Download Instituto Politécnico Nacional Canales de potasio activados por

Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Sección de estudios de posgrado e investigación
Canales de potasio activados por sodio en las
neuronas aferentes vestibulares de rata
Tesis
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
Maestra en Ciencias Quimicobiológicas
PRESENTA:
Q.F.B. Blanca Aurora Cervantes Sánchez
Directores de Tesis:
Dr. Enrique Soto Eguibar
Dr. Sergio Roberto Zamudio Hernández
México, D.F.
Agosto 2008
1
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyt) por el apoyo que me
brindó para realizar estudios de Maestría en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
del Instituto Politécnico Nacional mediante la beca no. 202188.
2
Índice de figuras
Figura 1.1. Localización de las divisiones vestibular y coclear
del oído interno
Figura 1.2. Células ciliadas tipo I y II
1
2
Figura 1.3. A. Microscopía electrónica de barrido del sáculo de la rana toro
B. Esquema de la deflexión de los cilios y consecuente activación
de las uniones de punta ("tip links") de los
canales mecanotransductores
3
Figura 1.4. Dibujo esquemático de una neurona aferente
vestibular y sus relaciones sinápticas
Figura 1.5. Subunidades de Slack y Slick
5
21
Figura 7.1. Registro de corrientes de K+ dependientes de Na+ en
configuración de célula completa
36
Figura 7.2. Registro de corrientes totales en condiciones control
y cuando se aplicó TTX 200 nM
38
Figura 7.3. Registro de corrientes totales en condiciones control y
cuando se aplicó TTX 100 nM
39
Figura 7.4. Corriente saliente y corriente entrante en presencia de
Na+ extracelular, cuando se perfundió TTX 100 nM
y cuando se aplicó la solución de lavado
41
Figura 7.5. Corriente de Na+ y corriente entrante de potasio dependiente
de Na+ en condiciones control en negro y después de
aplicar la toxina de anémona CgNa 10 µM
42
Figura 7.6. Registro de corrientes totales en condiciones control
y cuando se perfundió ouabaína 1 mM para
dos células con capacitancia de 23.65 pF y 11.67 pF 44
Figura 7.7. A. Relación densidad de corriente entrante contra voltaje
B. Curva de conductancia normalizada contra el
voltaje para la corriente saliente en condiciones control
3
y cuando se perfundió oubaína 1mM
45
Figura 7.8. Corriente saliente y corriente entrante en condiciones
control y cuando se perfundió 1 mM de ouabaína
para bloquear la ATPasa Na+/K+
46
Figura 7.9. Registro de corrientes totales en condiciones control
y cuando se reemplazó Na+ por Li+
47
Figura 7.10. Registro de corrientes de K+ dependientes de Na+
en configuración de célula completa, en presencia
de Na+ extracelular, cuando el Na+ fue sustituido por Li+
y cuando se reincorporó el Na+ a la solución extracelular
48
Figura 7.11. Potencial de acción generado con una inyección
de corriente de 1.6 nA
49
Figura 7.12. Registro en fijación de corriente de la respuesta de la
membrana ante pulsos de corriente de corriente de
-0.5 a 0.1 nA
50
4
Índice de tablas
Tabla I. Propiedades de los canales de KNa en células
excitables de diferentes vertebrados
13
Tabla II. Distribución de canales Slack y Slick en el cerebro de rata
23
Tabla III. Soluciones utilizadas en el registro electrofisiológico
30
Tabla IV. La TTX modificó la activación de la corriente
de K+ dependiente de Na+
37
Tabla V. La eliminación de Ca2+ no modificó la activación de los
canales KNa
40
Tabla VI. La toxina CgNa no modificó significativamente a los canales KNa 42
Tabla VII. El bloqueo de la bomba Na+/K+ con ouabaína aumentó
la amplitud de la corriente KNa
Tabla VIII. Parámetros del potencial de acción en las neuronas aferentes
43
49
Tabla IX. Efecto del Li+ sobre la resistencia de membrana de
las neuronas aferentes vestibulares
51
5
Abreviaturas
Ach
acetilcolina
ADP
del inglés, despolarizing afterpotential
AHP
del inglés, afterhiperpolarization
ASIC
del inglés, Acid Sensing Ionic Channels
ATP
trifosfato de adenosina, siglas en inglés
ATPasa
enzima que hidroliza el ATP
BK
canales de alta conductancia
CgNa
condylactis gigantea
CO2
dióxido de carbono
dv
derivada del voltaje
d-TC
d-tubocurarina
E
embrionario
EC50
activación media máxima
Ek
potencial de equilibrio
Extra.
extracelular
FS
del inglés, fast-spiking
gmax
conductancia máxima
HVA
corriente de Ca2+ dependiente de voltaje de alto umbral
IB
del inglés, intrinsically bursting
Ih
corriente activada por hiperpolarización
IK
canales de conductancia intermedia
IKA
corriente de potasio transitoria de salida
IK(Ca)
corriente de potasio dependiente de Ca2+
IK1
corriente de potasio rectificadora de entrada
IK,RD
corriente de potasio rectificador retardado
IM
inhibición metabólica
Intra.
intracelular
IR
canales resistentes a bloqueadores
Iss
corriente en el estado estable
6
[ K ]ext
concentración de potasio extracelular
[ K ]int
concentración de potasio intracelular
K+O
potasio extraceluar
K+i
potasio intracelular
KNa
canales activados por sodio
LVA
corriente de Ca2+ dependiente de voltaje de bajo umbral
mOsm
miliosmoles
[Na]i
concentración de Na+ intracelular
ND
no fue determinado
NMCT
neuronas del núcleo medio del cuerpo trapezoide
P
postnatal
RCK
del inglés, regulator of K+ conductance
Rm
resistencia de membrana
RS
del inglés, regular- spiking
s
pendiente
SK
canales de baja conductancia
Slack
del inglés, sequence like a Ca2+-activated K+ channel
Slick
del inglés, sequence like an intermediate conductance K+
channel
TTX
tetrodotoxina
UV
ultravioleta
V
voltaje
VH
potencial de sostenimiento
Vm
voltaje de membrana
V1/2
potencial al cual ocurre el 50% de la conductancia
Tau
constante de tiempo
7
Resumen
Las neuronas aferentes vestibulares transmiten información acerca de las
aceleraciones angulares y lineales durante los movimientos de la cabeza. In situ,
estas neuronas muestran patrones de descarga heterogéneos, que podrían ser
producidos por sus propiedades intrínsecas, razón por la cual es importante definir
el conjunto de conductancias iónicas que se expresan en ellas. Es por eso, que
decidimos estudiar si las neuronas aferentes vestibulares expresan una
conductancia de potasio activada por sodio que pueda estar influyendo en su
patrón de descarga. Los canales de potasio activados por sodio (KNa) se
describieron por primera vez en miocitos cardiacos de cobayo; posteriormente
fueron caracterizados en varios tipos neuronales. Se ha reportado que en
neuronas piramidales de la capa V de la corteza cerebral, la sustitución
extracelular de Na+ por Li+ genera una corriente entrante a través de los canales
de Na+ dependientes de voltaje que no altera los potenciales de acción y sin
embargo, inhibe la posthiperpolarización que sigue a eventos cortos tales como
ráfagas individuales de potenciales de acción. El objetivo de este trabajo fue
conocer si la corriente de potasio activada por sodio se expresa en las neuronas
aferentes vestibulares y determinar su papel funcional. Para estudiar la expresión
funcional de la corriente KNa se utilizaron técnicas de fijación de voltaje y de
corriente, en cultivo primario de neuronas aferentes vestibulares de rata neonata
(P7 a P10). Se usaron varias estrategias experimentales para evidenciar la
presencia y el papel fisiológico de la corriente de KNa. Se usó tetrodotoxina (TTX) a
una concentración de 200 nM, para determinar la corriente de Na+ entrante
medida al pico. Se encontró que ésta se bloqueó. La corriente saliente después de
la aplicación de TTX fue substraída de la corriente control mostrando una
corriente transitoria la cual duró cerca de 20 ms y la corriente al pico fue de 2.3 ±
0.7 nA (n = 4). La aplicación de la toxina de anemona CgNa la cual se ha
demostrado que hace más lenta la inactivación de los canales de Na+, incrementó
la constante de tiempo de inactivación 128.8 ±19.7 % y concomitantemente la
corriente saliente medida en la cola se incrementó 5.6 ± 2.4% (n = 4). Cuando se
reemplazó extracelularmente el Na+ por la colina, la corriente entrante de Na+
disminuyó completamente y la corriente saliente al pico se redujo 40.1 ± 1% (n =
5). Cuando se bloqueó la bomba Na+-K+ con ouabaína (1 mM) se encontró que la
amplitud de la corriente saliente medida al pico se incrementó significativamente
31 ± 12%, y que la corriente entrante de Na+ disminuyó significativamente 30 ±
5.4% (n = 9). Cuando se reemplazó extracelularmente el ión Na+ por Li+, la integral
de la corriente saliente medida al pico disminuyó significativamente 33 ± 8.5%.
Mientras que la integral de la corriente entrante fue medida donde los valores de
corriente entrante con Na+ y con Li+ no fueran diferentes significativamente (n =
10). En registros de fijación de corriente la sustitución extracelular de Na+ por Li+
disminuyó, de forma reversible, la posthiperpolarización del potencial de acción en
un 6 ± 0.8% (n = 4). Estos resultados sugieren que la corriente de KNa se expresa
en las neuronas aferentes vestibulares participando en la fase de
posthiperpolarización del potencial de acción.
8
Abstract
Vestibular afferent neurons transmit information about the angular and linear
accelerations during movements of the head. In situ, these neurons show
heterogeneous discharge patterns, which may be due to their intrinsic properties,
so it is important to define the ionic conductances that are expressed by them.
Therefore, we decided to study whether the vestibular afferent neurons express a
sodium activated potassium conductance that may be influencing their discharge
pattern. Sodium activated potassium channels (KNa) were described for the first
time in cardiomyocytes of guinea pig; subsequently they were characterized in
different neuronal cells. In pyramidal neurons in the V layer of the cerebral cortex,
has been reported that, replacement of extracellular Li+ by Na+ generates an
inward current across Na+ voltage-dependent channels that does not alter the
action potential but inhibits posthyperpolarization following events such as short
bursts of action potentials. The aim of this study was to determine whether sodium
activated potassium current is expressed in vestibular afferent neurons and
determine their functional role. To study the expression of KNa channels, we used
voltage clamp and current clamp techniques. We utilized vestibular afferent
neurons from Wistar rats (postnatal days (P) 7 to 10). Several experimental
strategies were used to reveal the presence and functional role of KNa current. By
using tetrodotoxin (TTX) 200 nM, the peak inward Na+ current was completely
blocked. Outward current after TTX application was subtracted from control current
showing a transient current with duration of 20 ms and peak amplitude of 2.3 ± 0.7
nA (n = 4). The application of the anemone toxin CgNa, which has been shown to
slow the Na+ channel inactivation, increased the Na+ current inactivation time
constant 128.8 ±19.7 % without significantly affecting the peak inward current, and
concomitantly the outward current measured in the tail increased 5.6 ± 2.4%
(n = 4). We found that by replacing Na+ by choline in the extracellular solution there
was a complete reduction of the inward Na+ current and the peak outward current
decreased 40.1 ± 1 % (n = 5). Subtraction of the current after choline application
and control current shown that choline affected both a sustained and transient
components, thus indicating a complex action of choline on the outward currents.
Oubain (1 mM) decreased the peak inward Na+ current by 30.4 ± 5.4% and the
peak outward increased 30.6 ± 11.8% (n = 9). We found that by replacing Na+ by
Li+ in the extracellular solution the outward current decreased 32.9 ± 8.5 %
(n = 10 ) and the inward Na+ current did not significantly change. In current clamp,
the replacement of Na+ by Li+ decreased 6 ± 0.8% (n = 4) the afterposthiperpolarization amplitude in a reversible form. These results suggest that
KNa is expressed in the vestibular afferent neurons and, it may contribute to the
afterposthiperpolarization process of the action potential.
9
Índice
Índice de figuras
i
Índice de tablas
ii
Lista de abreviaturas
iii
Resumen
iv
Abstract
v
I. INTRODUCCIÓN
1
I. 1. Estructura del sistema vestibular
1
I. 2. Mecanotransducción
3
I. 3. Potencial receptor de la célula ciliada
4
I. 4. Neurotransmisión aferente
4
I. 5. Neurotransmisión eferente
6
I. 6. Conductancias iónicas de las aferentes vestibulares
6
I. 9. Canales de potasio activados por sodio intracelular
9
I. 10. Propiedades de los canales de potasio activados
9
por sodio en miocitos cardiacos de mamífero
I. 11. Propiedades de los canales KNa en neuronas
10
I. 12. Evidencia de una corriente macroscópica de K+
13
dependiente del influjo de Na+ en neuronas
I. 13. Propiedades de los canales Slack y Slick
18
I. 14. Localización de los canales Slack y Slick en el cerebro
21
I. 15. Farmacología de los canales de potasio activados por sodio
I. 16. Papel de los canales KNa en condiciones patológicas
24
26
II. JUSTIFICACIÓN
27
III. HIPÓTESIS
27
IV. OBJETIVO GENERAL
27
V. OBJETIVOS PARTICULARES
28
VI. MATERIAL Y MÉTODOS
VI. 1. Preparación de cultivo
28
VI. 2. Registro de fijación de voltaje en neuronas aferentes
vestibulares
29
10
VI. 3. Reactivos
30
VI. 4. Se emplearon las siguientes estrategias para evidenciar
la corriente de KNa
31
VI. 5. Análisis de datos
32
VI. 6 Análisis estadístico
34
VII. RESULTADOS
35
VII. 1. La sustitución extracelular de Na+ por colina
reveló una corriente de K+ sensible a Na+
35
VII. 2. La inhibición de la corriente de Na+ por TTX
modifica la activación de la corriente de K+ dependiente de Na+
37
VII. 3. La concentración de calcio extracelular no modificó
significativamente a la corriente de potasio dependiente de sodio
38
VII. 4. La toxina CgNa no modificó significativamente a la corriente
saliente de K+
41
VII. 5. El bloqueo de la ATPasa Na+-K+ con ouabaína aumentó
la amplitud de la corriente de K+ dependiente de Na+
43
VII. 6. La corriente de potasio activada por sodio no es activada
por litio
46
VII. 7. Papel funcional de la corriente de potasio activada por sodio 48
VIII. DISCUSIÓN
52
VIII. 1. Concentración de Na+ necesaria para la activación
de los canales de KNa
54
VIII. 2. Comparación de los canales de KNa con los genes
clonados que codifican para las corrientes de KNa
55
VIII. 3. Papel funcional de los canales de KNa
56
IX. CONCLUSIONES
57
X. PERSPECTIVAS
57
XI. BIBLIOGRAFÍA
58
11
I. INTRODUCCIÓN
I. 1. Estructura del Sistema vestibular
El sistema vestibular detecta las aceleraciones lineales y angulares de la cabeza,
desempeñando un papel importante en el control del equilibrio. La información
detectada por el sistema vestibular es enviada a núcleos vestibulares del tronco
encefálico integrándose con información visual y propioceptiva, para así poder
determinar una orientación espacial en tres dimensiones.
El vestíbulo está formado por el utrículo, el sáculo y los tres canales
semicirculares (Fig. 1.1.). El utrículo y el sáculo detectan las aceleraciones
lineales, incluidas las producidas por gravedad, y los canales semicirculares
sensan las aceleraciones angulares debidas a la rotación de la cabeza.
Figura 1.1. Localización de las divisiones vestibular y coclear del oído interno (Modificado de
Goldberg y Hudspeth, 2001).
Cada uno de estos órganos que conforman el sistema vestibular está
revestido de una lámina continua de células epiteliales. En este epitelio hay
células de soporte, terminaciones nerviosas aferentes, eferentes y las células
sensoriales conocidas como células ciliadas que tienen estereocilios y un cinocilio
12
en la parte apical. Este último le confiere a la célula una polaridad morfológica.
Las células ciliadas son células epiteliales especializadas. Funcionalmente
son mecanorreceptores secundarios o no neuronales, pues no generan
potenciales de acción y se relacionan con las neuronas aferentes por medio de
sinapsis. Desde el punto de vista morfológico se diferencian dos tipos de células
ciliadas en el vestíbulo de los mamíferos (Fig. 1.2.). Las células ciliadas tipo I y las
tipo II. Las diferencias más importantes entre estas células consisten en su forma
y en la sinapsis aferente. Las células ciliadas tipo I tienen forma redondeada, con
un adelgazamiento en su parte superior. Las fibras aferentes hacen sinapsis con
ellas formando un cáliz que rodea completamente la porción basal de la célula.
Las fibras eferentes hacen contacto con la fibra aferente, no con la célula ciliada.
En cambio, las células tipo II tienen forma cilíndrica y tanto la fibra aferente como
la eferente establecen contacto directamente con la célula ciliada.
En la superficie apical existen uniones estrechas entre las células ciliadas y
células de soporte que separan endolinfa (un líquido rico en K+ y pobre en Na+ que
baña la parte apical del epitelio) y la perilinfa (un líquido extracelular rico en Na+ y
Ca2+ y que es pobre en K+ que baña la superficie basolateral del epitelio)
(Goldberg y Hudspeth, 2001).
Figura 1.2. Células ciliadas tipo I y II. Las
neuronas aferentes forman terminaciones en
cáliz sobre las células ciliadas tipo I y
terminaciones en botón terminaciones sobre las
células ciliadas tipo II.
Chen y Eatock, 2000).
Las células sensoriales del utrículo y del sáculo están localizadas en una
placa elipsoide denominada mácula. Los cilios de estas células están embebidos
13
en una matriz gelatinosa que contiene cristales de carbonato de calcio
denominados otoconias. De esta forma se acopla el desplazamiento del otolito a la
flexión de los cilios. Cuando la cabeza se acelera linealmente el otolito se
desplaza sobre la mácula del utrículo y sáculo provocando la inclinación de los
cilios, y una respuesta eléctrica en las células ciliadas (Goldberg y Hudspeth,
2001).
Los canales semicirculares están orientados en tres planos perpendiculares.
Cerca del utrículo existe un ensanchamiento en los canales denominado ámpula.
En el ámpula se encuentra un área donde las células ciliadas están localizadas,
denominada cresta ampular. Las células ciliadas están cubiertas por la cúpula, la
cual es una masa gelatinosa en la cual están embebidos los cilios de las células
sensoriales. La endolinfa se desplaza cuando hay una aceleración angular,
desplazando la cúpula. Debido a la flexibilidad de la cúpula esta se arquea y
mueve los cilios que están insertados en ella, estimulado así a las células ciliadas
(Goldberg y Hudspeth, 2001).
I. 2. Mecanotransducción
La célula ciliada transforma los movimientos mecánicos en señales eléctricas
mediante un proceso llamado mecanotransducción (Fig. 1.3.). Pickles y cols., en
1984, encontraron las uniones de punta (tip links) entre los cilios.
B
membrana
actina
eslabón
canal
unión de punta
Figura 1.3. A, Microscopía electrónica de barrido del sáculo de la rana toro. En el sáculo, los cilios
de las células sensoriales se distinguen sobre la mácula. B, esquema de la deflexión de los cilios
y consecuente activación de las uniones de punta
("tip links") de los canales
mecanotransductores (Holt y Corey, 2000).
14
Las uniones de punta son filamentos finos que unen el ápice de un cilio con la
pared lateral del que le sigue en magnitud. Se ha encontrado que en el extremo de
dichas uniones hay canales mecanosensibles considerados como catiónicos
inespecífico, pero debido a que el K+ se encuentra en mayor concentración en la
endolinfa se ha considerado que la corriente entrante que despolariza la
membrana citoplasmática es acarreada mayormente por K+. Al desplazarse los
cilios, las uniones de punta se tensan provocando un aumento de la probabilidad
de apertura de los canales mecanotransductores que están acoplados a ellas. El
movimiento de los cilios en dirección al cinocilio provoca un aumento en la tensión
de las uniones de punta, mientras que un movimiento en la dirección opuesta da
lugar a una disminución de la tensión, provocando una disminución en la
probabilidad de apertura de los canales mecanotransductores (Goldberg y
Hudspeth, 2001).
I. 3. Potencial receptor de la célula ciliada
La activación de los canales mecanotransductores provoca un cambio de potencial
eléctrico en la célula ciliada. El movimiento de los cilios en dirección del cinocilio
provoca una despolarización en estas células, mientras que un movimiento en la
dirección opuesta da lugar a una hiperpolarización. La despolarización de la
membrana celular de la célula ciliada provoca la activación de los canales de Ca2+
dependientes de voltaje ubicados en la porción basolateral de la célula y los
cuales están acoplados a la liberación del neurotransmisor. Contrariamente,
cuando los cilios se desplazan hacia el lado opuesto del cinocilio, disminuye la
probabilidad de apertura de los canales mecanotransductores reduciendo la
liberación del neurotransmisor y en consecuencia también disminuye la actividad
de la neurona aferente vestibular (Goldberg y Hudspeth, 2001).
I. 4. Neurotransmisión aferente
Las neuronas aferentes vestibulares, se encuentran agrupadas en el ganglio de
Scarpa, hacen sinapsis periférica con las células ciliadas y, a nivel central, con las
15
neuronas de los núcleos vestibulares en el tallo cerebral y con neuronas del
cerebelo.
Figura 1.4. Dibujo esquemático de una
neurona aferente vestibular y sus
relaciones sinápticas. A nivel periférico
hace sinapsis con la célula ciliada. A
nivel central con neuronas de los
núcleos vestibulares del tallo cerebral y
con neuronas del cerebelo.
El neurotransmisor entre la célula ciliada y la neurona aferente vestibular es un
aminoácido excitador del tipo del glutamato que activa los receptores ionotrópicos
del tipo AMPA y NMDA. En el vestíbulo del axolotl se han descrito respuestas a
kainato, quiscuálico y NMDA. Se ha demostrado que en condiciones de bajo Ca2+
y alto Mg2+ en el baño de la preparación, los agonistas glutamatérgicos
incrementan la frecuencia de disparo de las fibras aferentes vestibulares y los
antagonistas en solución normal inhiben la actividad en reposo y la respuesta a
estimulación mecánica. La potencia mostrada por los agonistas y antagonistas,
sugirió que el transmisor liberado por la célula ciliada en el sistema vestibular del
axolotl interactúa con receptores del tipo no-NMDA postsinápticamente (Soto y
Vega, 1988a).
Mediante técnicas inmunocitoquímicas se ha detectado la presencia de
glutamato y aspartato en las células ciliadas vestibulares (Harper y cols., 1995).
En el sistema vestibular se ha reportado que las neuronas aferentes
vestibulares también expresan receptores a péptidos opiodes del tipo µ (Vega
2001), receptores histaminérgicos del tipo H3 (Chávez y cols., 2000), receptores a
cannabinoides (Carrillo, 2005), receptores sensibles a cambios de pH (Mercado y
cols., 2006), y receptores a sustancia P y al péptido relacionado con el gen de la
calcitonina (Sewell, 1996).
16
I. 5. Neurotransmisión eferente
La actividad vestibular es modulada por el sistema eferente. Los cuerpos celulares
que proceden de las fibras eferentes se encuentran a nivel del tronco cerebral,
bajo el suelo del IV ventrículo. Las eferentes vestibulares pueden ser excitadoras,
inhibidoras o mixtas.
El principal transmisor en las sinapsis eferentes es la acetilcolina, esto ha
sido
demostrado
por
estudios
inmunocitoquímicos,
farmacológicos
y
electrofisiológicos. La acetilcolina actúa sobre dos clases de receptores:
nicotínicos y muscarínicos. La mezcla de excitación e inhibición que producen las
eferentes sobre la actividad aferente podría depender de diversos subtipos de
receptores colinérgicos. Estudios histológicos y moleculares han demostrado la
expresión de receptores nicotínicos y muscarínicos en órganos vestibulares en el
humano y la rata. Se han identificado los cinco subtipos de receptores
muscarínicos a ACh (M1-M5) así como los receptores nicotínicos especialmente
del tipo α9/α10 (Wackym y cols., 1995).
Además de ACh, son coliberados por las neuronas eferentes otros péptidos como
el péptido relacionado con el gen de la calcitonina, las encefalinas, la sustancia P
y el neuropéptido Y.
I. 6. Conductancias iónicas de las aferentes vestibulares
En neuronas aferentes vestibulares aisladas del axolotl (Ambystoma tigrinum) se
determinaron cuatro tipos de corrientes de potasio (transitoria de salida IKA,
rectificador retardado IK,RD, dependiente de Ca2+ IK(Ca) y una corriente rectificadora
de entrada de tipo IK1. También se encontró una corriente de Na+ (Cebada, 1997).
En neuronas aisladas de ganglios vestibulares de ratones se distinguieron
dos tipos de corrientes de Ca2+ activadas por voltaje, de alto y bajo umbral. La
corriente de Ca2+ dependiente de voltaje de bajo umbral (LVA) sólo se expresó en
un grupo pequeño de neuronas. Con base en sus propiedades farmacológicas las
corrientes de Ca2+ dependientes de voltaje de alto umbral (HVA) se caracterizaron
como corrientes tipo L, N, Q y P. Estos resultados sugieren que las neuronas
aferentes primarias expresan una variedad de corrientes de Ca2+ con distintas
17
propiedades farmacológicas. Se ha propuesto que esta diversidad en la expresión
de canales de Ca2+ podría estar relacionada con sus características sinápticas
funcionales, y con las propiedades intrínsecas de cada clase de aferentes
vestibulares (Desmadryl y cols, 1997).
El mismo grupo de investigadores reportó que existen modificaciones
significativas en la expresión de los canales de Ca2+ de las neuronas aferentes
vestibulares de ratones durante el desarrollo embrionario (E-14, 15, 17). Se
caracterizaron dos grupos de neuronas basándose en la amplitud de la corriente
LVA. En la primera población, la densidad de la corriente LVA disminuyó entre E17 y el nacimiento, y posteriormente desapareció. La segunda población de
neuronas tuvo una alta densidad de LVA en E-17 y aumentó la densidad durante
el desarrollo. La corriente tipo L permaneció constante entre E-15 y el nacimiento.
La densidad de las corrientes tipo N y Q incrementaron su magnitud en forma
continua en el mismo periodo que la corriente tipo L. Por otra parte la corriente tipo
P aumentó entre E-15 y E-17 y después disminuyó. Los cambios en la expresión
de la corriente LVA y el aumento transitorio de la corriente de HVA tipo P ocurre
durante un periodo caracterizado por un crecimiento neuronal masivo y la
formación de la sinapsis, por lo que sugiere un papel específico de las corrientes
de Ca2+ en la ontogenia de las neuronas aferentes vestibulares (Chambard y cols.,
1999).
En las aferentes vestibulares de ratón se ha reportado una corriente activada
por hiperpolarización (Ih). La Ih se activa a bajos umbrales por lo que no está
involucrada en el establecimiento del potencial de membrana en reposo, ni
tampoco en el proceso de la posthiperpolarización del potencial de acción, por lo
que su papel funcional no ha sido dilucidado (Chabbert y cols., 2001).
Se ha encontrado que la densidad de la corriente de K+ activada por Ca2+
(IKCa) está correlacionada con el diámetro del soma de neuronas aferentes
vestibulares en cultivo. In situ, estas neuronas tienen patrones de descarga
heterogéneos que podrían ser causados por las diferencias en sus propiedades
intrínsecas. Se encontraron dos poblaciones de neuronas aferentes vestibulares,
éstas se clasificaron de acuerdo a la expresión de la corriente de Ca2+ de bajo
18
umbral (LVA). Las neuronas pequeñas no expresaron la corriente LVA y las
neuronas medianas y grandes presentaron la corriente LVA. La IKCa en ambos
grupos fue acarreada a través de canales de alta (BK), intermedia (IK), baja
conductancia (SK) y un canal resistente a bloqueadores (IR). En las células que
presentaron la LVA se expresaron los canales BK y la expresión de IR fue mayor
en neuronas que no tuvieron la corriente LVA. Por otra parte, no hubo una
correlación entre el tamaño de la neurona y la expresión de los canales SK e IK.
En experimentos de fijación de corriente los canales BK participan en la
adaptación de la descarga y en la duración del potencial de acción. Sin embargo
son pocas las neuronas aferentes vestibulares que disparan en forma repetitiva
(Limón y cols., 2005).
En nuestro laboratorio, utilizando la técnica de fijación de voltaje e
inmunocitoquímica, se ha caracterizado en las neuronas aferentes vestibulares en
cultivo de rata una corriente activada por protones que es acarreada a través de
canales sensores a acidez (ASIC: de Acid Sensign Ionic Channels). La corriente
activada por protones se caracteriza por tener una rápida activación y completa
desensibilización, y es acarreada casi exclusivamente
por iones sodio. Esta
corriente disminuyó de manera reversible por la aplicación de amilorida, gadolinio,
plomo, ácido acetilsalicílico y al aumentar la concentración de Ca2+ extracelular y
aumentó cuando se aplicaron el neuropéptido FMRFamida y zinc. Cuando se
acidificó el medio extracelular se generaron potenciales de acción en las neuronas
vestibulares, por lo cual se propuso un papel funcional de los ASICS en la
excitabilidad de estas neuronas. La inmunoreactividad a las subunidades ASIC1a y
ASIC2a fue encontrada en neuronas del ganglio vestibular y fibras aferentes que
corren a través de la mácula del utrículo y de la cresta ampular de los canales
semicirculares lateral y anterior. Estos resultados indicaron que la corriente
activada por protones contribuye a las respuestas de las neuronas aferentes
vestibulares (Mercado y cols., 2006).
19
I. 9. Canales de potasio activados por sodio intracelular
Varias corrientes de K+ juegan un papel importante en el control de la excitabilidad
neuronal, éstas influyen en el potencial de membrana en reposo, así como
también otras controlan el patrón de disparo durante una despolarización. Los
canales de K+ han sido ampliamente estudiados; en algunos, su apertura depende
de voltaje, sin embargo, otros son activados por la acumulación intracelular de
iones, Ca2+ y Na+.
Los canales activados por sodio (KNa) intracelular fueron descritos por
primera vez en células cardiacas de cobayo (Kameyama y cols., 1984).
Posteriormente, estos canales KNa fueron hallados en diferentes tipos neuronales.
I. 10. Propiedades de los canales de potasio activados por sodio en miocitos
cardiacos de mamífero
Los canales de potasio activados por sodio (KNa) fueron descritos por primera vez
en miocitos ventriculares de cobayo, utilizando la técnica de “inside out”. Estos
canales se caracterizaron por poseer una gran conductancia (207 pS), tener
propiedades de rectificación entrante y su probabilidad de apertura no ser
dependiente de voltaje. Estos canales no son afectados por Ca2+ o ATP y
necesitan al menos 20 mM de Na+ para activarse. La probabilidad de encontrar los
canales en estado abierto está en función de la concentración de Na+, con una
activación media máxima (EC50) de 66 mM y un coeficiente de Hill cercano a 3
(Kameyama y cols., 1984).
Wang y cols. (1991) demostraron en registros de canal único que la
rectificación entrante de los canales KNa en células ventriculares de cobayo se
debe al Mg2+ y Na+ intracelular. El ión divalente de manera dependiente de voltaje
bloquea la corriente saliente de los canales KNa y el Na+ además, de activar la
conductancia de K+ también, puede paradójicamente bloquear la corriente saliente
a través de los canales KNa dependiendo de la concentración y del voltaje.
20
I. 11. Propiedades de los canales KNa en neuronas
Los canales KNa han sido observados en registros de canal único de distintos tipos
neuronales. En neuronas aisladas del mesencéfalo de pollo se reportó un canal de
K+ que fue activado cuando el Na+ sustituyó al Li+ intracelularmente en registros de
“inside out”; este canal se caracterizó por tener múltiples estados de conductancia
cuyo valor máximo fue de 50 pS cuando se utilizaron las siguientes
concentraciones [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 5 mM; 100 pS cuando se utilizó [ K ]ext
= 150 mM y [ K ]int = 75 mM, y su corriente se caracterizó por tener una ligera
rectificación entrante. Se demostró que estos canales KNa no son activados por 1
mM de Ca2+ (Dryer y cols., 1989, Dryer, 1991). Otra característica distintiva de
estos canales KNa en esta preparación es su falta de "run down" (disminución de
las corrientes debido a cambios celulares) después de separar el parche de la
célula. Estos canales KNa presentan una cinética compleja ya que cuando se abren
lo hacen en forma de ráfagas; cada una de éstas separadas por breves cierres del
canal o por la transición a subestados de conductancia. Además los canales KNa
de manera ocasional permanecen cerrados por varios segundos aun cuando se
encuentran en presencia de una concentración alta de Na+ (Dryer, 1993).
En neuronas del ganglio trigémino de codorniz, los registros de canal único
se realizaron a -50 mV, el cual es el potencial de membrana en reposo de estas
células. Aquí el canal KNa presentó una actividad en ráfagas con una rápida
transición entre el estado abierto y cerrado y grandes periodos sin actividad
separando las ráfagas. De la misma forma que las neuronas aisladas del
mesencéfalo de pollo las neuronas del ganglio trigémino presentaron subestados
de conductancia. El valor para el principal estado de conductancia de los canales
KNa fue de 174 pS [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 75 mM. La actividad de los canales
KNa permaneció cuando se utilizó una baja concentración de Na+ intracelular (12.5
mM) y cuando la concentración de Na+ aumentó la probabilidad de apertura del
canal incrementó. La EC50 fue de 30 mM. Debido a que el coeficiente de Hill fue
cercano a 3 se sugirió que posiblemente 2 o 3 iones Na+ se unen al canal antes de
abrirse. Otra característica distintiva de los canales KNa en esta preparación es que
el Li+ no puede sustituir al Na+ para activarlos (Haimann y cols., 1990).
21
Se ha registrado la actividad de los canales KNa en cultivos celulares
primarios preparados de cerebelo, hipocampo, bulbo olfatorio, corteza olfatoria,
protuberancia, septum, médula espinal y corteza visual de rata. Los canales KNa
encontrados en todas las regiones comparten una dependencia absoluta del Na+
intracelular, tienen conductancias de 140-170 pS en una concentración simétrica
de K+ 150 mM y presentan múltiples subestados de conductancia (Egan y cols.,
1992a). Posteriormente las propiedades y run-down de los canales KNa
encontrados en los cultivos de células mitrales del bulbo olfatorio de rata fueron
investigados utilizando la técnica de “patch clamp” en la modalidad de
“cell attached” e “inside out”. Se encontró que estos canales iónicos son altamente
selectivos al K+, requieren de 10-180 mM de Na+ intracelular para su activación, el
Li+ no puede sustituir al Na+ para activar los canales de KNa y a voltajes más
positivos que el potencial de equilibrio del K+, las corrientes del canal KNa
presentan una rectificación entrante debido a que el Na+ bloqueó la corriente de
potasio saliente.
En registros de cell attached en condiciones normales no se activaron los
canales KNa, esto sólo fue posible cuando el Na+ intracelular se aumento con
veratridina. Esta droga previene la inactivación de los canales de Na+
dependientes de voltaje permitiendo que el Na+ entre a la célula. La preincubación
de las células en TTX o la eliminación del sodio extracelular previnieron el efecto
de la veratridina, con lo que se confirmó que los canales en efecto eran KNa.
La apertura de los canales KNa en esta preparación se presentó en ráfagas,
durante las cuales existieron fluctuaciones entre los estados abierto, cerrado y
subestados. Los canales KNa en parches desprendidos de neuronas del bulbo
olfatorio pierden de manera irreversible su actividad ("run down"). El tiempo para
que se presente este fenómeno varía desde 1 minuto hasta 1 hora. Una posible
explicación a este fenómeno es que algún factor intracelular necesario para que el
canal permanezca abierto se pierde cuando se retira el parche de la célula. Esta
hipótesis es respaldada por el hecho de que el "run down" de la actividad del canal
KNa en células tratadas con veratridina no ocurre. La pérdida del factor que se
difunde aparentemente cambia la sensibilidad del canal para la concentración de
22
Na+ intracelular ya que la actividad del canal momentáneamente se recupera del
"run down" cuando se aumenta la concentración de Na+ intracelular, mostrando
que el canal aún puede abrirse pero sólo en presencia de concentraciones altas
de Na+ intracelular. La naturaleza de este factor es desconocido. El run down de
los canales KNa en parches desprendidos de la membrana celular no es
dependiente de la actividad del canal y la apertura del canal no fue afectada por la
aplicación de cAMP, cGMP, ATP, proteína cinasa dependiente de cAMP a la
superficie interna de la membrana del parche (Egan y cols., 1992). El Li+ no puede
sustituir al Na+ para activar los canales KNa. La conductancia unitaria de 172 pS en
soluciones simétricas de K+ 150 mM. En estas condiciones el canal presentó un
comportamiento lineal en la relación corriente del canal completamente abierto
contra voltaje en el rango de potencial de -100 a 0 mV. A voltajes más positivos
que el potencial de equilibrio del K+, las corrientes del canal KNa presentan una
rectificación entrante debido a que el Na+ bloqueó la corriente de potasio saliente.
En otro tipo celular donde se describieron a los canales KNa fue en el soma
de motoneuronas de rata. Estos canales presentaron una conductancia de 44.8 pS
en [ K ]ext = 5.6 mM y [ K ]int = 106 mM y 139.2 pS en [ K ]ext = 155 mM y [ K ]int = 85
mM. En estas células los canales KNa fueron independientes del voltaje y
necesitaron una concentración alta de Na+ para activarse (EC50 = 39.9 mM). De
forma similar a las neuronas del bulbo olfatorio, el Li+ no puede sustituir al Na+
para activar a los canales KNa, que en su mayoría fueron encontrados en las
regiones donde
probablemente se acumula más Na+ citoplasmático. En esta
preparación los canales KNa mostraron actividad en algunos parches por más de
50 minutos. Los periodos de alta actividad fueron generalmente seguidos por
periodos de 10-30 segundos de baja actividad pero no se presentó un efecto
convincente de "run down" (Safronov y Vogel, 1996).
Los canales KNa en las neuronas de la raíz dorsal de rata presentan una
conductancia de 142 pS con [ K ]ext = 142 mM y [ K ]int = 85 mM. En este caso no
se observó un pronunciado "run down" en los parches desprendidos y su actividad
no se redujo significativamente durante varios minutos (Bischoff y cols., 1998).
Algunas de las propiedades de los canales KNa se resumen en la tabla I.
23
Tabla I. Propiedades de los canales de KNa en células excitables de diferentes
vertebrados.
Tipo celular
Conductancia
Dependencia
unitaria
voltaje
Miocitos ventriculares de 210
cobayo
con Ninguno
pS
Neuronas
del 105
mesencéfalo de pollo
pS
30-75 mM
d
Ninguno
b
Ninguno
y
cols.,
pS Ligeramente
f
139.2 pS
g
Dryer,
Haimann y cols.,
1990.
despolarización
40-80 mM
d
varios incrementa la Po con
44.8 pS
Neuronas de los ganglios 142 pS
30 Mm
incrementa la Po con pendiente de Hill = 2.7
b
c
de No reportado
de la raíz dorsal
Dryer
1993.
varios
con
y
cols., 1984; Wang
h
embriones de Xenopus
Motoneuronas de rata
Kameyama
y cols., 1991.
con Ligeramente
subestados
espinales
Ref.
1989;
bulbo 170-200
olfatorio de rata
Ninguno
a
con Ninguno
pS
subestados
Neurona
66 mM
varios
Neuronas sensoriales de 170
del
Run-
pendiente de Hill = 2.8
subestados
ganglios sensoriales
+
down
varios
subestados
Neuronas
de EC50 para el Na
Marcado
Egan
Run-down
1992.
y
cols.,
Ninguno
Dale, 1993.
Safronov y Vogel,
despolarización
Marcado incrementa la 7.3 mM
Po con despolarización
pendiente de Hill = 4.6
Ninguno
39.9 mM
Ninguno
Ninguno
38.7 Mm
Ninguno
f’
1996.
pendiente de Hill = 3.9
Bischoff y cols.,
1998.
Modificado de Dryer, 1994.
a
Registros con [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 49 mM.
b
Registros con [ K ]ext = 150 mM y [ K ]int = 75 mM.
c
Registros con 150 Mm de KCl simétrico.
d
Saturación a altas concentraciones de Na+, raramente observadas.
e
Rápido run down también vistos en neuronas del bulbo olfatorio de pollo.
f
Registros con [ K ]ext = 5.6 mM y [ K ]int = 106 mM.
f’,g
Registros con [ K ]ext = 155 mM y [ K ]int = 85 mM.
h
P0 = Probabilidad de apertura.
I. 12. Evidencia de una corriente macroscópica de K+ dependiente del influjo
de Na+ en neuronas
Ha sido difícil demostrar, que el influjo de Na+ a través de los canales sensibles al
voltaje, causa la activación de los canales KNa bajo condiciones normales. Las
primeras evidencias provienen de estudios realizados en motoneuronas gigantes
de cangrejo de río (Hartung, 1985), neuronas de los ganglios parasimpático y
trigémino de codorniz (Bader y cols., 1985), y neuronas del cerebro medio de pollo
(Dryer y cols., 1989). En estas últimas células un pulso de voltaje despolarizante
provocó corrientes entrantes seguidas por corrientes salientes transitorias y
24
sostenidas. En cada caso, se eliminaron las corrientes salientes transitorias al
bloquear las corrientes de Na+ por la aplicación de TTX, o por la reducción de Na+
extracelular. Sin embargo, hay evidencia de que estos resultados son artefactos
causados por una falla en la fijación de voltaje (Dryer y cols., 1989).
La presencia de una corriente de KNa en las neuronas aisladas del ganglio
ciliar de pollo (Bader y cols., 1985) y cultivos de neuronas del tallo cerebral de
pollo (Dryer y cols., 1989) fue reexaminada por Dryer usando varias técnicas de
registro. Encontró que en ambas preparaciones la presencia de una corriente
saliente transitoria sensible a TTX es un artefacto causado por una inadecuada
fijación de voltaje y fue probablemente provocado por una compensación
incompleta de la resistencia en serie. La presencia de este artefacto fue detectada
por el uso de un segundo electrodo, un electrodo pasivo de registro de voltaje, por
la determinación de la relación de la corriente de Na+ al pico y el potencial
comando, o por la examinación de los efectos de TTX sobre la cinética de la
corriente de Na+. En estas preparaciones no hay evidencia de una corriente de K+
sensible a TTX. Experimentos realizados utilizando la técnica de canal único
demostraron que las neuronas del ganglio ciliar no tienen canales de KNa, aunque
estos sí fueron detectados en cultivos de neuronas del tallo cerebral registrados
bajo las mismas condiciones (Dryer, 1991).
La mejor evidencia de que los canales KNa contribuyen a las corrientes
macroscópicas activadas por voltaje fue presentada en experimentos en agudo
hechos con neuronas espinales aisladas de embriones de Xenopus (Dale, 1993).
En estas células se reemplazó el Na+ extracelular por grandes cationes orgánicos,
tales como N-metil-D-glucamina, colina o lisina. Éstos causaron una reducción en
la corriente de K+ producida por pulsos de voltaje despolarizantes. En neuronas
espinales de embriones de Xenopus también se expresa un canal de fuga
permeable a Na+. Algunos datos cuantitativos sugieren que esta fuga puede
proporcionar suficiente concentración de Na+ para permitir la activación de los
canales KNa.
Además los canales KNa fueron estudiados en las neuronas de la raíz dorsal
de rata utilizando la técnica de célula completa. La corriente del canal KNa fue
25
identificada como una corriente de fuga adicional selectiva a K+, la cual apareció
al estimular con un pulso de voltaje. La amplitud de esta corriente se incrementó al
aumentar las concentraciones de Na+ en la pipeta. La EC50 fue de 39 mM y el
coeficiente de Hill de 3.5. La corriente de KNa no fue activada por Li+ intracelular;
ésta fue bloqueada por Cs+ pero no por tetraetilamonio. En estas células también
se realizaron experimentos utilizando dos electrodos; uno de estos electrodos se
utilizó para registrar corrientes macroscópicas en la configuración de célula
completa, con el otro electrodo se registraron corrientes unitarias con la técnica de
célula adherida. Se observó una correlación directa entre el aumento de la
amplitud de la corriente total del canal KNa y la activación de canales únicos de KNa
cuando se incrementaba la concentración intracelular de Na+ (Bischoff y cols.,
1998).
Se han descrito corrientes KNa en neuronas corticales del gato (Foehring y
cols., 1989). En estas células, los trenes de espigas son seguidas por una
posthiperpolarización lenta (AHP, del inglés afterhiperpolarization) de hasta 10 s.
La excitabilidad de la célula se reduce marcadamente durante la AHP (Foehring y
cols., 1989). El componente sostenido de estas AHPs persiste cuando el influjo de
Ca++ se bloquea, pero se elimina con TTX. Sin embargo, estas células expresan
una corriente de Na+ que no inactiva y es bloqueada por TTX (Kubota y Saito,
1991); por lo tanto, se ha propuesto que las AHPs lentas se deben a la activación
de la corriente de KNa. Además, se realizaron estudios de fijación de voltaje que
indicaron que la AHP lenta sensible a TTX en neuronas corticales está asociada a
la activación de una corriente de K+ y que la AHP lenta persiste después de la
inhibición de la ATPasa Na+-K+ (Schwindt y cols., 1989; Foehring y cols., 1989).
Para conocer la función de la corriente de K+ activada por Na+ se realizaron
registros de fijación de corriente en el soma de motoneuronas de rata en
rebanadas de médula espinal. Se compararon potenciales de acción únicos y
trenes de potenciales de acción registrados en soluciones extracelulares con Na+ y
con Li+. La forma del potencial de acción no cambió después de sustituir
extracelularmente Na+ por Li+. En contraste, trenes de potenciales de acción
registrados en una solución sin Ca2+ fueron seguidos por una posthiperpolarización
26
lenta (1-2 s) que desapareció cuando el Na+ extracelular fue reemplazado por Li+.
La acumulación de Na+ en el soma de motoneuronas causa una AHP (Safronov y
Vogel, 1996). Este tipo de AHP activada por Na+ puede ser debida a acumulación
local de Na+ intracelular en la región del cono axónico que podría activar los
canales KNa. De manera alterna, la acumulación intracelular de Na+ podría activar
la bomba electrogénica Na+-K+ dando como resultado la hiperpolarización de la
membrana. Para distinguir entre estas dos posibilidades se aplicó ouabaína, un
bloqueador especifico de la bomba Na+-K+. Las posthiperpolarizaciones activadas
por Na+ continuaron después de aplicar ouabaína; la amplitud se incrementó con
una solución Ringer sin K+ y desaparecieron cuando el potencial de membrana fue
igual al potencial de equilibrio del K+. Esto indicó que las AHP fueron el resultado
de la activación de una conductancia de K+ dependiente de Na+. En este estudio
los canales KNa fueron activados por concentraciones relativamente altas de Na+
que no se producen en el soma de las motoneuronas durante un único potencial
de acción. Los cálculos teóricos han mostrado que trenes de potenciales de acción
largos y de alta frecuencia (250 Hz) producen un aumento intracelular de Na+ en
compartimentos restringidos, suficiente para activar los canales KNa del cono
axónico (Koh y cols., 1994). La AHP activada por Na+ fue observada en el soma
de las motoneuronas después de trenes de potenciales de acción con una
frecuencia más baja de 15-30 Hz. Varios factores podrían facilitar la acumulación
local de Na+ y la activación de los canales KNa en las motoneuronas. Estos canales
KNa se encuentran principalmente en regiones de membrana adyacentes a los
axones. No se excluye la posibilidad de que los canales KNa estuvieran presentes
en regiones de membrana adyacentes a las dendritas de las motoneuronas,
debido a que se ha demostrado que las dendritas de neuronas piramidales CA1
poseen alta densidad de canales de Na+ dependientes de voltaje (Magee y
Johnston, 1995) los cuales son activados por potenciales de acción generados en
el soma celular (Stuart y Sakmann, 1994). Por lo tanto las dendritas finas de las
motoneuronas podrían ser otro sitio de acumulación de Na+ y activación de los
canales KNa. Se ha llegado así a la conclusión de que los canales KNa juegan un
papel importante en la excitabilidad de las motoneuronas. Siendo activados
27
durante trenes de potenciales de acción, de manera que las AHP pueden
estabilizar la membrana y proteger a esta de una despolarización siendo capaces
de reducir la excitabilidad de la membrana y contribuir a la regulación del disparo
de potenciales de acción en las motoneuronas (Safronov y Vogel, 1996).
Para estimar la contribución de los canales KNa en el potencial de acción de
neuronas intactas de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) de rata, se realizaron
registros de fijación de corriente. Lo que se observó fue que al reemplazar
extracelularmente el Na+ por Li+ no cambio la forma del potencial de acción. En
contraste con las motoneuronas de rata, las neuronas de los GRD generan
potenciales de acción sólo a muy bajas frecuencias 0.5-2 Hz (neuronas tipo C;
Harper y Lawson, 1985b). En registros de fijación de corriente se encontró que el
aumento de Na+ intracelular produjo una depolarización que se saturó hasta
–68 mV el cual correspondió al potencial de equilibrio de potasio para las
condiciones experimentales utilizadas (5.6 mM K+O\85 mM K+i). En cambio, en
neuronas con un potencial de membrana en reposo relativamente bajo, el Na+
intracelular indujo una hiperpolarización de –68 mV. Estos experimentos indicaron
que la perfusión de una neurona con Na+ intracelular puede activar una
conductancia de K+ y estabilizar el potencial en reposo en las neuronas de los
GRD, hacia el potencial de equilibrio del potasio. Por lo que se sugiere que los
canales KNa en neuronas de los GRD participan estabilizando el potencial de
membrana bajo condiciones fisiológicas (Bischoff y cols.,1998).
Las neuronas piramidales de la neocorteza pueden generar diversos
patrones de disparo, dependiendo de su morfología, propiedades pasivas y
corrientes iónicas activas. Las neuronas de la neocorteza no son fisiológicamente
homogéneas. Se han reconocido tres tipos básicos de neuronas sobre la base de
su actividad; neuronas RS (del inglés regular-spiking), neuronas FS (del inglés
fast-spiking) y neuronas IB (del inglés intrinsically- bursting). Las neuronas IB se
distinguen porque sus espigas parecen estereotipadas, y agrupadas (ráfagas)
(Connors y Gutnick, 1990). Las ráfagas tienen 2 ó 6 potenciales de acción que
ocurren aproximadamente a 200 Hz (Lisman, 1997). Las espigas individuales de
las células IB son seguidas a menudo por una importante despolarización
28
postpotencial (ADP, del inglés, despolarizing afterpotential), la cual puede sumarse
para formar una onda lenta despolarizante de baja amplitud durante una ráfaga.
Dentro de cada ráfaga, cada espiga sucesiva declina en amplitud porque la
despolarización sostenida inactiva la conductancia de sodio.
Se ha reportado que en las neuronas piramidales IB de la capa V, la
substitución extracelular de Na+ por Li+ genera una corriente entrante a través de
los canales de Na+ dependientes de voltaje y no altera los potenciales de acción,
sin embargo inhibe la posthiperpolarización (AHP) que sigue no solo a trenes de
espigas, sino también a eventos cortos tales como ráfagas individuales. Además,
el mismo procedimiento induce un incremento en la frecuencia de repetición de
ráfagas durante la aplicación de un estímulo despolarizante prolongado. Estos
hallazgos sugieren que una corriente de K+ activada por Na+, pero no por Li+
participa en la generación de la AHP postexcitatoria regulando la frecuencia de
aparición de ráfagas en las neuronas IB. En experimentos de fijación de voltaje en
neuronas IB aisladas se demostró que un pequeño componente de las corrientes
de K+ evocadas por un pulso despolarizante depende de la activación de la
corriente de Na+ pero no de Li+
generada a través de los canales de Na+
dependientes de voltaje. Estos resultados apoyan que la activación de la corriente
de KNa por el influjo de Na+ inducido por un potencial de acción contribuye a la
posthiperpolarización pos ráfaga y a la actividad rítmica de las ráfagas en las
neuronas IB (Franceschetti y cols., 2003).
I. 13. Propiedades de los canales Slack y Slick
Todos los datos descritos sobre los canales KNa denotan una heterogeneidad de
sus propiedades y éstas pueden ser explicadas por las diferencias en las
condiciones de registro, localización subcelular, unión a subunidades auxiliares o
podría deberse a las diferencias intrínsecas entre las isoformas del canal.
Se ha demostrado que los canales de K+ rectificadores salientes codificados
por el gen Slack son activados por Na+ y la distribución de Slack en el cerebro
coincide con varios tipos neuronales donde se ha reportado la corriente KNa (Joiner
y cols., 1998; Yuan y cols., 2003). Además, se ha encontrado un segundo canal
29
KNa que es codificado por el gen Slick, el cual es selectivamente expresado en el
sistema nervioso y en el corazón (Fig. 1.5.) (Bhattacharjee y cols., 2003).
En 1998, Joiner y cols., aislaron el gen que codifica una subunidad de un
canal de K+. A esta subunidad se le llamó Slack (“sequence like a Ca2+-activated
K+ channel; también conocida como Slo2.2). Esta subunidad está compuesta por
seis
segmentos
transmembrana
(S1-S6)
y
una
gran
región
C-terminal
citoplasmática. Desde el N-terminal hasta la región P (poro) existe una mala
alineación aminoacidica entre la subunidad Slack y la subunidad de los canales de
K+ Slo dependiente de calcio-voltaje y Slo 3 sensible a pH. Además la secuencia
de aminoácidos de los segmentos transmembrana de las subunidades de los
canales de K+ antes mencionados no coincide. La región P y partes limitadas de la
región C- terminal de los canales Slack, Slo y Slo 3 son semejantes en su
estructura primaria.
La subunidad del canal de potasio conocida como Slack es muy grande, la
característica que tiene en común con la gran familia de canales de potasio
Shaker es que tiene seis dominios transmembrana. El canal Slack es sensible al
voltaje a pesar de carecer del sensor de voltaje S4, característico de los canales
Shaker; sin embargo su secuencia tiene algunas regiones homólogas al Slo, el
canal activado por Ca2+ de gran conductancia (canal BK). Ambas tienen una gran
región C-terminal que contiene dos dominios RCK (regulador de la conductancia
de K+) que son probablemente sitios de unión a Na+ y controlan la apertura del
canal. El dominio S0 transmembrana que interactúa con la subunidad beta está
presente en la subunidad Slo pero no en la Slack (Joiner y cols., 1998, Jiang y
cols., 2001). En los canales Slo2, usando mutagénesis directa se ha identificado
una región en la cola análoga al sitio de unión a Ca2+, la cual sensa Cl-. Por esto
que se ha sugerido que el canal Slo2 es activado por Ca2+ y Cl- en Caenorhabditis
elegans (Yuan y cols., 2000). Por otra parte el canal Slo2.2 de mamífero (rSlo2) no
requiere Cl- para activar el canal expresado en oocitos de Xenopus; este anión
puede facilitar la activación del canal cuando el Na+ está presente, por lo que se
ha demostrado que las acciones de Na+ y Cl- son sinérgicas (Yuan y cols., 2003).
30
El canal Slick (“sequence like an intermediate conductance K+ channel; también
conocido como Slo2.1) es activado también por Na+ y Cl-. Los canales Slick y
Slack presentan un 74% de homología en su secuencia aminoacídica. El
segmento N-terminal del Slick es la mitad que el del Slack. Ambos contienen un
dominio PDZ altamente conservado; sus segmentos transmembranales y los
dominios RCK son casi idénticos. El canal Slick posee un sitio consenso de unión
para ATP, que al estar ocupado se inhibe la actividad del canal (Bhattacharjee y
cols., 2003).
A nivel de canal único, los canales KNa nativos son heterogéneos al igual que
los expresados en sistemas heterólogos. En los primeros, el rango de valores de
EC50 para el Na+ es de 7 a 80 mM; su conductancia unitaria varía de 100 a 200
pS y presentan múltiples subestados de conductancia (Dryer, 1994). Expresados
en oocitos de Xenopus en condiciones de K+ simétrico, los canales Slack tienen
una EC50 de 41 mM para la activación por Na+, la conductancia unitaria es de
~180 pS y muestran múltiples subestados de conductancia). Los canales Slick
tienen una conductancia unitaria de ~140 pS y presenta varios subestados de
conductancia (Yuan y cols., 2003; Bhattacharjee y cols., 2003). Los canales Slack
como los canales nativos de KNa no pueden ser activados por la sustitución de Na+
por Li+.
El Slick difiere del Slack en su cinética de apertura rápida. Los canales Slack
necesitan del Na+ para la apertura del canal mientras que los canales Slick tienen
un nivel basal de actividad en la ausencia de Na+ (Bhattacharjee y cols., 2003).
Esta heterogeneidad de las subunidades de canales de potasio activados por
sodio, puede explicar la variedad observada en las corrientes macroscópicas y en
las corrientes nativas KNa de canal único.
Es importante mencionar que se ha reportado que la subunidad del canal de
K+ Slack puede interactuar directamente con las subunidades Slo para formar
heteromultímeros Slack/Slo. Las propiedades farmacológicas y las conductancias
unitarias de los canales formados por la coexpresión de Slack y Slo son diferentes
de las propiedades que caracterizan a cada canal de manera individual. Los
canales Slack/Slo tienen una conductancia entre 60-180 pS y son activados por
31
Ca2+, por lo que algunos canales de conductancia intermedia presentes en el
sistema nervioso central podrían ser el resultado de la interacción entre las
subunidades de los canales Slack y Slo (Joiner y cols., 1998).
Figura 1.5. Subunidades de Slack y Slick. Hay dos isoformas de Slack (Slack A y Slack B). Slack A
tiene un N-terminal que es casi idéntico que el del Slick (representado por el ovalo gris). Ambos
Slack A y Slack B tienen una gran región C-terminal que contiene dos dominios que regulan la
conductancia de K+ (RCK), un dominio de unión a ATP y un dominio PDZ. (Bhattacharjee y cols.,
2003).
I. 14. Localización de los canales Slack y Slick en el cerebro
Experimentos de hibridación in situ e inmunocitoquímica han demostrado que el
canal Slack está ampliamente distribuido en el sistema nervioso central
(Bhattacharjee y cols., 2002). Un anticuerpo contra el N-terminal de un canal Slack
clonado mostró niveles altos de la proteína en el bulbo olfatorio, cerebro medio y
tallo cerebral. Sin embargo se encontró una limitada inmunoreactividad en ciertas
regiones de la neocorteza, cerebelo e hipocampo (tabla II).
Estos hallazgos contrastan con lo reportado en experimentos de hibridación
in situ. La clonación de una isoforma alternativa del Slack resolvió esta
discrepancia, ya que se encontró una alta inmunoreactividad a Slack en estas
regiones usando un anticuerpo panSlack (Bhattacharjee y cols., 2004).
El canal Slick está ampliamente distribuido en el cerebro, específicamente en
el cerebro medio, tallo cerebral, hipocampo y en la neocorteza, con una abundante
expresión en la corteza somatosensorial y la corteza visual. Estos hallazgos son
consistentes con los reportes de los canales KNa encontrados en áreas corticales
específicas (Franceschetti y cols., 2003). Además, se detecta una alta
32
inmunoreactividad en regiones sensoriales del cerebro, especialmente en
neuronas auditivas del tallo cerebral (Bhattacharjee y cols., 2005).
33
Tabla II. Distribución de canales Slack y Slick en el cerebro de rataab.
Localización
en el cerebro
Hibridación in situ
Slack
Cangiano y cols., 2002
Slick
Slack
Bhattacharjee y cols.,
Joiner y cols.,1998
Bulbo olfatorio
Inmunocitoquimica
Cangiano y cols., 2002
2002
Slick
Bhattacharjee y cols.,
Joiner y cols.,1998
2002
ND
++++
++
++++
++
++
++
++
Corteza cerebral
Corteza frontal
Corteza piriforme
++
++
-
++
Cuerpo calloso
-
-
-
-
++
+++
++
Núcleo de la banda ND
diagonal
Núcleo medio Septal
ND
++
++
++
Amígdala
++++
++
+++
++
CA1
++
++++
-
++++
CA2
++
++++
-
+++
CA3
++++
++++
+
+++
Hipocampo
Giro dentado
+
++++
+
+++
Habenula
++
++++
+
++
Tálamo
++
++
+++
++
Hipotálamo
++
++
++
+++
Sustancia nigra
+++
++
+++
+++
Núcleo rojo
+++
+++
++++
+++
Núcleo oculomotor
+++
+++
++++
+++
Núcleo trapezoide
++++
Núcleo
ventral +++
+++
++++
+++
++
+/-
+++
coclear
Trigémino motor
+++
++
+++
+++
Núcleo facial
ND
+++
+++
+++
Núcleo vestibular
ND
+++
++++
++
++
+/-
+
+++
++++
+++
Celular de Purkinje +++
del cerebelo
Núcleo
cerebelar +++
profundo
a
Un mayor número de símbolos + indica una gran expresión, el signo – indica que
no hay expresión y +/- indica que la expresión fue reportada por [Cangiano y cols.,
2002] pero no por [Joiner y cols.,1998].
b
La abreviación ND indica que no fue determinado.
34
I. 15. Farmacología de los canales de potasio activados por sodio
Hasta ahora no se ha encontrado una molécula capaz de bloquear de manera
específica los canales KNa. Desarrollar un antagonista específico para estos
canales ayudaría a entender su papel funcional. Sin embargo, existen ciertas
drogas que bloquean este canal de manera inespecífica.
En células cardiacas el R-56865 (N-{1- [4 (4-fluorofenoxi) butil]-4-piperidinil}N-metil-benzotiazolamina) inhibe la corriente del canal KNa. (Luk y Carmeliet,
1990). Sin embargo, este bloqueador también inhibe la corriente de Na+ en células
cardiacas (Wilhelm y cols., 1991), la corriente de potasio rectificador retardado (IK)
y la corriente transitoria (Ito) (Leyssens y Carmeliet, 1991). Se ha estudiado el
efecto de dos drogas antiarrítmicas clase III,
MS-551 (1,3-dimetil-6-{2-N-(2-
hidroxietil)-3-(4-nitrofenil)propilamino[etilamino}-2,4-(1H,3H)-clorhidrato
pirimidinediona]
y
E-4031
(N-[4-[[1-[2-(6-metil-2-piridinil)etil}-4-piperidinil}
carbonilfenil} diclorhidrato dihidrato metanesulfonamida) sobre los canales KNa en
células ventriculares de cobayo utilizando la técnica de canal único en la
modalidad de parche con el interior hacia afuera (inside out) (Mori y cols., 1996).
Estas drogas en concentraciones altas (300 mM) inhibieron la corriente de KNa al
disminuir el tiempo de apertura del canal. Sin embargo, estas drogas también
bloquean canales de K+ dependientes de voltaje (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990;
Nakaya y cols., 1991).
En esta misma preparación se estudió el efecto de la amiodarona (la cual
ejerce acciones antiarrítmicas clase I, II, III y IV) sobre los canales KNa. Se
encontró que esta droga en concentraciones relativamente bajas (0.1-10 µM)
inhibió la corriente de KNa disminuyendo la probabilidad de apertura. La IC50 de
amiodarona para la corriente de KNa fue de 1.0 µM (Mori y cols., 1996). Sin
embargo, la amiodarona es una droga inespecífica ya que también afecta varios
canales iónicos.
En miocitos ventriculares de cobayo se analizó el efecto del bepridil sobre la
actividad del canal KNa utilizando la técnica de canal único "inside out". El bepridil
(0.1-30 µM) inhibió los canales de KNa de manera dependiente de la
concentración. La IC50 fue de 2.2 µM. Además, en preparaciones de ventrículo
35
derecho se estudió el efecto de esta droga sobre el acortamiento de la duración
del potencial de acción inducido por inhibición metabólica (IM). Esta IM se produjo
eliminando la glucosa de la solución de perfusión y por la aplicación 0.1 µM de
carbonil-cianida-p-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona
(FCCP),
un
desacoplador
mitocondrial de la fosforilación oxidativa. El bepridil evitó el acortamiento de la
duración del potencial de acción durante la IM.
El bepridil es un agente antiarrítmico con propiedades antianginales; bloquea
un canal de sodio (Yatani y cols., 1986; Sato y cols., 1996), un canal de potasio
rectificador retardado (Berger y cols.,1989; Prystowsky, 1992) y un canal de
potasio sensible a ATP.
En células mitrales del bulbo olfatorio se encontró que la d-tubocurarina (dTC) disminuye la apertura de los canales KNa en registros de inside out. La
aplicación interna de d-TC (10-100 μM) disminuye la probabilidad de apertura de
los canales KNa cambiando la media del tiempo que el canal se encuentra en el
estado abierto y cerrado. La d-TC no modifica la conductancia del canal.
La piperidina R56865 (2.5 μΜ) y R58735 (sabeluzol; 2.5 μΜ) en neuronas
del bulbo olfatorio actúan de manera similar a la d-TC reduciendo la probabilidad
de apertura de los canales KNa cuando se aplican a la superficie interna de la
membrana. Concentraciones similares de ambas piperidinas también, disminuyen
la probabilidad de apertura de los canales KCa en cultivos de neuronas del bulbo
olfatorio. De este modo R56865 y R58735 no pueden ser considerados como
bloqueadores selectivos de los canales de KNa. La tetrodotoxina que bloquea
canales de Na+ dependientes de voltaje (1-10 μM), la caribdotoxina bloqueador del
canal KCa, la estrofantidina (1 mM) la cual inhibe la bombra Na+/K+ son capaces de
bloquear los canales KNa cuando se aplican a cualquier superficie de membrana
interna o externa (Egan y cols., 1992).
36
I. 16. Papel de los canales KNa en condiciones patológicas
Las altas concentraciones de Na+ que se necesitan para activar los canales KNa en
miocitos cardiacos (Kameyama y cols., 1984) conducen a concluir que este tipo de
canal podría llegar a estar activo exclusivamente en condiciones patológicas.
En miocitos ventriculares de cobayo, la hipoxia e isquemia se conoce que causan
un acortamiento de la duración del potencial de acción (Isenberg, 1983). Este
efecto puede ser mimetizado por drogas tales como pinacidil, que incrementa la
actividad de los canales de potasio dependientes de ATP (Nakaya y cols., 1991), o
por la inhibición de la ATPasa Na+-K+. Ya que durante la isquemia o la hipoxia en
células cardiacas se produce un incremento de la concentración de Na+, debido a
la interrupción de la bomba de Na+, es posible que los canales KNa contribuyan al
acortamiento del potencial de acción. Es más, la inhibición de la ATPasa Na+-K+
por glicósidos cardiacos causa una activación de la corriente de KNa en miocitos
ventriculares de cobayo (Luk y Carmeliet, 1990). Los canales KNa también tienen el
potencial para prevenir el influjo de Ca2+ por el intercambiador Na+-Ca2+ en
condiciones donde la concentración de Na+ es anormalmente alta (Kameyama y
cols., 1984). Así la corriente de KNa podría desempeñar un papel importante en la
respuesta de los miocitos cardiacos en condiciones tales como la isquemia e
hipoxia, o en la toxicidad causada por fármacos digitálicos. De manera similar, la
exposición de miocitos cardiacos a soluciones salinas sin cationes divalentes
causa un influjo de Na+ a través de los canales de Ca2+ tipo L, dando como
resultado un incremento substancial de Na+ intracelular. El bloqueo de los canales
de Ca2+ hace evidente una corriente de K+, la cual se relaciona directamente con
el incremento de la concentración intracelular de Na+, sugiriendo así que esta
corriente es mediada por los canales KNa. También, se ha descrito que la hipoxia o
la isquemia causan la activación de una corriente de K+ en varias neuronas
centrales de vertebrados. Esta corriente tiende a reducir la excitabilidad de la
membrana y la magnitud de la despolarización que puede ocurrir durante la
hipoxia. Hay evidencias farmacológicas que sugieren la contribución de los
canales dependientes de ATP a esta corriente de K+, pero se ha descrito también
que es posible que la corriente de KNa participe en este proceso. Como en las
37
células cardiacas, la hipoxia en neuronas centrales de vertebrados causa una
disminución en la actividad de bomba de Na+-K+ y un incremento en la
concentración de Na+ intracelular. Acoplado con la despolarización de la
membrana, la disminución resultante en el gradiente electroquímico del Na+ podría
causar que el intercambiador Na+-Ca2+ opere de manera invertida, conduciendo a
un incremento en la concentración de Ca2+ y la muerte celular. Este proceso
podría ser prevenido por la corriente de potasio activada por ATP y por las
corrientes de potasio dependiente de Na+.
II. JUSTIFICACIÓN
Se ha observado en las neuronas aferentes vestibulares, en registros de fijación
de voltaje en la configuración de célula completa, la disminución de una corriente
de potasio cuando en el medio extracelular se sustituye Na+ por colina. Esto
sugiere la existencia de una corriente activada por Na+ y debido a que no hay
reportes hasta el momento que demuestren su presencia en las neuronas
aferentes vestibulares, es de nuestro interés conocer si la corriente de KNa está
presente en estas neuronas. En tal caso, caracterizarla para compararla con las
propiedades de otros tipos neuronales para establecer su contribución al proceso
de posthiperpolarización del potencial de acción y a la determinación del patrón de
descarga de las neuronas aferentes vestibulares y así dilucidar su papel funcional.
III. HIPÓTESIS
En las neuronas aferentes vestibulares se expresa la corriente de KNa y ésta
contribuye al proceso de posthiperpolarización del potencial de acción y a la
determinación del patrón de descarga de las neuronas aferentes vestibulares.
IV. OBJETIVO GENERAL
Conocer si la corriente de potasio activada por sodio se expresa en las neuronas
aferentes vestibulares de la rata y determinar su papel funcional en estas
neuronas.
38
V. OBJETIVOS PARTICULARES
¾ Determinar si la corriente de KNa se expresa en las neuronas aferentes
vestibulares.
¾ Caracterizar las propiedades cinéticas de la corriente de potasio
activada por sodio y compararla con las ya reportadas en otras
preparaciones.
¾ Estudiar el papel funcional de los canales de KNa en las neuronas
aferentes vestibulares.
VI. MATERIAL Y MÉTODOS
VI. 1. Preparación de cultivo
Para la realización del cultivo primario de las neuronas aferentes vestibulares se
utilizaron 6 ratas neonatas por cultivo, de la cepa Wistar sin distinción de sexo de
edades 1P7-P10 (Soto y cols., 2002). La disección del ganglio vestibular se realizó
en una campana de flujo laminar y el instrumental utilizado se esterilizó con luz
ultravioleta (UV). Para obtener el ganglio vestibular se sacrificó a la rata por
decapitación y se quitaron los huesos de la bóveda craneal y posteriormente se
retiró el encéfalo con la finalidad de exponer los nervios vestibulares; éstos se
cortaron distalmente en la separación del nervio acústico y justo antes de la
entrada de las fibras al laberinto membranoso. Los ganglios vestibulares fueron
colocados en medio de cultivo L-15 al 100%. Después, los ganglios se colocaron
por 30 minutos a 37o C en una solución que contenía tripsina 0.125% y colagenasa
0.125% para la disgregación del tejido. Pasado este tiempo la solución enzimática
fue reemplazada por medio de cultivo L-15 fresco. Posteriormente, los ganglios se
centrifugaron por 5 minutos y se retiró el sobrenadante; éste fue reemplazado por
1
Postnatal
39
medio L-15 al 100%. Este procedimiento se realizó dos veces más. Después para
obtener la suspensión celular los ganglios vestibulares fueron pasados varias
veces por pipetas Pasteur cuyo diámetro de la punta fue de orden decreciente.
Finalmente, una gota de la suspensión celular fue puesta en el centro de una caja
de plástico que previamente había sido tratada con poli-D-lisina 10 mg/ml (Sigma)
y la caja fue transferida a una incubadora que se encontraba a 37 oC con una
atmósfera con 95% de aire y CO2 al 5%; las células permanecieron ahí por 45
minutos para que se adhirieran a la caja, pasado este tiempo fueron bañadas por
medio de cultivo L-15 modificado preincubado en CO2 5%. Las células estuvieron
en la incubadora 24 horas y posteriormente se realizó el registro electrofisiológico.
VI. 2. Registro de fijación de voltaje en neuronas aferentes vestibulares
Las neuronas fueron observadas con microscopio invertido con contraste de fases
y se identificaron como neuronas aquellas células redondeadas o elipsoidales
refringentes. Los registros de fijación de voltaje y fijación de corriente se realizaron
utilizando la configuración de célula completa. Los electrodos de registro fueron
hechos a partir de capilares de vidrio utilizando un estirador horizontal. Para
registros de célula completa se utilizaron aquellos que tuvieron resistencias de 1 y
3.5 MΩ. Estos electrodos fueron llenados con una solución interna para rata (tabla
III). Al momento de tocar la célula, se procedió a formar un sello de alta resistencia
succionando ligeramente. Una vez formado el sello de alta resistencia (mayor a 1
GΩ), se succionó hasta romper la membrana celular y establecer contacto
eléctrico con el interior de la neurona y así formar la configuración de célula
completa. Para el registro se utilizó un amplificador Axopatch 200B y los registros
se digitalizaron con un conversor analógico digital de 12 bits (Digidata 1200), la
señal se filtró a 2 KHz. Los parámetros experimentales se controlaron con una
interface usando el programa pClamp versión 9.0 y los datos se almacenaron en
una computadora compatible.
En todos los experimentos, una vez abierta la célula se realizó la
compensación electrónica al 80% de la capacitancia y la resistencia en serie. Los
protocolos que se utilizaron para los registros de fijación de voltajes fueron
40
diseñados para generar corrientes totales y los protocolos de fijación de corrientes
se diseñaron para generar potenciales de acción en las neuronas aferentes
vestibulares.
VI. 3. Reactivos
Todas las soluciones se ajustarán a una osmolaridad de 300 mOsm.
Las soluciones de registro que se usarán son las siguientes (concentraciones en
mM ):
Tabla III. Soluciones utilizadas en el registro electrofisiológico.
Solución
KCl
NaCl
ColinaCl
LiCl
CaCl2
MgCl2
HEPES
Glucosa
MgATP
NaGTP
Ouabaína
TTX
*Extra.
5.4
140
_
_
1.8
1.2
10
10
_
_
_
_
5.4
_
140
_
1.8
1.2
10
10
_
_
_
_
5.4
_
_
140
_
4.5
10
10
_
_
_
_
5.4
140
_
_
_
4.5
10
10
_
_
_
100
normal
Extra.
colina
Extra. Li
+
Extra.
TTX y 0
Ca
200
2+
Extra.
5.4
140
_
_
_
4.5
10
10
_
_
10
135
10
_
_
0.134
_
5
_
2
1
_
_
135
_
10
_
0.134
_
5
_
2
1
_
_
135
_
_
10
0.134
_
5
_
2
1
_
_
ouabaína
**Intra.
normal
Intra.
colina
Intra. Li
+
Las soluciones extracelulares fueron ajustadas a pH 7.4 con 0.1 M de KOH.
La solución intracelular fue ajustada a pH 7.2 con 0.1 M KOH.
* Extracelular, ** Intracelular.
¾ Enzimas: colagenasa 0.125% y tripsina 0.125% en medio de cultivo L15.
¾ Sustratos para la fijación de células: poli-D-lisina 100 μg/ml.
41
¾ Medio de cultivo: L-15 modificado para CO2, suplementado con
NaHCO3 10 mM, Hepes 10 mM, 10% de suero bovino fetal, penicilina 100
U/ml y fungizona dilución 1:100.
Toxinas
¾ Tetrodotoxina 100 y 200 nM.
¾ Toxina CgNa extraída de la anémona Condylactis gigantea 10 μM.
Sustitutos de NaCl extracelular: Cloruro de colina y LiCl.
VI. 4. Se emplearon las siguientes estrategias para evidenciar la corriente de
KNa:
¾
Se sustituyó NaCl por Cloruro de colina extracelularmente para
conocer si en un registro de corrientes totales, alguna corriente saliente era
afectada por la eliminación de Na+.
¾
Se aplicaron 100 nM y 200 nM de TTX para bloquear los canales
de Na+ dependientes de voltaje y de este modo conocer si el influjo de Na+
a la célula, activaba una corriente dependiente de la concentración de Na+
intracelular.
¾
En una solución sin Ca2+ extracelular, se realizaron registros
controles de corrientes totales y posteriormente se aplicó 100 nM de TTX
para conocer si a pesar de no encontrarse el Ca2+ en la solución una
corriente de K+ disminuía cuando el influjo de Na+ era bloqueado por la
toxina.
¾
Se aplicó la toxina CgNa (Salceda y cols., 2007) ya que se ha
demostrado que hace más lenta la inactivación del canal de Na+
42
dependiente de voltaje incrementando significativamente la integral de la
corriente, por lo que al permanecer abierto el canal de Na+ por un tiempo
mayor, esperábamos que la amplitud de la corriente de K+ que depende de
Na+ aumentara.
Se utilizó ouabaína para bloquear la bomba Na+-K+, para
¾
aumentar la concentración de Na+ intracelular y por consiguiente aumentar
la amplitud de la corriente de KNa.
Se sustituyó Na+ por Li+ en registro de fijación de voltaje y fijación
¾
de corriente para determinar que la corriente de K+ era activada por Na+.
VI. 5. Análisis de datos
Los registros se analizaron utilizando los programas computacionales, pClamp
versión 9.0, Excel y Sigma Plot versión 10.0. Se analizaron las corrientes en
condiciones control y cuando se utilizó alguna estrategia para evidenciar la
corriente de KNa.
En los registros de fijación de voltaje en la configuración de célula completa se
analizaron:
a) Corriente entrante y saliente al pico.
b) Corriente saliente en el estado estable.
c) Curvas corriente contra voltaje para corriente saliente medida al pico.
Los registros de corrientes totales donde se midió la corriente para cada voltaje se
muestran en la figura 6.1. La flecha indica donde se midió la corriente saliente al
pico para cada voltaje utilizado.
d) Curva de conductancia. Para calcular la conductancia iónica para el K+ (gion) se
utilizó la siguiente ecuación:
gK =
IK
VPRUEBA − E K
donde IK es el valor de la corriente iónica a un paso de voltaje dado; Vprueba - EK es
la fuerza de conducción para el ión y EK es el potencial de equilibrio. Se calcularon
43
las conductancias normalizadas, las cuales fueron graficadas en función del
voltaje. A esos datos se les ajustó la siguiente función de Boltzmann:
gK
=
g max
1
⎛ VPRUEBA−V 1
⎜
2
1 + exp⎜
s
⎜
⎝
⎞
⎟
⎟
⎟
⎠
donde gmax es la conductancia máxima, V1/2 es el valor del potencial al cual ocurre
el 50% de la conductancia y s es la pendiente de la curva.
B
Figura 6.1. Registro de corrientes totales utilizando la técnica de fijación de voltaje en la
configuración de célula completa. Se muestra el sitio donde la corriente fue medida en cada uno de
los registros. En A, corriente saliente al pico (círculo blanco), corriente saliente en el estado estable
(círculo negro) y corriente entrante (flecha) la flecha muestra el sitio donde se medió la corriente
entrante al pico. B, corriente saliente al pico (cuadrado blanco), corriente saliente en el estado
estable (cuadrado negro) y corriente entrante (flecha punteada). La línea punteada indica el cero de
corriente.
En los registros de fijación de corriente se midió:
Para calcular todos los parámetros mostrados se promediaron tres trazos para
cada condición experimental.
a) El potencial umbral se calculó derivando el potencial de acción respecto al
tiempo.
A los datos obtenidos se les aplicó la siguiente condición:
dv1 –dvt-1 > Media + 2 desviaciones estándar, siendo dv la derivada del voltaje.
b) La duración del potencial de acción se calculó realizando tres pasos:
El valor de amplitud fue multiplicado por 0.75menos el valor al pico.
44
Se busco este valor de voltaje en el potencial de acción.
Se restaron los ms del valor de voltaje encontrado en el paso dos menos los ms
donde el valor umbral fue encontrado.
c) El potencial de posthipepolarización del potencial de acción fue medido al pico.
d) El valor de amplitud del potencial de acción fue calculado sumando el valor en
mV del pico del potencial de acción más el valor en mV del umbral.
Figura 6.2. Potencial de acción. Se
muestran los parámetros que fueron
medidos.
1.- Umbral de disparo.
4
2.- Duración del potencial de acción.
3.- Posthiperpolarización al pico
4.- Amplitud del potencial de acción
2
VI. 6 Análisis estadístico
Las diferencias estadísticas fueron determinadas por medio de la prueba t de
Student para datos paramétricos, con una P < 0.05. Se eligió una t-Student
paramétrica para datos pareados, ya que las variables involucradas fueron
cuantitativas, dependientes y tuvieron una distribución normal.
45
VII. RESULTADOS
En las neuronas aferentes vestibulares de rata utilizando la técnica de fijación de
voltaje en la configuración de célula completa se caracterizó una corriente de
potasio activada por sodio. En los experimentos realizados las neuronas aferentes
se mantuvieron en cultivo primario durante 24 hrs.
VII. 1. La sustitución extracelular de Na+ por colina reveló una corriente de K+
sensible a Na+
Con el fin de saber si el Na+ activaba una corriente de potasio en las neuronas
aferentes vestibulares se sustituyó extracelularmente Na+ por colina. Se encontró
que al reemplazar el Na+ por colina la corriente entrante se redujo a prácticamente
cero y concomitantemente la corriente saliente disminuyó 40.1 ± 1 % (n = 5). La
sustracción de la corriente saliente después de la aplicación de colina y del
registro control, mostró que la colina afectó los componentes transitorio y
sostenido de la corriente saliente.
En la figura 7.1.A se muestra un registro de corriente saliente y corriente
entrante en presencia de Na+ extracelular y cuando el Na+ fue sustituido por
colina. Estas corrientes fueron generadas con un protocolo de estimulación que
parte de un potencial de sostenimiento (VH) de -60 mV y un pulso que va desde
-100 a 0 mV. Se graficó el curso temporal de la corriente saliente (negro) y de la
corriente entrante (blanco) en presencia de Na+ y cuando fue sustituido por colina.
En la figura 7.1.B se muestra un registro de corrientes totales en
condiciones normales, y cuando se reemplazó el Na+ por colina. Se muestra la
diferencia entre la corriente control y la corriente donde se reemplazó el Na+ por
colina. Estas corrientes totales fueron generadas con un protocolo de estimulación
que se muestra en el inserto. La figura 7.1.C muestra la relación corriente contra
voltaje para los datos presentados en la figura 7.1.B.
46
80 mV
-60 mV
VH= -60 mV
-100 mV
Figura 7.1. Registro de corrientes de K+ dependientes de Na+ en configuración de célula
completa. (A) Corriente saliente (círculo negro) y corriente entrante (círculo blanco) en presencia
de Na+ extracelular y cuando el Na+ fue sustituido por colina. La línea punteada indica el cero de
corriente. En la parte de abajo del panel A se muestra el valor de las corrientes saliente en negro
y en blanco la corriente entrante en presencia de Na+ y cuando fue sustituido con colina. La
corriente se recuperó cuando se perfundió nuevamente con Na+ extracelular. (B) Registro de
corrientes totales en condiciones normales (arriba) y cuando se reemplazó el Na+ por colina (en
medio). Abajo, la corriente saliente sensible a Na+ obtenida por substracción de la corriente
saliente control menos la corriente saliente con colina (C) Relación I-V para los datos mostrados
en B. (D) Curva de conductancia normalizada contra el voltaje para la corriente de K+
dependiente de Na+ (n = 5). Los datos se aproximaron con una función de Boltzmann, con una
V1/2 = -13.9 ± 0.4 mV, s = 7 ± 0.4.
Se realizó una curva de conductancia normalizada contra el voltaje para la
corriente de K+ dependiente de Na+. Los datos se aproximaron con una función de
Boltzmann con una V1/2 de -13.9 ± 0.4 mV, s = 7 ± 0.4 (Fig. 1.8.D).
47
VII. 2. La inhibición de la corriente de Na+ por TTX modifica la activación de
la corriente de K+ dependiente de Na+
Para conocer si el influjo de Na+ a través de los canales de Na+ dependientes de
voltaje activa una corriente saliente de potasio decidimos bloquear los canales de
Na+ dependientes de voltaje aplicando extracelularmente 100 y 200 nM de
tetrodotoxina (TTX), (Fig. 7.2.). Se utilizaron estas concentraciones porque ya se
ha demostrado que las neuronas aferentes vestibulares poseen una corriente de
Na+ dependiente de voltaje sensible a TTX (Soto y cols, 2002). Los registros se
realizaron en una solución extracelular normal. El valor de la corriente entrante
control fue de -16.9 ± 2.8 nA y el valor de la corriente saliente medida al pico fue
de 9.4 ± 0.5 nA. Encontramos que al bloquear los canales de Na+ dependientes de
voltaje con 100 nM de TTX, la corriente entrante disminuyó hasta -2.6 ± 1.5 nA y la
corriente saliente medida al pico resultante de haber substraído la corriente control
de la corriente después de haber aplicado TTX fue de 2.6 ± 1.1 nA. El porcentaje
de corriente saliente medida al pico que depende de sodio fue entonces de 27.7 ±
12.9 % (n = 4). Cuando utilizamos 200 nM de TTX encontramos que la corriente
entrante de Na+ medida al pico fue bloqueada completamente. La corriente
saliente después de la aplicación de TTX fue substraída de la corriente control
mostrando una corriente transitoria la cual duró cerca de 20 ms y la corriente al
pico fue de 2.3 ± 0.7 nA (n = 4). El porcentaje de corriente saliente medida al pico
que depende de sodio fue de 35.7 ± 6.3 % (tabla IV). La TTX no modificó
significativamente la corriente saliente en el estado estable.
Tabla IV. La TTX modificó la activación de la corriente de K+ dependiente de Na+.
n
4
Corriente
Corriente
Corriente
Corriente
% corriente
entrante (nA)
entrante (nA)
saliente (nA)
saliente (nA)
saliente
control
TTX
control
TTX
dependiente
de Na+
100
-16.9 ± 2.8
-2.6 ± 1.5
9.4 ± 0.5
2.6 ± 1.1
27.7 ± 12.9
200
-7.27 ± 1.9
0
6.5 ± 1.8
2.3 ± 0.7
35.7 ± 6.3
Media ± error estándar.
48
80 mV
-60 mV
VH= -60 mV
-100 mV
Figura 7.2. Registro de corrientes totales en condiciones control (1) y cuando se aplicó TTX 200
nM (2). Corriente saliente sensible a la aplicación de TTX 200 nM (3). En la parte superior se
muestra el protocolo de estimulación utilizado.
VII. 3. La concentración de calcio extracelular no modificó significativamente
a la corriente de potasio dependiente de sodio
La posibilidad de que la corriente de K+ fuera a por el influjo de Ca2+ a través de
los canales sensibles a TTX fue descartada eliminando el Ca2+ de la solución
extracelular y en esas condiciones se estudió el efecto del bloqueo de los canales
de Na+ dependientes de voltaje (Fig. 7.3.).
Otra razón por lo que se realizó este experimento fue porque mostramos
que cuando el Na+ fue sustituido por colina en la solución extracelular,
encontramos que la corriente entrante desapareció y ambos componentes
transitorio y sostenido de la corriente saliente fueron afectados. Además, se ha
demostrado que la colina bloquea una corriente de potasio dependiente de Ca2+
(Drake y cols., 1992). Por lo que decidimos quitar el Ca2+ extracelular y bloquear
con 100 nM de TTX los canales de Na+ dependientes de voltaje para saber si la
falta de Ca2+ y el bloqueo del influjo de Na+ afectaba también los componentes
transitorio y sostenido de las corrientes de K+, de la misma forma que la colina
afectó ambos componentes mencionados.
49
80 mV
-60 mV
VH= -60 mV
-100 mV
A
B
C
Figura 7.3. (A). Registro de corrientes totales en condiciones control (1), cuando se aplicó TTX
100 nM (2). Se muestra la diferencia entre la corriente control y la corriente donde se aplicó
TTX 100 nM (3). (B). Relación densidad de corriente saliente medida al pico contra voltaje para
los datos mostrados en A. (C). Curva de conductancia normalizada contra el voltaje para la
corriente de K+ dependiente de Na+ (n =4).
El Ca2+ fue sustituido por Mg2+, se aumentó la concentración de Mg2+ en la
solución extracelular para que la osmolaridad no se modificara y para mantener el
efecto pantalla en la membrana.
El valor de la corriente entrante en condiciones control fue de -5.9 ± 1. El
valor de la corriente saliente medida al pico en condiciones control fue de 10.5 ± 1
nA. Encontramos que cuando se perfundió TTX en la solución que no contenía
Ca2+, la corriente entrante desapareció y la corriente saliente medida al pico
50
disminuyó significativamente 22 ± 4.6 % (n = 5, P = 0.003). El valor de la corriente
entrante fue de -2.7 ± 0.8 nA y el valor de la corriente saliente medida al pico fue
de 8.64 ± 1.2 nA cuando se perfundió la solución de lavado (n = 4), (Fig. 7.4.).
El componente sostenido de la corriente saliente también fue afectado
cuando se perfundió 100 nM de TTX. En condiciones control el valor de la
corriente saliente en el estado estable fue de 8.8 ± 0.9 nA y cuando se perfundió
TTX la corriente saliente en el estado estable disminuyó significativamente 31.3 ±
6.2 % (n = 5, P = 0.004,) (tabla V). Cuando se perfundió la solución de lavado el
valor de la corriente entrante en el estado estable fue de 6.73 ± 0.8 nA (n = 4).
Se realizó una curva de conductancia normalizada contra el voltaje para la
corriente de K+ dependiente de Na+. Los datos se aproximaron con una función de
Boltzmann con una V1/2 de -9.1 ± 0.8 mV, s = 7 ± 0.8, n = 4.
Tabla V. La eliminación de Ca2+ no modificó la activación de los canales KNa.
n
4
Corriente
Corriente
Corriente
Corriente
% de
entrante (nA)
entrante (nA)
saliente (nA)
saliente (nA)
disminución
control
TTX
control
TTX
cuando se
aplicó TTX
Corriente
-5.9 ± 1
-2.7 ± 0.8
10.5 ± 1
8.6 ± 1.2
22 ± 4.6
8.8 ± 0.9
6.1 ± 1
31.3 ± 6.2
medida al
pico
Corriente
medida en *ss
Media ± error estándar, *estado estable.
51
0 mV
-60 mV
VH= -60 mV
70 mV
Figura 7.4. Corriente saliente
(círculo negro) y corriente entrante
(círculo blanco) en presencia de Na+
extracelular (en negro), cuando se
perfundió TTX 100 nM (en gris) y
cuando se aplicó la solución de
lavado (en gris tenue). En el inserto
se muestra el protocolo de
estimulación
que
generó
las
corrientes. Corriente saliente en el
estado estable (cuadrado).
-100 mV
VII. 4. La toxina CgNa no modificó significativamente a la corriente saliente
de K+
Se ha demostrado que la toxina de anémona CgNa hace más lenta la inactivación
de los canales de Na+ dependientes de voltaje (Ständker y cols., 2006; Salceda y
cols,
2007),
incrementando
significativamente
la
corriente
de
Na+
y
consecuentemente los cambios de la concentración de Na+ intracelular debidos a
la apertura de canales de Na+. Por estas razones la utilizamos para conocer su
efecto sobre la corriente de potasio activada por sodio. Lo que esperábamos es
que al hacerse más lenta la inactivación de los canales de Na+ dependientes de
voltaje, el influjo de Na+ aumentara y por lo tanto incrementara la corriente de
potasio dependiente de sodio. La concentración de toxina CgNa utilizada fue 10
μM. El protocolo de estimulación parte de un VH de -80 mV, después va desde -10
a -120 mV y regresa a -80 mV, (Fig. 7.5.). La corriente de K+ va a ser una corriente
entrante ya que el potencial de equilibrio para el potasio en estas condiciones
experimentales es de -76 mV, por lo que a este voltaje la corriente que era saliente
cambia su dirección y ahora es entrante y de esta manera la corriente de potasio
dependiente de sodio queda aislada. Para medir la constante de tiempo tau se
ajustó una exponencial simple a la inactivación de la corriente de Na+. El valor de
52
la constante de tiempo (tau) de inactivación de la corriente de Na+ en condiciones
control fue de 0.6 ± 0.05 ms y cuando se aplicó la toxina CgNa la tau incrementó a
1.41 ± 0.2 ms (tabla VI). El porcentaje de aumento de la tau de inactivación de la
corriente de Na+ fue de 128 ± 19.7 %, y concomitantemente la corriente entrante
de potasio medida en la cola incrementó 5.6 ± 2.4% (n = 4).
Tabla VI. La toxina CgNa no modificó significativamente a los canales KNa.
n
4
Tau (ms)
Tau (ms)
% de
Corriente
Corriente
% de
control
CgNa
aumento
entrante de
entrante de
aumento
potasio (nA)
potasio
control
(nA) CgNa
-2.25 ± 0.5
-2.4 ± 0.5
0.6 ± 0.05
1.41 ± 0.2
128 ± 19.7
5.6 ± 2.4
Media ± error estándar.
-10 mV
VH = -80 mV
-80 mV
-120 mV
Figura 7.5. Corriente de Na+ (triangulo negro) y corriente entrante de potasio dependiente de Na+
(triangulo blanco) en condiciones control en negro y después de aplicar la toxina de anémona CgNa
10 µM en gris. La línea punteada indica el cero de corriente. El trazo del lado derecho muestra una
ampliación del recuadro mostrado en la parte izquierda. Después de haber aplicado la toxina CgNa.
53
VII. 5. El bloqueo de la ATPasa Na+-K+ con ouabaína aumentó la amplitud de
la corriente de K+ dependiente de Na+
Se bloqueó la ATPasa Na+/K+ con ouabaína, con el fin de aumentar la
concentración de Na+ intracelular y como consecuencia aumentar la amplitud de
una corriente saliente dependiente de este ión. Se midieron las corrientes
salientes y entrantes al pico (a -20 mV), cuando se perfundió 1 mM de ouabaína y
cuando se reincorporó la solución control al medio extracelular (Fig. 7.6.). El valor
de la corriente saliente medida al pico en condiciones control fue de 2.6 ± 0.3 nA y
cuando se perfundió ouabaína 1 mM la corriente saliente medida al pico aumentó
significativamente 31 ± 12% (P = 0.029, n = 9). Este efecto se observó en 7 de 9
células. El valor de la corriente entrante en condiciones control fue de -12.7 ± 1.8
nA y cuando se perfundió ouabaína el valor de la corriente entrante medida al pico
disminuyó significativamente en 30 ± 5.4% (P < 0.001, n = 9). Cuando se
reincorporó la solución extracelular normal al baño el valor de la corriente entrante
fue de -8.7 ± 1.8 Na (tabla VII), este valor fue significativamente diferente respecto
al valor de la corriente entrante control (P = 0.002, n = 8). Los datos de la corriente
entrante y saliente medidos al pico con ouabaína y en condiciones de lavado
fueron normalizados respectivamente con base a los datos de la corriente entrante
y saliente control.
Tabla VII. El bloqueo de la bomba Na+/K+ con ouabaína aumentó la amplitud de la
corriente KNa.
Corriente
Corriente
% de
Corriente
Corriente
% de aumento
entrante (nA)
entrante (nA)
disminución de
saliente (nA)
saliente (nA)
de corriente
control
ouabaína
corriente
control
ouabaína
saliente
2.6 ± 0.3
3.4 ± 0.5
31 ± 12
entrante
-12.7 ± 1.8
-8.7 1.3
30 ± 5.4
Media ± error estándar.
54
A
B
C
D
Figura 7.6. (A, B). Registro de corrientes totales en condiciones control (superior) y cuando se
perfundió ouabaína 1 mM para dos células con capacitancia de 23.65 pF y 11.67 pF. (C). Relación
densidad de corriente saliente medida al pico contra voltaje para células con capacitancia de 20 ±
1.5 pF (n = 6). (D). Relación densidad de corriente saliente medida al pico contra voltaje para
células con capacitancia de 12.7 ± 0.7 pF (n = 3). Se muestra en condiciones control (negro) y
cuando se perfundió ouabaína 1 mM (blanco).
En seis células la corriente saliente fue medida hasta cero mV debido a que
esta se saturó por lo que no fue posible obtener registros a voltajes más
despolarizados, la capacitancia de estas células fue de 20 ± 1.5 pF. Sin embargo,
en tres células si fue posible registrar la corriente saliente y entrante a todos lo
voltajes de estimulación utilizados; la capacitancia de estas células fue de
12.7 ± 0.7 pF. Se realizó una curva de conductancia normalizada contra el voltaje
para la corriente saliente medida al pico control y cuando se perfundió ouabaína 1
mM (Fig. 7.7.). Los datos se aproximaron con una función de Boltzmann con una
55
V1/2 de -13.02 ± 0.9 y s = 7.7 ± 0.6, n = 6. La V1/2 difirió significativamente a -19.9 ±
2.4 cuando se perfundió ouabaína 1 mM al medio extracelular (P = 0.027, n= 6). El
valor de s cuando se perfundió ouabaína 1 mM fue de 7.9 ± 0.7, este valor no fue
significativo (P = 0.515, n = 6).
A
B
Figura 7.7. (A). Relación densidad de corriente entrante contra voltaje. En condiciones control
(negro) y cuando se perfundió ouabaína 1 mM (blanco). (B). Curva de conductancia
normalizada contra el voltaje para la corriente saliente en condiciones control y cuando se
perfundió oubaína 1 mM (n =6). Los datos se aproximaron con una función de Boltzmann, con
una V1/2 = -13.02 ± 0.9 mV, s = 7.7 ± 0.6, (n = 6) en condiciones control y con una V1/2 = -19.9
± 2.4 mV, s = 7.9 ± 0.7, (n = 6) cuando se perfundió ouabaína 1 mM. Las V1/2 fueron diferentes
significativamente (P = 0.027).
Se midió la corriente saliente (a -20 mV) en el estado estable (Iss) en
condiciones control, cuando se perfundió ouabaína 1 mM y cuando se reincorporó
la solución control al medio extracelular. El valor de la Iss en condiciones control
fue de 2.86 ± 0.4 nA y cuando se perfundió ouabaína 1 mM la Iss aumentó de
manera no significativa en un 9.7 ± 12 % (P = 0.452, n = 9). Estas nueve células
fueron divididas en dos grupos con base en si la Iss aumentó o disminuyó cuando
se perfundió ouabaína 1 mM (Fig. 7.8.). El valor de la Iss en condiciones control
para el grupo I fue de 2.8 ± 0.7 nA y cuando se perfundió ouabaína 1 mM la Iss
aumentó no significativamente 39.4 ± 17.8 % (P = 0.065, n = 4). Para el grupo II el
56
valor de la Iss en condiciones control fue de 3.4 ± 0.4 nA y cuando se perfundió
ouabaína 1 mM la Iss disminuyó significativamente 10.8 ± 2.6 % (P = 0.022, n = 5). A
B
Figura 7.8. (A). Corriente saliente (circulo blanco) y corriente entrante (circulo negro) en
condiciones control en negro y cuando se perfundió 1 mM de ouabaína para bloquear la
ATPasa Na+/K+ en gris. La aplicación de ouabaína aumentó la corriente saliente al pico y en el
estado estable. (B). La perfusión de ouabaína solo aumentó la corriente saliente en el estado
transitorio y disminuyó la corriente en el estado estable. La línea punteada indica el cero de
corriente.
VII. 6. La corriente de potasio activada por sodio no es activada por litio
Para evidenciar la corriente de potasio activada por sodio en las neuronas
aferentes vestibulares se sustituyó extracelularmente Na+ por Li+. Se midió la
integral de la corriente entrante y saliente en condiciones control y cuando se
sustituyó
Na+
por
Li+
(Fig.
7.9.)
Cuando
se
reemplazó
Na+
por
Li+
extracelularmente, la integral de la corriente saliente medida al pico disminuyó de
manera significativa 33 ± 8.5 % (P = 0.016). La integral de la corriente entrante fue
medida donde los valores de corriente entrante con Na+ y con Li+ no fueran
diferentes significativamente (n = 10; P = 0.087).
57
A
B
D
C
E
Figura 7.9. (A) Registro de corrientes totales en condiciones control (1) y cuando se reemplazó
Na+ por Li+ (2). Corriente saliente sensible a la sustitución de Na+ por Li+ (3). (B) Relación densidad
de corriente-voltaje para los datos mostrados en A. (C) Curva de conductancia normalizada contra
el voltaje para la corriente de K+ dependiente de Na+ (n = 8). Los datos se aproximaron con una
función de Boltzmann, con una V1/2 = -26.18 ± 0.4 mV, s =5.27 ± 0.3. (D) Gráfica que muestra la
integral de la corriente saliente normalizada en condiciones control cuando se sustituyó Na+ por Li+
(n = 10) y cuando se reincorporó el Na+ a la solución extracelular (n = 3). (E) Gráfica que muestra
la integral de la corriente entrante normalizada en condiciones control, cuando se sustituyó Na+ por
Li+ (n = 10) y cuando se reincorporó el Na+ a la solución extracelular (n = 3). * P< 0.05 control vs
Li+.
La corriente saliente se midió al pico y en el estado estable en un protocolo
de estimulación fijo, cuando se sustituyó sodio por litio y cuando se reincorporó el
sodio a la solución extracelular (Fig. 7.10). El valor de la corriente saliente al pico
fue de 8 ± 0.7 nA y cuando se sustituyó sodio por litio la corriente saliente
disminuyó significativamente 20 ± 3.2 % (n = 10, P < 0.001). Cuando se inició el
lavado con solución normal, la corriente saliente al pico fue de 6.3 ± 0.6 nA (n =
10, P = 0.002), difiriendo significativamente de la corriente saliente control. El valor
de la corriente entrante en condiciones control fue de -5.7 ± 1.05 nA y cuando se
sustituyó sodio por litio la corriente entrante disminuyó significativamente 26 ± 2.5
58
% (n = 10, P = 0.002). Cuando se reincorporó el sodio a la solución extracelular la
corriente entrante fue de -3.4 ± 0.9 nA, difiriendo significativamente de la corriente
saliente medida al pico control (n = 10, P < 0.001).
A
B
Figura 7.10. Registro de corrientes de K+ dependientes de Na+ en configuración de célula
completa (A) Corriente saliente (circulo negro) y corriente entrante (circulo blanco) en presencia
de Na+ extracelular, cuando el Na+ fue sustituido por Li+ y cuando se reincorporó el Na+ a la
solución extracelular. La línea punteada indica el cero de corriente. (B) se muestra el valor de
las corrientes saliente medidas al pico en negro y en blanco la corriente entrante en presencia de
Na+ y cuando fue sustituido con litio. La corriente se recuperó parcialmente cuando se perfundió
nuevamente con Na+ extracelular.
VII. 7. Papel funcional de la corriente de potasio activada por sodio
Se realizaron registros de fijación de corriente para conocer la participación de la
corriente de potasio activada por sodio en el potencial de acción de las neuronas
aferentes vestibulares. Se sustituyó sodio por litio y posteriormente se reincorporó
el sodio a la solución extracelular. Cuando se perfundió litio a la solución
extracelular el potencial de membrana se despolarizó 3.3 ± 0.4 mV (n = 4).
En condiciones control el valor al pico de la posthiperpolarización del
potencial de acción fue de -64.9 ± 1.3 mV y cuando se sustituyó sodio por litio el
valor al pico de la posthiperpolarización disminuyó significativamente 6 ± 0.8 %
(n = 4,
P = 0.006). Cuando se reincorporó el sodio a la solución extracelular el
valor al pico de la posthiperpolarización fue de -64.7 ± 1.3 Mv (tabla VIII). Este
valor no difirió significativamente del valor al pico de la posthiperpolarización en
59
condiciones control (n = 4, P = 0.711). Los parámetros: umbral, amplitud y
duración del potencial de acción no se modificaron significativamente. Estos se
muestran en la tabla 4. Los potenciales de acción fueron generados con una
inyección de corriente de 1.6 -2 nA (Fig. 7.11.).
Tabla VIII. Parámetros del potencial de acción en las neuronas aferentes.
Umbral (mV)
Amplitud (mV)
Duración (ms)
AHP (mV)
n
-55.91 ± 0.6
99 ± 5
1.8 ± 0.08
-64.9 ± 1.3
4
Li
-55.79 ± 1
103 ± 6
1.7 ± 0.2
-61 ± 1.1
Lavado
-55.83 ± 1.1
96 ± 5
1.8 ± 0.1
-64.7 ± 1.3
Control
+
Media ± error estándar.
Figura 7.11. Potencial de acción generado con una inyección de corriente de 1.6 nA. Se muestra en
condiciones control (negro) cuando se sustituyó Na+ por Li+ (gris) y cuando se reincorporó el Na+ a la
solución extracelular. El trazo control y con la solución de lavado se sobreponen.
60
Figura 7.12. Registro en fijación de corriente de la respuesta de la membrana ante pulsos de
corriente de corriente de -0.5 a 0.1 nA. Se muestra en condiciones control (A) cuando se
sustituyó Na+ por Li+ (B) y cuando se reincorporó el Na+ a la solución extracelular (C). Al lado
derecho de cada registro se muestra la gráfica del voltaje medido al pico máximo (flecha)
contra la amplitud del pulso para la célula mostrada del lado izquierdo en cada una de las
condiciones mencionadas.
61
La figura 7.12. muestra un registro de fijación de corriente de la respuesta de
membrana ante pulsos de corriente de -0.5 a 1 nA en condiciones control, cuando
se sustituyo sodio por litio y cuando el sodio fue reincorporado al medio
extracelular (tabla IX). Para medir la resistencia de membrana se graficó del
voltaje medido al pico máximo contra la amplitud del pulso. Posteriormente se
ajustó una línea recta a los puntos y la pendiente de esta recta representó en valor
de la resistencia de membrana.
Tabla IX. Efecto del Li+ sobre la resistencia de membrana de las neuronas
aferentes.
Vm (mV) al pico
n
Rm (MΩ)
Control
238.28 ± 22
-181.21 ± 11
7
Li+
261.16 ± 23
-189.28 ± 11
7
Lavado
234.74 ± 28
-178.30 ± 15
5
Media ± error estándar
Cabe mencionar que en todos los casos cuando se sustituyó Na+ por Li+ los
potenciales postpulso desaparecieron y cuando se reincorporó Na+ a la solución
extracelular reaparecieron.
62
VIII. DISCUSIÓN
Nuestros resultados indican que las neuronas aferentes vestibulares poseen
canales de K+ activados por Na+ intracelular. Las diferentes series experimentales
realizadas apoyan la existencia de una de corriente de KNa en las neuronas
aferentes vestibulares compuesta por dos componentes: uno transitorio y otro
sostenido. La corriente KNa transitoria parece ser activada por el influjo de Na+ a
través de los canales de Na+ activados por voltaje. Encontramos que el bloqueo de
los canales de Na+ sensibles a voltaje con la TTX produce una disminución
significativa de la corriente saliente, disminución que es proporcional al porcentaje
de bloqueo de la corriente de Na+. La TTX eliminó la corriente entrante y el
componente transitorio de las corrientes salientes sin afectar de igual forma el
componente sostenido. Estos datos concuerdan con lo reportado por Dryer y cols.,
en 1989. Este grupo reporta una corriente saliente de potasio sensible al bloqueo
de los canales del Na+ dependientes de voltaje con TTX, en neuronas del
mesencéfalo de pollo. Además se ha reportado que las neuronas de la médula
espinal de larvas de lamprea poseen dos conductancias diferentes de KNa, una es
activada por Na+ durante un potencial de acción y es inhibida cuando los canales
de Na+ son bloqueados con TTX. La segunda corriente de KNa es sostenida y
persiste aún en presencia de TTX. Ambas corrientes de KNa fueron abolidas
cuando el Na+ fue sustituido con colina o N-metil-glucamina indicando que ellas
son efectivamente activadas por el influjo de Na+ (Hess y cols., 2007).
Otra de las estrategias experimentales utilizadas para evidenciar los
canales de KNa en las neuronas aferentes vestibulares fue la sustitución de Na+
por colina. Encontramos que cuando el Na+ fue sustituido por colina la corriente
entrante disminuyó significativamente y concomitantemente la corriente saliente
medida al pico disminuyó también de forma significativa. Esto nos sugiere la
presencia de una corriente saliente dependiente de la concentración de Na+
intracelular. Se ha encontrado en neuronas de Xenopus laevis que la KNa es
activada por niveles basales de Na+ que son controlados al entrar el Na+ a la
célula vía canales de fuga. Para evidenciar la corriente de KNa en estas células se
sustituyó Na+ extracelular por lisina, colina, litio y N-metil-D-glucamina, la corriente
63
saliente disminuyó (44 ± 6 %, 33 ± 5 %, 15 ± 1.4% y 42 ± 6 % respectivamente) y
también la corriente entrante disminuyó (Dale, 1993).
Se ha encontrado que la colina bloquea una corriente de potasio
dependiente de calcio (Drake y cols., 1992). Por esto decidimos utilizar una
solución sin Ca2+ y con TTX para conocer si realmente el Na+ activa una corriente
de potasio. Encontramos que cuando se perfundió TTX en la solución que no
contenía Ca2+, la corriente entrante desapareció y la corriente saliente transitoria y
sostenida disminuyeron significativamente, indicando que la disminución de la
amplitud de la corriente saliente en el estado sostenido no es debido a un cambio
en la concentración de Ca2+ intracelular.
Estudios previos han demostrado que la toxina de anémona CgNa hace
más lenta la inactivación del canal de Na+ dependiente de voltaje (Salceda y cols.,
2007). Por esta razón, decidimos utilizarla ya que al permanecer abiertos los
canales de Na+ por un tiempo mayor produciría un aumento en la concentración
de Na+ intracelular lo que resultaría en un incremento en la amplitud de la corriente
de
KNa.
Después
de
haber
aplicado
la
toxina
CgNa,
se
incrementó
significativamente la constante de tiempo de inactivación de la corriente de Na+ y
concomitantemente la corriente entrante de potasio medida en la cola incrementó.
Se ha demostrado que los canales de KNa en células ventriculares de
cobayo pueden ser activados por el bloqueo de la bomba Na+-K+ a pesar de
exponer la parte intracelular del canal a una solución sin Na+ (Luk y Carmeliet,
1990). Ellos sugieren que en tal situación la concentración de Na+ debajo del
sarcolema, cerca a la boca del canal podría ser suficientemente alta para activar
los canales de KNa. Estudios de resonancia magnética nuclear han demostrado
que el Na+ intracelular aumenta rápidamente durante la isquemia (Takano y cols.,
1990) y esto junto con una posible isquemia que induce depresión de la bomba
Na+-K+ puede resultar una rápida elevación de Na+ durante la isquemia temprana
y a la posible activación de los canales de KNa (Mitani y cols., 1992)
Conociendo estos antecedentes nosotros decidimos bloquear la ATPasa
Na+/K+ con ouabaína, con el fin de aumentar la concentración de Na+ intracelular y
como consecuencia aumentar la amplitud de una corriente saliente dependiente
64
de este ión. Encontramos que la corriente entrante disminuyó significativamente ~
30% cuando se perfundió oubaína 1 mM, posiblemente debido a que la
concentración de intracelular de Na+ aumentó y la fuerza de empuje del Na+ para
permear los canales de Na+ dependientes de voltaje disminuyó. La amplitud de la
corriente saliente medida al pico aumentó ~ 31 %
en 7 células y en dos
disminuyó.
Para examinar que efectivamente los canales KNa son activados por el
influjo de Na+ se estudió el efecto de sustituir extracelularmente Na+ con una
cantidad equimolar de Li+. Ya que se ha demostrado que el varios cationes
inorgánicos son capaces de atraviesa los canales de Na+. En particular el Li+ se ha
demostrado que permea un poco más fácilmente que el Na+ (Hille, 1972). A pesar
de que el Li+ entra a través de los canales de Na+ usualmente no activa los
canales de KNa (Bischoff y cols., 1998; Dryer y cols., 1989). La amplitud de la
corriente saliente transitoria de las neuronas aferentes vestibulares disminuyó ~33
% y la corriente saliente sostenida se redujo ~23 % cuando el Na+ fue sustituido
con Li+. Estos resultados sugieren que un componente de la corriente sostenida es
mediado por la activación de los canales de KNa.
VIII. 1. Concentración de Na+ necesaria para la activación de los canales de
KNa
Desde que los canales de KNa fueron descubiertos por primera vez por
Kameyama y cols., en 1984 existe un debate acerca de cuál es el papel que estos
canales pueden jugar en condiciones fisiológicas y patológicas. Ya que la
concentración intracelular de Na+ que de manera usual requieren estos canales es
20 mM.
Utilizando microelectrodos sensibles a Na+ se han determinado los niveles
de Na+ en neuronas en reposo, estos se encuentran en un rango de ~ 4 a 15 mM.
También, la concentración intracelular de Na+ ([Na]i) en neuronas que han sido
estimuladas con altas frecuencias ha sido cuantificada, esta puede aumentar
hasta alcanzar en ciertos sitios concentraciones tan grandes como 100 mM. Las
principales dos rutas por las cuales entra el Na+ durante una actividad neuronal
65
son a través de canales de Na+ dependientes de voltaje y a través de receptores
ionotrópicos activados por un ligando, tales como receptores a glutamato AMPA y
NMDA. La recuperación del nivel basal de Na+, mediado por la expulsión de Na+ a
través de la ATPasa Na+/K+ es lento y en algunos casos requiere de varios
segundos (Rose, 2002).
Existe una evidencia de que los canales de Na+ y los canales de KNa se
encuentran colocalizados en axones periféricos de neuronas de Xenopus laevis
(Koh y cols., 1994). Esto permite un incremento de la concentración de Na+
durante un único potencial de acción y de este modo activando los canales de KNa.
Se ha encontrado que en cultivos de neuronas excitadoras de hipocampo la
aplicación de kainato podría incrementar la [Na]i por la activación de receptores
AMPA/kainato. Se encontró que existe una interacción bioquímica entre la
subunidad Slack y el dominio PDZ del PSD-95 (Uchino y cols., 2003). Las
proteínas PSD-95 tienen tres dominios PDZ, una de sus funciones es anclar a la
membrana a los receptores de glutamato ionotrópicos y a los canales de K+ por
medio de los dominios PDZ en neuronas excitatorias (Cho y cols., 1992). Por lo
que se ha propuesto que el influjo de Na+ a través de los receptores a glutamato
activa los canales KNa (Liu y cols., 1998).
El origen del Na+ involucrado en la activación de los canales de KNa en
estado estable en nuestra preparación, posiblemente es durante una descarga
repetitiva de potenciales de acción de las neuronas aferentes vestibulares, debido
a que el Na+ entra a través de los canales dependientes de voltaje y de este modo
puede activar los canales KNa.
VIII. 2. Comparación de los canales de KNa con los genes clonados que
codifican para las corrientes de KNa
Dos genes (Slack y Slick) codifican las corrientes de KNa han sido clonados
y su perfil farmacológico ha sido caracterizado así como su distribución en el
sistema nerviosos central Estos canales poseen diferentes cinéticas y son
modulados por diferentes mensajeros intracelulares. Los canales Slick se activan
rápidamente en respuesta a una despolarización y los canales Slack son
66
lentamente activados (Bhattacharjee y cols., 2002, 2003, 2005; Yuan y cols.,
2003). Las dos corrientes de KNa en las neuronas aferentes vestibulares
presentaron diferentes cinéticas con una corriente transitoria de rápida activación
comparada con la corriente en el estado estable. Aún, no se conoce la identidad
molecular de los KNa en las neuronas aferentes vestibulares; los dos tipos podrían
estar codificados por diferentes genes.
VIII. 3. Papel funcional de los canales de KNa
El papel fisiológico de los canales de KNa ha sido difícil caracterizar debido a
la falta de bloqueadores específicos. Sin embargo, existen varios estudios que
demuestran que los canales KNa podrían contribuir a la hiperpolarización que sigue
a una ráfaga de potenciales de acción (Safronov y Vogel, 1996; Franceschetti y
cols., 2003). Se ha demostrado una rápida corriente de KNa, limitada a la duración
de un potencial de acción, en las neuronas de la médula espinal de larvas de
lamprea (Hess y cols., 2007).
También los canales KNa han sido descritos en neuronas del núcleo medio
del cuerpo trapezoide (NMCT), éste
se encuentra en el tallo cerebral y está
involucrado en la vía de señalización auditiva. Se cree que los canales KNa en
estas células podrían jugar un papel importante en el enganche de fases entre el
estímulo y la descarga de las neuronas del NMCT, contribuyendo al proceso de
análisis de la diferencia de tiempo interaural que contribuye a la detección de las
fuentes sonoras (Yang y cols., 2007).
Nuestros resultados sugieren que los dos tipos de corrientes de KNa pueden
jugar diferentes papeles en las neuronas aferentes vestibulares. La corriente
transitoria está asociada con el influjo de Na+ durante los potenciales de acción y
contribuye a la fase temprana de repolarización del potencial de acción. La
corriente transitoria podría servir como un mecanismo de retroalimentación
negativa detectando el incremento en la concentración de Na+ durante un
potencial de acción y de esta forma ajustando la amplitud de la espiga así como su
duración. En cuanto a la corriente de KNa que participa en el estado estable no
parece ser activada por el influjo de Na+ durante un potencial de acción. Sin
67
embargo, la acumulación durante una ráfaga repetitiva podría alcanzar niveles de
Na+ suficientes para activar la corriente de KNa en el estado estable y por lo tanto,
ser la responsable de la posthiperpolarización independiente de Ca2+ en las
neuronas aferentes vestibulares de rata.
IX. CONCLUSIONES
¾ Los canales de potasio activados por sodio se expresan en las neuronas
aferentes vestibulares.
¾ Los canales de potasio activados por sodio presentan dos componentes: uno
transitorio y otro sostenido en las neuronas aferentes vestibulares.
¾ Los canales de potasio activados por sodio necesitan el influjo de Na+ a
través de los canales de Na+ dependientes de voltaje para activarse.
¾ La sustitución de Na+ por Li+ o colina no activa los canales de potasio
activados por Na+ en las neuronas aferentes vestibulares.
¾ Los canales de potasio activados por sodio participan en la fase de
repolarización y posthiperpolarización del potencial de acción de las
neuronas aferentes vestibulares.
¾ Los canales de potasio activados por sodio podría participar en el proceso de
hiperpolarización de la membrana activándose en condiciones de isquemia
cuando la bomba Na+-K+ falla.
X. PERSPECTIVAS
¾ Examinar la función de los canales KNa sobre la descarga repetitiva de las
neuronas aferentes vestibulares de rata.
¾ Utilizar técnicas de inmunocitoquímica para conocer el tipo de subunidad del
los canales KNa que se expresan en las neuronas aferentes vestibulares de
rata.
¾ Utilizar la técnica de RT-PCR para confirmar la presencia de los canales KNa
en las neuronas aferentes vestibulares de rata.
68
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