, 50 ml de CaCl2 0.1 M, 250 ml de Polivinilpirrolidona K25
(PVP) al 10%, 50 ml de glutaraldehído al 25%), a pH 7.4, y se afora a 1 L. De esta
solución se pasaron 400 ml a cada rata, a flujo rápido por 1 minuto, y el resto a flujo
lento (17.5 ml por minuto) Una de las dos ratas se deja sin tocar por 5 horas, al cavo de
las cuales se decapita y se diseca el SNC, posteriormente de separa el cerebelo y se
obtiene una rebanada de aprox. 150 μm, (Gallyas modificado) del resto del cerebelo se
deja otra rebanada por una semana en el mismo fijador a TA, para el procedimiento de
Ishida. El resto se procesa para el método de histología. La 2 se mantiene sin tocar en
bolsa sellada por 24 horas como lo propone Gallyas en su metodología. Siendo el resto
del procedimiento el mismo.
Para las condiciones descritas los tejidos se colocan en medio de lavado (sacarosa al
0.25M en cacodilato 0.1 M) a 4°C, por 24 horas aproximadamente con varios cambios
del medio de lavado. La postfijación se hace con OsO4 (tetraóxido de Osmio) por 2
horas, al finalizar el tiempo se decanta el OsO 4 y se lava con varios cambios de medio
de lavado, se incuban con ácido tánico (mordente) al 1%, a temperatura ambiente por 30
minutos, lavar nuevamente 4 veces por 15 minutos, decantar medio de lavado e incubar
con acetato de uranio al 1% (en EtOH 15%) por 30 minutos a temperatura ambiente en
la obscuridad, lavar con EtOH al 15%. Los tejidos se deshidratan con 2 cambios de 10
minutos c/u, con EtOH al 30% , 50%, 70%, 90%, 96%, alcohol absoluto 2 veces por 30
minutos, la primera a 4 °C, y la segunda a temperatura ambiente, se continúa con 2
cambios de oxido de propileno 2 veces por 30 minutos a temperatura ambiente, y se
añade resina Epóxica diluida 1:1 con óxido de propileno, se deja en infiltración 24-36
horas, continuar la infiltración con resina completa por 8 horas en rotador. Los bloques
de tejido se colocan en moldes planos identificados cada uno. El tejido se orienta de
acuerdo al plano de corte deseado. La polimerización de la resina se hace en estufa a 60
°C por 36 horas. Se selecciona un bloque conteniendo el tejido orientado, se realiza el
tallado del bloque. Del área seleccionada se hacen cortes semifinos (1μm) y se
transfieren a un portaobjetos, para su adhesión al portaobjeto se calienta por un minuto,
se cubre con azul de toluidina al 2 % en boratos sin ajustar el pH por un minuto, se
lavan con agua destilada para eliminar el colorante, observar, hacer cortes finos, con
navaja de diamante, depositar en rejillas dentro de cajas petri, colocar cada rejilla sobre
una gota de uranilo y calentar en estufa a 60°C por 30 min., enjuagar con agua, y
colocarlas ahora sobre una gota de plomo por 15 minutos a temperatura ambiente,
enjuagar y llevar al microscopio electrónico, observar y reportar.
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RESULTADOS
Fig. 1. Capas de neurona normal
(a), capa granular (b), capa
molecular (c), células de Golgi
(d).Cerebelo R1 5 hrs de fijación
Fig. 2. Neurona normal, R1
24 hrs de fijación
Fig. 4. Neurona (a). Cerebelo R1
5 hrs de fijación-24 hrs postfijación.
Fig. 5. Folia cerebelosa a baja
amplificación. Capa molecular (CM),
capa de células de purkinje (CCP),
capa decélulas de la granulosa (CGC)
Fig. 7. Cerebelo R1 5 hrs de
fijación-24 hrs post-fijación
Fig. 3. Neurona negra (NN-a).
Cerebelo R2 24 hrs de fijación.
Obsérvese la densidad y
compactación en comparación con
la fig. 2 y 4.
Fig. 6. Cerebelo R1 5 hrs de fijación
Fig. 8. Cerebelo R2 24 hrs. De
fijación. Obsérvese neuronas
negras y algúnas em proceso de
desaparición.
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NOTA: Figuras. 1, 2, 3, 4, 5 y 6 son resultados del método de Gallyas y Gallyas
modificado Figuras. 7, 8, 9, 10 y 11, corresponden a los resultados de histología.
CONCLUSIONES
En los métodos llevados a cabo: Gallyas y Gallyas modificado se determinó que con 5
hrs de fijación-24 hrs post-fijación aparece argirofília parcial, y con 24 hrs. de fijación,
se observó la presencia de neuronas negras lo que quiere decir que hay alteración a nivel
neuronal.
En el
presente método utilizado se encontraron escasas neuronas negras, puesto que las ratas
eran control, es decir, no se encontraban alteradas o expuestas intencionalmente a
solventes tóxicos o algún tipo de stress condicionado o previamente establecido, sólo al
tipo y tiempo de fijación. En el método de Ishida, con 5 hrs de fijación se observan
neuronas negras, es decir se encuentran muy densas, con 5 hrs de fijación-24 hrs postfijación hay escasas neuronas, además de que algunas presentan mayor densidad que
otras y con 24 hrs de fijación se observa entre dos neuronas un estadio progresivo de
desaparición. Por lo que se deduce que las neuronas negras son producto del stress
metabólico presente en la neurona y no un artefacto de tinción.
El método que se llevó a cabo para la identificación de neuronas negras, es confiable, ya
que las neuronas afectadas o neuronas negras son identificadas con seguridad, así como
axones y otros elementos de las neuronas.
BIBLIOGRAFÍA
Andrea Zsombok, Zsolt Tóth, Ferenc Gallyas., “Basophilia, acidophilia and
argyrophilia of “dark” (compacted) neurons during their formation, recovery or
death in an otherwise
undamaged environment”, Journal of Neuroscience
Methods 142 (2005) 145-152
Ferenc Gallyas, Orsolya Farkas, Mária Mázló., “Gel-to-gel phase transition may occur
in mammalian cell: Mechanism of formation of “dark” (compacted) neurons”,
Biology of the Cell 96 (2004) 313-324.
K. Ishida, H Shimizu, H Hida, S. Urakawa, K. Ida and H. Nishino., “Argyrophilic dark
neurons represent various states of neuronal damage in brain insults: some come
to die and others survive”. Neuroscience 125 (2004) 633-644.
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