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Resumen: M-041
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Tipificación del virus del papiloma humano
en neoplasias epiteliales malignas de cavidad bucal.
Rosende, Virginia C. - Zibelman de Gorodner, Ofelia – Vallejos, Arnaldo R. – Lucero, Horacio
Instituto de Medicina Regional
Av. Las Heras 727 C.P.: 3500 Resistencia, Chaco - Argentina
Tel/Fax: 03722-422793 email: [email protected]
Antecedentes:
El virus del papiloma humano (HPV) es un virus ADN, con epiteliotrofismo y ha sido estudiado exhaustivamente en
estas dos décadas por métodos sofisticados como los de biología molecular.1
Ferraina divide a los virus ADN oncogénicos en tres grupos, los papovavirus incluyendo al HPV, los adenovirus y los
herpesvirus.2
De los grupos virales mencionados es tema de nuestra investigación el HPV. Los virus del papiloma humano infectan
selectivamente el epitelio de la piel y las mucosas. Estas infecciones pueden ser asintomáticas, producir verrugas o
asociarse a diversas neoplasias, benignas y malignas.3
El virus del papiloma humano presenta más de 73 tipos bien definidos; entre ellos hay tipos que comúnmente se
relacionan con lesiones benignas y otros bien reconocidos que implican un alto grado de transformación maligna.
Los tipos diferentes comparten menos del 90% de sus secuencias de ADN en L1.3 Los HPV son específicos de especie
y los tipos concretos se asocian a manifestaciones clínicas específicas. Reguezi menciona especificidad de sitio de tejido
o latencia del HPV en algunas lesiones epiteliales bucales que se asocian con el HPV.
Además los diferentes tipos de HPV no solo se diferencian por la morfología de las lesiones que producen, sino también
por su posible potencial oncogénico.4 Es por ello que se los ha clasificado en tres grupos de acuerdo a su potencial
oncogénico y al tipo de lesión que producen5 basándose en neoplasias intraepiteliales cervicales. Bonnez y varios
autores los agrupan en los de mayor riesgo HPV tipos 16 y 18, los de riesgo intermedio HPV tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51
y 52 y los de menor riesgo los tipos 6, 11, 42 y otros.6,7
El papel que juegan determinados tipos de dicho virus en la oncogénesis está bien establecido en las lesiones genitales,
no así en otras localizaciones, como la cavidad bucal. Es de aquí que surge el interés por identificar en lesiones bucales
malignas cual o cuales de estos tipos son los más frecuentemente implicados.
Investigaciones epidemiológicas recientes han postulado la posibilidad de una conexión entre la infección viral por el
virus del papiloma humano y la existencia del carcinoma de células escamosas de la cavidad bucal.8-9
La presencia viral ha sido detectada en lesiones precursoras utilizando técnicas de inmunohistoquímica (Peroxidasa –
antiperoxidasa) entre otras.10-11 Como así también en neoplasias benignas y malignas de la cavidad bucal en muchos
trabajos realizados por numerosos grupos de investigadores.12-13-14-15-16
La relación causa – efecto del virus del papiloma humano en el cáncer bucal todavía está siendo estudiada, pudiendo
desempeñar un activo papel en su iniciación. Se han identificado virus de alto riesgo que codifican oncoproteínas que
comprometen el crecimiento celular fisiológico a través de la unión con los productos de los genes supresores tumorales
y posiblemente el efecto oncogénico de estos virus sea la consecuencia, al menos en parte, de estas interacciones. Se ha
postulado también que pueden actuar sinérgicamente con otros co-factores como el tabaco y el alcohol en el desarrollo
de un carcinoma.
Premoli-De-Percoco y Ramirez13 investigaron la presencia de HPV y algunos cofactores etiológicos en el carcinoma de
células escamosas de la cavidad bucal sobre una población de 50 mujeres con ese diagnóstico. Utilizando la técnica de
PCR identificaron los tipos 6, 11, 16 y 18 en el 60% de los casos. El grupo fue analizado de acuerdo a los hábitos de
fumar, consumo de alcohol, embarazos, salud bucal y nivel socioeconómico. De este trabajo se rescata no sólo la
asociación del HPV con el carcinoma de células escamosas, sino también que apoya un modelo multifactorial de la
etiología del cáncer bucal.
Los propósitos principales de este estudio han sido determinar los tipos de HPV asociados a carcinomas epidermoides
bucales, establecer que tipo viral es el más frecuentemente implicado en ellos y compararlos con los tipos de mayor
incidencia en mucosa genital. Para tal fin se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Materiales y Métodos:
Se analizaron 20 casos de biopsias de lesiones epiteliales malignas de la cavidad bucal diagnosticados durante el
período comprendido entre el 01-01-97 y el 31-12-99 en el Servicio de Patología y Citodiagnóstico del Hospital Dr.
José R. Vidal (Corrientes). Las mismas fueron fijadas en formol e incluidas en parafina.
Además se recolectaron 41 muestras obtenidas por hisopados de lesiones con diagnóstico presuntivo o confirmado de
neoplasias epiteliales malignas de boca de pacientes que concurren al Servicio de Cabeza y Cuello del Instituto de
Oncología “Ángel H. Roffo” las cuales fueron suspendidas en buffer de PBS para su posterior procesamiento.
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La técnica de diagnóstico que se utilizó es la de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Se realizó la amplificación
por PCR usando los primers genéricos MY 9 y 11 que amplifican un fragmento de 450 pb dentro de la región L1.
Las muestras de tacos parafinados primero se analizaron microscópicamente para seleccionar los que presentan
características histológicas de HPV. Luego se realizó la desparafinización de los cortes de tejido con xilol; la extracción
de ADN se realiza de dos maneras: extracción con bromuro de cetil trimetilamonio, con purificación y extracción con
buffer de digestión con proteinasa K con o sin purificación.
A las muestras de hisopados se les realizó directamente la extracción de ADN con bromuro de cetil trimetilamonio, con
purificación.
En ambos tipos de materiales se realizó la amplificación del ADN por PCR. Los productos amplificados fueron
evaluados por electroforesis en gel de agarosa 3%, y observados en transiluminador previa tinción con bromuro de
etidio.
.Se realizó documentación fotográfica.
Además se realizó amplificación de control interno de integridad de ADN extraído: amplificación del gen de β globina.
Discusión de Resultados:
En total se localizaron 56 casos de carcinoma bucal, que presentaban tacos de parafina. De los cuales 24 presentan
características histopatológicas de lesiones por HPV y 4 son dudosos.
Biopsias
56
HPV +
24
HPV 28
Dudosos
4
Cuadro I: Análisis Histopatológico de biopsias del Servicio de Patología y
Citodiagnóstico del Hospital “Dr. J. R. Vidal”
Luego de realizar la PCR específica para HPV de 20 muestras que presentaban características histopatológicas de HPV,
ninguna de ellas presentó la banda correspondiente en gel de agarosa (450pb). También se realizó el control interno de
amplificación del gen de β - globina, tampoco demostró bandas del amplicón correspondiente (289 bp).
Luego de este control se constató que los métodos de extracción de ADN no arrojaron cantidad suficiente de ADN
molde que sirviera para la amplificación con primers específicos de HPV.
Debido a los inconvenientes citados se optó por trabajar con muestras frescas obtenidas de hisopados bucales
resuspendidos en buffer de PBS, por lo cual se obtuvieron 41 casos procedentes del Servicio de Cabeza y Cuello del
Instituto de Oncología “Ángel Roffo”, Capital Federal. Se extrajo material genómico y se realizó amplificación por
PCR de 33 casos.
Una vez que se realizó la extracción del material genómico de las muestras de hisopado con bromuro de cetil
trimetilamonio y su posterior amplificación por PCR tanto para HPV como para el gen de β -globina, se observó que
24 casos son β - globina positivos, 13 HPV negativos y 11 HPV positivos; en los 9 casos restantes el material fue
insuficiente para realizar el estudio.
Tipos de muestras
Biopsias
Hisopados bucales
Totales
Halladas
56
41
97
Estudiadas por
PCR
En proceso*
20
6
33
8
53
14
Genotipificadas
0
0
0
Cuadro II: Estado actual del total de muestras de ambos tipos de materiales.
*las muestras en proceso son aquellas que están en etapa de extracción de ADN, en amplificación o genotipificación.
Hisopados HPV + HPV - Material insuficiente** En proceso*
33
11
13
9
8
Cuadro III: Resultados de PCR de hisopados bucales procedentes del Servicio de Cabeza y Cuello del Instituto de
Oncología “Ángel Roffo”
*las muestras en proceso son aquellas que están en etapa de extracción de ADN, en amplificación.
** corresponde a muestras que se debe repetir la toma ya que presentaron baja carga genómica.
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Conclusión:
El presente es un informe de las primeras muestras que han sido procesadas. Aunque si bien el número de casos
analizados es bajo podemos decir que los métodos de extracción utilizados en los tacos parafinados de biopsias del
Servicio de Patología y Citodiagnóstico del Hospital “Dr. J. R. Vidal”, no proporcionaron una cantidad suficiente de
ADN para su posterior amplificación por PCR.
Las muestras de hisopados obtenidas del Servicio de Cabeza y Cuello del Instituto de Oncología “Ángel Roffo”, en su
mayoría proporcionó mayor cantidad de material genómico, suficiente para ser analizado por PCR tanto para β -globina
como para HPV. De 33 muestras a las que se les realizó extracción de ADN con bromuro de cetil trimetilamonio (con
purificación), luego de su amplificación por PCR para β - globina 24 muestras fueron positivas. De las cuales 11 fueron
positivas para el gen de HPV. Los 9 casos restantes no proporcionaron suficiente material para realizar la PCR, por ello
se debe repetir la toma de muestra.
Actualmente se siguen procesando muestras de hisopados bucales, como así también de biopsias para llegar a corregir
la técnica de procesamiento. Una vez finalizadas las amplificaciones por PCR para HPV se realizará la genotipificación
por PCR-RFLP (utilizando enzimas de restricción específicas), a todas aquellas muestras que presenten material
genómico viral.
Estos resultados preliminares permiten inferir la existencia de una relación entre el HPV y los carcinomas epidermoides
bucales, cuya significación y magnitud podría expresarse al concluir el estudio de todas las muestras.
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