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TIPIFICACIÓN
MOLECULAR
TIPIFICACION MOLECULAR
APLICACIONES GENERALES
TIPIFICACIÓN MOLECULAR
Son todas iguales?
Para que diferenciarlas?
APLICACION EN MICROBIOLOGIA CLINICA Y EPIDEMIOLOGIA
• Confirmación de brotes
• Determinación de reinfección o recidiva en un paciente
• Diseminación intra- e inter-hospitalaria de clones
• Caracterización de Enfermedades Transmitidas por Alimentos
• Vigilancia epidemiológica de clones geográfica y
temporalmente
TECNICAS DE TIPIFICACION
Fenotípicas
basadas en el análisis de las características expresadas por el
microorganismo
Genotípicas
basadas en el análisis del ADN cromosomal ó
extracromosomal
TECNICAS FENOTIPICAS
Biotipificación.
Serotipificación.
Fagotipificación.
Perfil de resistencia a los antimicrobianos.
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de proteínas.
Inmunoblotting.
Multilocus enzimo electroforesis (MLEE).
TECNICAS FENOTIPICAS
VENTAJAS
Fácil realización
Bajo costo
DESVENTAJAS
Dependen de la expresión fenotípica de las características analizadas
Bajo poder discriminatorio
TECNICAS DE TIPIFICACION MOLECULAR
- RAPD
- REP-PCR
PCR
- ERIC-PCR
- BOX-PCR
PCR-RFLP
RFLP-Hibridación
VNTR / MLVA
PFGE
AFLP
MLST
Cambios genéticos en
un corto período de
tiempo
Cambios genéticos en
período de tiempo largo
TECNICAS GENOTIPICAS
VENTAJAS
No dependen de la expresión fenotípica de las características analizadas
Alto poder discriminatorio
DESVENTAJAS
Mayor complejidad
Alto costo
CRITERIOS PARA EVALUAR TECNICAS DE TIPIFICACION
Tipeabilidad
Capacidad de obtener un resultado positivo para cada aislamiento analizado
Reproducibilidad
Capacidad de brindar el mismo resultado al repetir el ensayo
Poder discriminatorio
Capacidad de diferenciar aislamientos no relacionados
PERFIL PLASMIDICO
POLIMORFISMO DE LOS
FRAGMENTOS DE
RESTRICCION (RFLP)
DE PLASMIDOS
RFLP de ADN CROMOSOMICO
Enzimas de corte frecuente
Se generan fragmentos chicos
Enzima de corte poco frecuente
Se generan fragmentos grandes
MACRORESTRICCION
RFLP
e hibridación con sondas
PFGE
POLIMORFISMO DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION
(RFLP) DE ADN CROMOSOMICO
E HIBRIDACION CON SONDAS
TIPIFICACION MOLECULAR BASADA EN PCR
PCR Inespecífica
PCR Específica
RAPD
Oligonucleótidos con
secuencia específica
Hexanucleótidos de
secuencia al azar
Consideraciones:
Reproducibilidad
Poder discriminatorio
Costo
REP-PCR
BOX-PCR
ERIC-PCR
POLIMORFISMO DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION
DE PRODUCTOS DE PCR (PCR-RFLP)
Gen, genes o regiones
específicas del cromosoma
bacteriano
PCR con primer
específicos
Digestión del fragmento
con Enzima de Restricción
Enterococci, S. aureus,
Salmonella, Campylobacter, E.
coli, Shigella spp., Burkholderia,
Haemophilus, etc.
Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs)
Multiple-Locus Variant-repeat Analysis (MLVA)
VNTR (18bp) Shigella
1 Repetición
CACGAACATCATCAAGAC
2 Repeticiones
CACGAACATCATCAAGAC CACGAACATCATCAAGAC
1
2 Ladder
SDS-PAGE
Enzima de restricción
AA
AA
AA
AA
AA
Ligación con adaptadores
PCR con
primers
específicos
PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)
Digestión
enzimática
Bacterias en
agarosa
Lisis
bacteriana
PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)
PFGE: Pasos Principales (1)
Suspensión
bacteriana de
DO
determinada
Armado de los
“plugs”
Lisis de los
“plugs”
Conservación
Lavados
PFGE: Pasos Principales (2)
Restricción
enzimática
Armado del gel
Corte de una
porción del
“plug”
Corrida
Electroforética
Fotografía del
gel
Análisis
Elección de Enzima de Restricción
para Genomas Bacterianos
Tamaño aprox. de los
fragmentos de restricción (kb)
Enzima
Sitio de
Reconocimiento
<40%GC
50%GC
>60%GC
NotI
GCGGCCGC
>1000
200
<20
SmaI
CCCGGG
>50
<20
<20
SpeI
ACTAGT
<20
100
100
XbaI
TCTAGA
<20
100
100
Birren B. and Lai E. “Pulsed Field Gel Electrophoresis: A practical guide”. 1993
<40% GC  Staphylococcus aureus (34%)
50% GC Escherichia coli (50%)
>60% GC Rhodobacter capsulatus (66%)
Elecci
ón de
ón
Elección
de Enzima
Enzima de
de Restricci
Restricción
para
para Genomas
Genomas Bacterianos
Bacterianos
SmaI
Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus pneumoniae,
Campylobacter spp., Acinetobacter baumanii, etc.
XbaI
Escherichia coli, Salmonella spp, Shigella spp., Enterobacter spp.,
Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, etc.
ApaI
Acinetobacter baumanii, Enterococcus gallinarum, Listeria
monocytogenes.
SpeI
Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Escherichia coli,
Salmonella spp., Shigella spp.,etc
NotI
Vibrio cholerae, Bacteroides app., Legionella pneumophila,
Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis.
SfiI
Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Proteus mirabilis.
Elección de Enzima de Restricción
1 -2
para Genomas Bacterianos
Restricción de A. baumanii:
1_ M1842 (SmaI)
2_ COS23A (SmaI)
3_ Lambda Ladder
4_ M1842 (ApaI)
5_ COS23A (ApaI)
SmaI CCCGGG
ApaI GGGCCC
Servicio Antimicrobianos – INEI-ANLIS “Dr. C. Malbrán”
-3 - 4- 5
Elección de Enzima de Restricción
para Genomas Bacterianos
E. faecium
Restricción de
Enterococcus spp.
con SmaI
Servicio Antimicrobianos –
INEI-ANLIS “Dr. C. Malbrán”
E. faecalis
E. gallinarum
Elección de Enzima de
Restricción
para Genomas
Bacterianos
Restricción de
E. gallinarum con distintas
enzimas de restricción.
Servicio Antimicrobianos – INEI-ANLIS “Dr.
C. Malbrán”
SmaI
ApaI
PFGE: Criterio de interpretación
Clon
Subtipo clonal
B
A
A
A
A1
A2
A3
Ausencia sitio
restricción
Presencia sitio
restricción
Adquisición de
elemento extra
(plasmido,
transposon, fago)
No
relacionado
Genéticamente
relacionados
PFGE: Criterio de interpretación
Punto de corte para definir aislamientos relacionados.
- Hasta 3 bandas de diferencia:
Brote en una sala en un período hasta 3 meses.
- Hasta 6 bandas de diferencia:
Aislamientos de distintos hospitales, distintas regiones
geográficas, distintos períodos de tiempo.
- Más de 6 bandas de diferencia:
No aplicable. No relacionados.
• Generalidad, hay excepciones.
METODOS DE
TIPIFICACION MOLECULAR
EPIDEMIOLOGIA
LOCAL :
PFGE
EPIDEMIOLOGIA
GLOBAL :
MLST
MLST
FUNDAMENTO
MultiLocus Sequence Typing
- Secuencia de fragmentos de aprox. 450 bp de 7 genes
house-keeping
- La combinación de alelos en los 7 locus genera una
“Secuence Type” o “ST”
- La ST puede compararse via Internet, con base de
datos mundial
VENTAJAS
- Altamente discriminatorio
- Información portátil, intercambiable entre laboratorios
- Permite acceder vía su pag. web a la data base por
especie y a su expansión
- Intercambio
Internet
de datos de tipificación molecular vía
MLST
MultiLocus Sequence Typing
DNA CROMOSOMICO
Secuenciación de 7
genes conservados
TTGCGCCAGCATTGC
TTTCGCCAGCATTGC
TTTCGCCAGAATTGC
TTTCGCCAGATTTGC
alelo 1
alelo 2
alelo 3
alelo 4
Asignación del número de alelo a cada
gen analizado
Comparación secuencias
con alelos conocidos
http://www.mlst.net
Patron de 7 alelos  ST
Comparación de ST de cada aislamiento
con la base de datos central
MLST
MultiLocus Sequence Typing
Poder discriminatorio (Evolución)
100% Reproducibilidad
100% Comparación entre laboratorios
Alto costo
(secuenciación > 3 Kb / aislamiento)
MLST: 7 LOCUS S. PNEUMONIAE
PROTEIN (gene)
PRIMER
shikimate dehydrogenase (aroE)
aroE-up
aroE-dn
glucose-6-phosphate dehydrogenase (gdh)
gdh-up
gdh-dn
glucose kinase (gki)
gki-up
gki-dn
Transketolase (recP)
recP-up
recP-dn
signal peptidase (spi)
spi-up
spi-dn
xanthine phosphoribosyltransferase (xpt)
xpt-up
xpt-dn
D-alanine-D-alanine ligase (ddl)
ddl-up
ddl-dn
S. PNEUMONIAE MLST:
ALLELIC PROFILE FOR CONTROL STRAINS
Clone
Spain23F-1
Spain6B-2
Spain9V-3
Tennesee23F-4
Spain14-5
Hungary19A-6
South Africa19A-7
South Africa6B-8
England14-9
CSR14-10
CSR19A-11
Finland 6B-12
South Africa19A-1
Taiwan19F-14
Taiwan23F-15
Poland23F-16
Allelic Profile
aroE
gdh
gki
recP
spi
xpt
ddl
4
5
7
1
1
7
2
7
1
1
7
5
1
15
15
7
4
6
11
8
5
13
13
22
5
5
5
6
8
16
29
13
2
1
10
6
4
42
8
1
4
4
4
43
9
19
4
8
4
2
1
2
11
6
25
2
5
1
26
2
5
15
21
1
4
6
6
6
9
1
25
5
5
5
10
6
11
6
30
10
1
3
8
4
3
6
6
1
1
3
3
1
1
20
1
6
1
4
1
6
16
56
8
14
8
3
55
28
12
26
14
36
1
5
4
5
5
1
8
Técnicas Genotípicas de Tipificación Molecular
RAPD
PFGE
MLST
???
???