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BACTERIAS LÁCTICAS Y FERMENTACIÓN MALOLACTICA (FML)
Aline Lonvaud
Faculté d'œnologie, 351 cours de la Libération, 33405 Talence - France
Tél. + 33 (0) 556846466, Fax. + 33(0) 556846468
¿A qué se llama FML en vinificación?
La FML aparece luego de la fermentación alcohólica en un periodo de tiempo que varía de algunos
días a varios meses. Se manifiesta por la presencia de dióxido del carbono, aunque en menor medida
que en la fermentación alcohólica. Debido a este parecido es que esta fase de la vinificación lleva el
nombre de fermentación.
En el sentido bioquímico, el fenómeno principal no es una fermentación (producción de energía a
partir de la oxido-reducción de substratos en ausencia de oxígeno), sino una reacción simple de
decarboxilación del ácido málico en ácido láctico.
COOH
|
HO–C-H
|
CH2
|
COOH
Ácido L-málico
COOH
|
HO–C–H + CO2
|
CH3
Ácido L-láctico
El ácido málico presente en el mosto de uva (isómero L) es transformado molécula a molécula en
ácido láctico (isómero L).
En el vino, antes de la FML, la concentración en ácido málico es muy variable, desde 1 g/L como
mínimo hasta 8 g/L o más. La concentración de málico depende esencialmente del estado de
madurez de la uva en el momento de la cosecha, de las condiciones climáticas durante el verano, de
la cepa, de la tierra, etc. Las uvas de regiones más septentrionales son más ricas en ácido málico.
¿Cómo se sigue la puesta en marcha y la evolución de la FML?
La reacción de decarboxilación del ácido málico es el hecho prominente de la FML, por la cantidad de
substrato puesta en juego y por las repercusiones en los principales rasgos del vino (aumento del pH,
reducción de acidez total). El seguimiento de la FML se hace, por consiguiente, midiendo la
desaparición del ácido málico.
-
-
En la bodega: el método por cromatografía en papel (o en capa fina) es simple de
realizar y un fenómeno bien revelado. Las manchas de vino, sembradas en la base
de la hoja, son sometidas a una cromatografía gracias a la ascensión de un
solvente por capilaridad. La migración separa ácidos, en particular los ácidos málico
y láctico, cuya revelación es realizada con un indicador coloreado. Durante la FML,
la intensidad de la mancha del ácido málico disminuye, mientras que la mancha de
ácido láctico aumenta. Esta prueba no requiere de ningún equipo sofisticado y/o
costoso. Sin embargo, no es muy sensible ni precisa. Esto hace a la necesidad de
tener como recurso otros métodos analíticos, en caso de dudas en la puesta en
marcha de la FML e incluso al final del proceso.
En el laboratorio: la determinación del ácido málico a menudo se realiza por
métodos enzimáticos. El análisis es muy fiable y sensible. La FML degrada la
totalidad del ácido málico. A menudo, en la práctica, se considera que la FML ha
terminado cuando sólo existe cerca de 100-200 mg/L de ácido málico. De todas
maneras, en la mayoría de los casos, durante algunos días después del sulfitado se
mantiene una cierta actividad bacteriana y el deterioro continúa hasta el término de
la FML.
Como el ácido málico se transforma exclusivamente en ácido L-láctico, un buen método para detectar
el comienzo de la FML es, por lo tanto, determinar la presencia de este último. Si su concentración
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es superior a 200-300 mg/L, es probable que la FML haya comenzado. Pero este proceso no sería
posible si no existiera algún tipo de actividad bacteriana durante la fermentación alcohólica.
¿Qué cambios provoca la FML?
Debido la degradación total del ácido málico (ácido dicarboxílico) en ácido láctico (monocarboxílico) y
a la liberación de CO2, el cambio esencial es la disminución de acidez. La FML es una
desacidificación biológica de vino. El pH se aumenta, la acidez total disminuye y la acidez del ácido
málico es reemplazada por un sabor más suave, debido al ácido láctico. Esta es la razón por la cual
se busca la FML, adaptándose bien para vinos blancos de regiones septentrionales, vinos base de
Champán, vinos blancos de Burgundy y, en general, vinos de la variedad Chardonnay. Además de las
características aromáticas varietales de los vinos, numerosos vinos blancos de ven beneficiados con
esta fermentación. Pero incluso a partir de Sauvignon, se han obtenido vinos más intensos,
complejos, estructurados y untuosos. En los vinos tintos la disminución de acidez, debida al FML, es
primordial por la suavidad y la redondez que aporta. Todos los vinos tintos, excepto ciertos casos,
requieren una FML.
Sin embargo, la desacidificación no es la única consecuencia. Las muy numerosas transformaciones
son implícitas en la evolución gustativa y aromática. Algunas substancias volátiles son sintetizadas y
ciertos componentes del color (en los vinos tintos) son modificados. Estos cambios se ponen en
evidencia por el análisis sensorial. Hasta ahora, no se han identificado todas estas sustancias.
Una de estas transformaciones es la del ácido cítrico cuya concentración inicial máxima es el orden
de 0,25 g/L. Ella conduce a la formación de diacetilo (molécula del aroma a manteca) que participa de
manera obvia al bouquet del vino, siempre que no se perciba de manera excesiva. Asimismo, las
moléculas carbonílicas formadas durante la FML conducen, a través de reacciones químicas con
aminoácidos, a la producción de sustancias aromáticas heterocíclicas. Finalmente, el metabolismo de
los aminoácidos, tales como metionina y cisteína, produce compuestos volátiles interesantes.
Durante la FML, el aumento de acidez volátil es débil, menos de 0,15 g/L. Este aumento proviene de
la fermentación de azúcares residuales de la fermentación alcohólica y de la degradación del ácido
cítrico.
La estabilidad microbiológica no debe ser considerada cómo estricta después del FML. La producción
de la substancia tóxicas y la utilización de nutrientes esenciales durante la FML pueden transformar
eficazmente al medio en hostil para las bacterias. Pero si el pH es demasiado elevado, tal inhibición
no se cumple y el medio se torna sensible a la contaminación.
Ácido cítrico rique
Ácido oxálico
Ácido acético
Ácido pirúvico
ATP
Diacetilo
Acetoína
Butanodiol
Ácido acético
CO2
Acetil-CoA
Ácidos grasos
Lípidos
¿Por qué ocurre la FML después de la fermentación alcohólica?
La FML es el resultado de la actividad de bacterias lácticas que se multiplican en el vino y alcanzan
una importante población.
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Las bacterias existen en el mosto de uva, pero las condiciones del vinificación son tales que
prácticamente no se desarrollan durante la fermentación alcohólica. En el mosto existe una gran
variedad de bacterias. El medio rico en azúcar, en aminoácidos y vitaminas sería muy favorable para
su crecimiento, si las levaduras no colonizaran primero el medio. En la competencia entre levaduras y
bacterias, son las primeras quienes ganan ya que están mejor adaptadas que las bacterias. El medio
« ocupado » por la masa de levaduras en fermentación se pone progresivamente más hostil para las
bacterias. La diversidad inicial de especies se reduce y la población disminuye hasta el final de la
fermentación alcohólica.
En este momento, el vino aloja, además de una población de levadura en fase de muerte y autolísis,
una población de bacterias lácticas débiles pero seleccionadas para tolerar numerosos inhibidores. La
composición del medio continúa cambiando porque, a pesar de la finalización de la fermentación de
los azúcares, otros fenómenos bioquímicos importantes continúan, entre ellos la autólisis de
levaduras que libra factores de crecimiento y nutrientes para las bacterias lácticas. Por su lado, las
bacterias, debido a la acción de proteasas y glucanasas, aceleran esta autólisis. En suma, la totalidad
de fenómenos bien conducidos lleva al crecimiento de bacterias. Cuando la población alcanza 106
UFC/mL, el deterioro del ácido málico comienza, iniciándose así la FML. Una vez que esta se pone en
marcha, avanza hasta su término, excepto en raros casos donde ocurre un enfriamiento brusco.
¿Qué bacterias intervienen y cuáles son los factores para su desarrollo?
En una FML espontánea, las bacterias lácticas provienen de la contaminación natural del mosto de
uva. Hasta ahora, más de diez especies de lactobacilos y cocos se han identificado en el mosto y en
el vino.
Taxonomía de las bacterias lácticas del vino
Géneros: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus
Especies: Lactobacillus plantarum, L. casei, L. hilgardii, L. brevis, L. fructivorans, L.
kunkei, L. nageli, L. diolivorans ...
Pediococcus damnosus, P. cerevisiae, P. parvulus
Leuconostoc mesenteroides
Oenococcus oeni
P. damnosus
L. hilgardii
Oenococcus oeni
Los principales factores que actúan sobre el crecimiento bacteriano son la graduación alcohólica, el
tenor de dióxido de azufre, la temperatura y el pH. El efecto de cada uno de ellos debe ser
considerado en función del nivel de los otros tres. En la práctica, se ha demostrado que el vino no se
debe sulfitar después de la fermentación alcohólica, y que la temperatura se debe controlar. El
contenido de SO2 libre debe ser lo más bajo posible; este, en general, es nulo porque la cantidad
agregada en la vendimia se combina. La temperatura óptima para conseguir el arranque de la FML es
20 a 22°C. Un enfriamiento ulterior generalmente disminuye la velocidad del proceso, mientras que un
calentamiento la realza.
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El etanol se vuelve apreciablemente inhibitorio para las bacterias a partir del 10%. La FML es, por
consiguiente, más difícil en vinos de tenor de volumen alcohólico elevado. No obstante, el factor más
importante es el pH. En el rango de 3.00 a 4.00, mientras más elevado sea el pH, más próspero es el
medio para el crecimiento bacteriano. Debajo del pH 3.00, en vinos muy ácidos, la FML es
particularmente difícil y, a la inversa, si el pH es mayor la FML es más fácil. Pero asimismo, esto
significa que a mayor pH, mayor es la variedad de bacterias capaces de multiplicarse. La sección
exclusiva de las especies Oenococcus oeni se limita a las condiciones de pH.
Se considera que las especies Oenococcus oeni son favorables para la calidad de los vinos. En todo
caso, es la especie predominante durante el FML porque, probablemente, es la mejor adaptada al
vino, luego de la fermentación alcohólica.
Pero en una FML espontánea son varias las especies que intervienen en forma simultánea.
En vinos de pH elevado, aunque O. oeni es la especie predominante durante la FML, no es la única.
Todas las otras especies también transforman el ácido málico en láctico. En estos vinos, donde la
selección es menos eficaz, los pH se acercan a menudo a 4.00 al final de la FML permitiendo el
desarrollo de lactobacilos o pediococos, cuyos efectos a veces son nocivos.
Diversidad de las cepas de Oenococcus oeni durante la fermentacion maloláctica
D
B
F
E
B
C
G
A
A
Perfil de restricción de 18 aislamientos de una curva de FML
¿Cómo dominar a las bacterias lácticas?
Para prevenir la FML: el método más usual es el sulfitado del vino luego de la fermentación
alcohólica. El SO2 libre es muy eficaz contra las bacterias lácticas, tanto más cuando el pH es bajo.
De hecho, es el SO2 molecular (o SO2 « activo ») quien ejerce el efecto tóxico. En vinos blancos, que
no deberían sufrir una FML, o en casos particulares de vinos tintos, son sulfitados al final de la
fermentación alcohólica en dosis para su conservación definitiva, con 20 a 30 mg/L de SO2 libre.
Para retardar la FML: la velocidad de crecimiento bacteriano no es fácil de reducir si la FML ya ha
comenzado. En la práctica, después de la fermentación alcohólica, si el vino es mantenido o llevado a
una temperatura de 18-20°C, hay pequeñas variaciones en los inicios de la FML. Por lo tanto, las
bajas temperaturas pueden retardar el fenómeno momentáneamente previniendo la multiplicación de
bacterias. Un calentando posterior permite recuperar las condiciones óptimas para la FML. Otra forma
de lograr un retraso de la FML puede ser la destrucción de una parte de la flora bacteriana. Esto
puede lograrse por el agregado de lisozima que, por hidrólisis de la pared celular de las bacterias,
lleva a la muerte de la célula. Dosis de 10 a 25 g/hls, después de que ha comenzado fermentación
alcohólica, permite retardar (o prevenir) la FML. Su eficacia, sin embargo, es menor para los vinos
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tintos por causa de la reacción de los polifenoles con la enzima. La acción de la lisozima
probablemente disminuye con el tiempo por desnaturalización de la proteína. Las lisozimas también
pueden ser útiles en el encuvado al evitar la picadura láctica, resultado de la fermentación alcohólica
y FML simultánemente.
Para activar la FML : la FML no comienza espontáneamente si las bacterias indígenas no alcanzan
una población de 106 UFC/ml. Esto significa que la importancia de los cuatro parámetros principales,
temperatura, etanol, pH y SO2, es incompatible con el crecimiento. Esto es suficiente la mayoría de
las veces para intervenir actuar sobre ellos con el objeto de invertir la situación. Si el vino no recibe un
sulfitado después de la fermentación alcohólica, y como uno no puede actuar sobre el grado
alcohólico, por consiguiente, los únicos factores que pueden manejarse siguen siendo la temperatura
y el pH.
La primera precaución a tomar es evitar un descenso excesivo de la temperatura del vino después de
la fermentación alcohólica. El vino debe calentarse hasta 18-20°C si el ácido málico no comienza a
ser degradado. En casos de vinos ácidos, la desacidificación química con carbonato de calcio de un
volumen pequeño del tanque permite conseguir un pie de cuba. Una vez que la FML se activó en esta
porción es reincorporada en el tanque. Esto también es beneficioso en ciertos casos como en los
vinos de prensa donde la FML, generalmente, suelta muy fácilmente. Pero la incorporación del vino
de prensa al vino de gota necesariamente no es una buena solución en este estadio del desarrollo del
vino.
¿Qué es un fermento maloláctico?
La mejor solución, cuando la FML no comienza a pesar de una temperatura apropiada y la ausencia
de SO2 libre, es, hasta el momento, el agregado de fermentos malolácticos. Se trata así de
compensar la deficiencia de la población indígena. El agregado macivo de bacterias permite superar
una fase de crecimiento problemática. A menudo estas preparaciones se usan cuando el fenómeno
de la FML no comienza espontáneamente en varias semanas o meses después de la fermentación
alcohólica. Un hecho, sin explicación, es que un retraso en el agregado de los fermentos lácticos
después de la fermentación alcohólica aumenta aún más su eficacia en las disminuciones.
Los fermentos malolácticos son preparaciones concentradas y liofilizadas de cultivos de Oenococcus
oeni. Se comercializan varios tipos de preparaciones para el inoculado o sembrado de vinos ya sean
directamente o después de la reactivación. El primer criterio para su selección es su capacidad de
sobrevivir después de la inoculación en el vino. El protocolo de utilización puede variar según las
preparaciones comerciales. En todos los casos la inoculación tiene como meta alcanzar una
población de 106 UFC/mL para degradar el ácido málico, sin esperar que la microflora indígena
aumente. Incluso, hasta en las mejores preparaciones, las bacterias no son capaces de multiplicarse
en vinos difíciles. En este caso la biomasa agregada, tanto como la que guarda viabilidad, degrada el
ácido málico activamente. Aunque el aumento de la población sea débil o nulo, no impide la FML.
Pero los vinos de tanques donde la FML fue iniciada de esta manera no deben ser considerados a
partir de los fermentos eficaces para otros vinos difíciles. Contrariamente a los fermentos de levadura
de LSA (levadura seca activa) que pueden multiplicarse en tanques de fermentación, los fermentos
malolácticos no son muy posibles de esparcir en todas los tanques de un sótano.
Los fracasos de los años 1975 - 1980 muestran que es mucho más difícil de preparar un fermento
maloláctico eficaz que un fermento « LSA ». De hecho, las levaduras están muy bien adaptadas al
crecimiento en la uva molida, mientras que las bacterias deben encontrar su adaptación al vino, la
cual perdió durante su aislamiento y multiplicación. De este hecho se justifica que no existan más que
un número muy pequeño de fermentos malolácticos comerciales.
Las incidencias organolépticas de las diferentes cepas son probables, pero ningún resultado fiable y
aplicable permite escoger un fermento actualmente para una contribución aromática dada. El
desarrollo de fermentos malolácticos debe someterse a un mejor estudio de medios puesto
espontáneamente en obra por la bacteria para adaptarse al ambiente. Luego, sería importante valorar
objetivamente los cambios aromáticos y gustativos según las cepas bacterianas utilizadas y
variedades de vid.
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¿En qué momento debe agregarse un fermento maloláctico?
El agregado de fermentos aporta una población de O. oeni del orden de 5*106 a 107 UFC/mL, este es
un número de bacterias suficiente para degradar el ácido málico si las células permanecen viables. La
reacción maloláctica es independiente del crecimiento. Una célula bacteriana de O. oeni, aunque
esté en un medio que prohíba su crecimiento, continúa la transformación del ácido málico. Al pH del
vino, el ácido pasa al interior de célula, donde la enzima asegura la reacción maloláctica. Las únicas
condiciones para la actividad es que la célula conserve su sistema de membranas intacto, aislar el
sistema enzimático del ambiente, mantener el pH cercano al óptimo y asegurar la presencia de
coenzimas indispensables. La integridad de la membrana está estrictamente correlacionada a la
viabilidad celular, esto habla del costo de que una sola célula viable esté activa. Por consiguiente, un
fermento maloláctico es eficaz si las células conservan su viabilidad. La concentración de inóculo
suficiente para asegurar la FML es la misma que si la levadura no se multiplica más pero sobrevive.
Sembrado en vino, O. oeni metaboliza un número importante de substratos; el ácido málico no es solo
el único. Esta transformación que genera la energía « transmembrana » participa de la vida de la
célula. Esto es fácil si el substrato es abundante. El ácido cítrico también es una fuente de energía.
Pero entre todos los substratos, los azúcares no transformados por las levaduras son los más
energéticos. Se trata de glucosa, fructosa y pentosas presentes en cientos de mg/L, hasta más de
1g/L en un vino « seco ». La ruta metabólica utilizada por O. oeni (y de otras bacterias del vino) es la
fermentación heteroláctica cuyo efecto principal es la producción de ácido acético. Por esta razón es
importante no agregar los fermentos malolácticos después de que la fermentación alcohólica ha
terminado.
El uso de fermentos consiste en agregar bacterias, en grandes cantidades, bacterias cuya primer
actividad es la de metabolizar todos los substratos de los que pueden tomar la energía necesaria.
Antes de que la fermentación alcohólica termine, los azúcares serán fermentados y el ácido málico
descarboxilado. Si el número de generaciones que desarrollan se limitara, la cantidad de azucares
fermentados también lo sería. Uno puede observar entonces que todo el ácido málico se degrada sin
un aumento excesivo del ácido acético. Pero esta situación no es completamente controlable. El
equilibrio más conveniente de obtener depende de un número importante de factores en los que el
enólogo no tiene ninguna toma de decisión. Los inconvenientes se presentan porque la población
bacteriana alcanza una concentración muy elevada (> 108 UFC/mL). El ácido málico se degrada pero
los daño y perjuicios son importantes: detenimiento de la fermentación alcohólica por eliminación de
la población de levadura en fase de declive, y el aumento de acidez volátil. Uno puede esperar esto
en los vinos de pH favorable donde el inóculo se multiplica a partir de los azúcares, pero también
puede ser el caso de vinos más ácidos. De hecho, la fermentación maloláctica no sólo se liga al pH
sino que integra otros factores cuyos límites son interdependientes y que no son posibles de
modificar.
Muchas pruebas describen el éxito del agregado de fermentos en los diferentes estadios de la
fermentación alcohólica. Ellas demuestran la competencia de levaduras y bacterias por los azúcares y
la viabilidad que podría ser compatible con la calidad del vino. Pero el equilibrio es demasiado frágil,
incluso para el par levaduras/bacterias descrito cómo óptimo, y completamente imprevisible, porque
todos los datos del sistema en interacción no pueden ser conocidos para cada vino. La ausencia de
inconvenientes en los casos experimentales descritos permite realmente no aconsejar esta práctica;
el costo de los riesgos no lo justifican. Por último, se debe señalar que existen pocas pruebas sobre
usos de fermentos al inicio de la vinificación, serán combinaciones de la verificación de la identidad de
las cepas bacterianas responsables de las FML , es decir del agregado o implantado del fermento.
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Verificación de implantación de un fermento maloláctico
A : fermento
B et C : fermento bien implantado
D, E F : microflora indígena dominante
¿En conclusión?
Los fermentos malolácticos disponibles son muy eficaces. La industria ha adquirido conocimientos,
desde luego empíricos, pero reales para la preparación de estas biomasas. No hay razón para
arriesgarse a una picadura láctica mientras se inoculen los vinos precozmente. Por otra parte, jamás
ha sido correctamente demostrado que un vino verdaderamente "resistente” a la FML es más fácil de
vinificar por el agregado de fermentos durante la fermentación alcohólica.
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