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Enero‐Marzo de 2012 Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR ¿Es Legiofast ENVIRON® el mejor kit del mercado para
detectar Legionella pneumophila por PCR?
que proviene ese material genético. Reciente“...la detección por Introducción Legionella es un bacilo aeróbico, gramnegativo, mente, no obstante, se han publicado trabajos
PCR a tiempo real con flagelación polar, cuyo hábitat primario son que demuestran que la persistencia temporal
es un excelente
las aguas dulces. Soporta un rango de tempera- de este material una vez muerta la bacteria es
indicador no sola- turas amplio y su crecimiento se ve favorecido realmente muy baja. Por tanto, la detección por
por la presencia de materia orgánica. Se repro- PCR a tiempo real es un excelente indicador no
mente de la preduce en unas vacuolas especiales llamadas solamente de la presencia de Legionella, sino
sencia de Legione- fagosomas, presentes en amebas. Una vez en el también -gracias a su uso cuantitativo-- de su
pulmón es capaz de invadir, y por tanto evadir, nivel de carga.
lla, sino también
macrófagos y reproducirse en su interior
de su nivel de car- los
también en vacuolas modificadas por genes de ¿Cuál es el fundamento científico de los ga.”
patogenicidad presentes en Legionella.
kits de Microbial? En la actualidad se conocen 48 especies del
género Legionella la más importante de las
cuales es, por sus implicaciones clínicas, Legionella pneumophila, que produce la llamada
“Enfermedad del legionario” o legionelosis. La
infección por Legionella puede presentarse
como neumonía típica o como una enfermedad
febril sin focalización pulmonar denominada
Fiebre de Pontiac.
”Legiofast, meControl de la legionelosis diante el uso de
La mayor fuente de contagio es la red de distridianas genéticas
bución de aguas de grandes edificios, hoteles y
estables, asegura la hospitales, la humidificadoras, las maquinas de
los SPA's y las fuentes de agua termal.
detección de cual- rocío,
Los sistemas de aire acondicionado no son una
quier cepa y cuafuente relevante de Legionella, aunque sí parequier serogrupo de cen serlo las torres de refrigeración de las grandes instalaciones. Las normas higiénicoLegionella pneusanitarias para la prevención y control de la
mophila, principal legionelosis están recogidas en la legislación
causante de la ma- mediante sendos Reales Decretos: el 865/2003,
yoría de las infec- de 4 de julio, y el 352/2004, de 27 de julio.
ciones ”
Detección de Legionella ”El límite de detección está por
debajo de las 100
genomas o unidades bacterianas por
litro”
Por su parte, la detección de Legionella está
regulada por la norma ISO11731 se ha basado
tradicionalmente en el cultivo en placa de un
medio selectivo con carbón activo llamado
BCYE. La detección rápida de Legionella, no
está recogida en ningún documento de normalización todavía y su aplicación como método
alternativo choca con la necesidad de dar el
resultado en número de viables. Como es sabido, la PCR detecta ADN, de manera que no es
posible aseverar la viabilidad del organismo del
‐ 1 ‐ Diseñar y producir un buen kit para detectar un
patógeno por PCR es una tarea difícil cuya mayor complejidad radica en la definición del gen
diana, es decir contra qué secuencias de ADN
presentes en el genoma de la bacteria a identificar, vamos a dirigir nuestras sondas. El genoma
de Legionella pneumophila consta de 3,5 millones de pares de bases englobadas en unos 3200
genes, cuyas secuencias presentan distintos
grados de conservación entre los diferentes
aislados. En Microbial, nos hemos caracterizado por aplicar una idea distinta al desarrollo de
kits para la detección de patógenos por PCR.
Las compañías competidoras, tanto las del
campo de la analítica convencional como las de
la producción de hardware para PCR ofrecen
soluciones basadas en la utilización de genes
diana y de primers y sondas de primera generación: invA para Salmonella, hlyA para Listeria
y mip o dotA para Legionella. El análisis de la
idoneidad de estos dos últimos genes diana
para la detección de Legionella revela serios
problemas que los usuarios presentes y futuros
de esta técnica deberían conocer. El más grave
sea quizás la falta de conservación del gen entre
las diferentes cepas de Legionella justo en las
zonas de hibridación con los oligonucleótidos.
Recordemos que éstos últimos (primers i sondas) son de secuencia fija, por lo que el buen
funcionamiento de los mismos requiere la misma invariabilidad en el gen diana y no es siempre es así. El ejemplo más claro lo ofrece la
diana dotA. Los sistemas de PCR existentes en
el mercado que se basan en la detección de este
gen utilizan primers y sondas contra regiones
altamente variables de este gen (figura 1). La
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Figura 1.‐ Secuencias del gen dotA de diferentes serogrupos de Legionella pneumophila. Las zonas más claras indican posiciones donde el nucleótido (A,T, G o C) varía según la cepa falta de regulación sobre estos productos permite que se pue- dan ofrecer en el mercado kits supuestamente específicos,
pero con una inclusividad que dista mucho de ser la deseable.
Ventajas del uso de Legiofast environ® En cambio, Legiofast, mediante el uso de dianas genéticas
estables, asegura la detección de cualquier cepa y cualquier
El kit de rt-PCR Legiofast environ® ofrece múltiples ventajas
serogrupo de Legionella pneumophila, sino también que el
frente los kits para la detección de Legionella pneumophila
nivel de detección sea de los mejores del mercado, un aspecto
disponibles actualmente en el mercado
muy tenido en cuenta para la acreditación de cualquier laboratorio.
¿Qué usos tiene Legiofast environ®? Algunos laboratorios han empezado a usar Legiofast environ® para realizar screening de sus muestras. Las muestras
que dan positivo por rt-PCR para L. pneumophila suelen contener Legionella en concentraciones detectables por el método ISO, mientras que las que no contienen esta bacteria dan
negativo. Considerando que el límite de amplificación de Legiofast está entre 1 y 10 genomas por reacción y que cada reacción puede llegar a admitir hasta 5 ul de extracto, el límite de
detección está por debajo de las 100 genomas o unidades
bacterianas por litro. Esto ha permitido a algunos laboratorios
utilizar Legiofast environ® como método alternativo para el
despistaje de muestras, en sustitución del polémico
“pooling” (combinación de varias muestras en una sola hasta
conseguir un volumen de 1L).
Tabla 1. Principales ventajas del nuevo kit Legiofast environ® Parametro
Característica diferencial
Diana génética
Diana genética estable, invariable. . Patente: PCT/EP2006/068592
Primers
Uso de un juego de 3 “primers” para una reacción de “nested” PCR
Limite de detección
1‐10 unidades genómicas/reacción
< 100 unidades genómicas/litro
Volumen extracto
1‐5 µl/reacción
Resultados
‐Negativos : Ausencia de L. pneumophila
‐Positivos : Presencia y carga de L. pneumophila*
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