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Fase fermentativa de la germinación de las semillas
García Trenchard, Rebecca, Gutiérrez Merino, María Luisa y Valenzuela
Naveda, Myriam.
Fisiología Vegetal, Grupo A
Introducción
Los gases son fuertes determinantes de la germinación de semillas, siendo
indispensable un intercambio entre oxígeno y dióxido de carbono para iniciar el
proceso de germinación. De forma general, mencionaremos que altas concentraciones
de oxígeno favorecen la germinación.
Para que una semilla germine, el embrión necesita una cierta disponibilidad de
oxígeno en el medio. Este oxígeno es empleado por el embrión para llevar a cabo la
respiración, que se puede dividir en cuatro fases:
-
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Fase I: La semilla se comienza a hidratar y comienza la respiración
Fase II: Comienza la glucolisis, y con ella la fermentación láctica y alcohólica,
provocando un aumento en la producción de CO2. Esta fase es de respiración
anaerobia, todavía independiente del O2.
Fase III: La glucolisis aumenta enormemente, y comienza el ciclo de Krebs y la
cadena de transporte de electrones mitocondrial. Esta es la fase de respiración
aerobia, es decir, dependiente de O2.
Fase IV: Desciende la respiración y envejecen los cotiledones.
Las semillas de la mayoría de las plantas superiores son incapaces de germinar bajo
condiciones anaeróbicas porque la ausencia de oxígeno impide llevar a cabo la tercera
fase de la respiración. En ese momento, la anaerobiosis inhibe la germinación de la
semilla.
No obstante, algunas especies son capaces de germinar en ausencia de oxígeno o
con bajas concentraciones de dicho gas. Una de las
especies más estudiadas es Oryza sativa, porque es
un claro ejemplo de las especies que pueden soportar
la escasez o ausencia de oxígeno que se da en los
terrenos encharcados o sumergidos donde se suelen
cultivar.
Las semillas se pueden agrupar en distintas clases,
basándose en la manera en que responden a la
disponibilidad de oxígeno. Las semillas ricas en
hidratos de carbono han resultado ser, en general,
especialmente tolerantes a la anaerobiosis porque son
capaces de mantener un metabolismo de alta energía
aunque haya deficiencia de oxígeno, como se verá a continuación. Sin embargo, las
semillas ricas en lípidos, tienen menos capacidad de soportar estas condiciones.
Además el comportamiento de las plantas ante estas condiciones de anaerobiosis
puede variar interespecíficamente. Mientras que unas condiciones de baja
concentración de oxigeno afectan negativamente al crecimiento de la avena y la
cebada, que comienza con la emersión de la raíz, el arroz de comporta de forma
diferente. En el arroz, cuando germina la semilla en condiciones anaerobias, se
produce un crecimiento acelerado de los coleoptilos que pueden llegar a crecer más
que los coleoptilos durante la germinación aerobia. Además, la raíz y las hojas
primarias dejan de crecer.
Esto ocurre así para incrementar la probabilidad de que el coleoptilo tome contacto
con la superficie del agua que tendrá mayor cantidad de oxígeno y difundirá
internamente hasta la raíz y el endospermo. Como se ha mencionado con anterioridad, Oryza sativa es una de las pocas especies
de plantas que puede tolerar la inmersión prolongada gracias a una serie de
mecanismos adaptativos. Estos mecanismos adaptativos incluyen la habilidad de
elongar los coleoptilos sumergidos con gran rapidez, para que entren en contacto con
la superficie y así recuperen la disponibilidad de oxígeno. Además desarrollan un tejido
aerenquimático que permite un transporte interno del oxígeno muy eficiente, desde el
coleoptilo re-emergido hasta las partes sumergidas como son la raíz o el endospermo
del grano.
Elongación del coleoptilo bajo condiciones de anoxia
Se han propuesto diversas hipótesis para explicar el crecimiento acelerado de los
coleoptilos de arroz en anaerobiosis. Se sabe que en
general, hay una correlación negativa entre la
elongación del coleoptilo bajo agua y la capacidad de
supervivencia de las plantas. Esto es porque el coste
metabólico del crecimiento acelerado compite con los
procesos de mantenimiento de las células por la energía
disponible.
No obstante, la planta toma la precaución de no formar
raíces ni hojas durante este proceso, para que la
energía disponible sea utilizada para el crecimiento de
los coleoptilos. Mattana propuso un factor de transcripción Mybleu como
promotor del crecimiento del coleoptilo y acelerador del
metabolismo fermentativo en coleoptilos en anoxia. La
capacidad del coleoptilo de arroz de crecer
aceleradamente se podría deber a una sustitución de las divisiones celulares por
expansiones celulares, que implican procesos que requieren menos energía que la
síntesis de proteínas. El modelo de Cosgrove para explicar la extensión de la pared
celular implica unas proteínas de pared llamadas expansinas que rompen los puentes
de hidrogeno que unen celulosa y hemicelulosa. La actividad de estas expansinas se
ve favorecida por la acidificación del apoplasma, que en tejidos anóxicos podría
deberse a la actividad de una ATPasa estimulada por putrescina. EXPA7 y EXPB12
son dos expansinas que podrían estar involucradas en el proceso de elongación
porque se ha estudiado su expresión con microarrays y los resultados indican que esta
relación es cierta.
Metabolismo fermentativo
La elongación de los coleoptilos para poder alcanzar la superficie, supone un
importante gasto energético. No obstante, el metabolismo de estas estructuras debe
adaptarse a la ausencia de oxígeno, para poder obtener suficiente ATP para su
crecimiento.
Cuando el oxígeno es limitado, la respiración mitocondrial se ve afectada
negativamente, y el NADH por la vía glicolítica se vuelve a oxidar por la vía
fermentativa produciendo principalmente lactato y etanol.
La fermentación láctica consiste en la reducción de piruvato en ácido láctico para
oxidar NADH, que pasará a ser NAD+. El lactato se produce principalmente por acción
de la lactato deshidrogenasa (LDH).
La fermentación alcohólica consiste en primer lugar en la transformación de piruvato
en acetaldehído por un proceso de descarboxilación facilitado por la enzima piruvato
descarboxilasa (PDC). A continuación el acetaldehído es reducido a etanol por la
enzima alcohol deshidrogenasa (ADH). Estar reducción facilita la oxidación de NADH
en NAD+.
La enzima piruvato descarboxilasa no consume O2, sin embargo produce CO2 que se
añadirá al sumatorio producido por la vía aerobia.
No obstante las vías fermentativas solamente rinden dos moléculas de ATP, mientras
que la vía aerobia rinde hasta 38 moléculas de ATP. Por esta razón, en condiciones de
anoxia e hipoxia, la síntesis de proteínas se centra principalmente en la producción de
esas enzimas necesarias para el metabolismo de carbohidratos y la vía fermentativa,
por ejemplo la ADH y la LDH.
Experimento: Importancia relativa de la fermentacion alcohólica la fermentacion láctica
Es evidente que en condiciones de anaerobiosis, la vía fermentativa es imprescindible
para la germinación de la semilla. No obstante, se ha tratado de determinar la
importancia relativa de cada uno de estos tipos de fermentación.
Se midió la concentración de lactato en coleoptilos de Oryza sativa, en condiciones de
oxigeno normales y posteriormente en coleoptilos en condiciones deficitarias de
oxigeno. El estrés anóxico no incrementó significativamente la concentración de
lactato en los coleoptilos, por lo que se determinó que la actividad de la enzima lactato
deshidrogenasa no tiene una importancia muy significativa para la tolerancia a la
anoxia.
A continuación se determinó la concentración de etanol en coleoptilos germinados en
aerobiosis y anaerobiosis. La concentración de etanol aumentó considerablemente en
los coleoptilos germinados en ausencia de oxígeno, respecto a los que habían
germinado en condiciones normales. Este resultado sugiere que las enzimas alcohol
deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa son imprescindibles para la germinación
fermentativa.
Este hecho se corroboró con otro experimento basado en mutantes deficientes para la
alcohol deshidrogenasa. Sin embargo, la relación entre la intensidad de la actividad de
la ADH y la tolerancia a la anoxia resulta polémica.
Experimento con mutantes deficientes para la enzima ADH
En un estudio con coleoptilos de arroz en condiciones de
hipoxia, aproximadamente el 92% del flujo de carbono
desde piruvato fue a etanol, 7% se destinó a la alanina y
el 1% se destinó a lactato, lo que sugiere que la
fermentación alcohólica es una fuente más importante de
NAD+.
Para comprobar si la fermentación alcohólica era esencial
para el crecimiento de coleoptilos de arroz en condiciones
anaerobias, se realizo un experimento con 2 cepas de
arroz: WT (wild type) y rad (reduced adh activity). Se
observó que la reducción de la actividad de la ADH,
disminuye la velocidad del crecimiento de los coleoptilos
sumergidos.
En la germinación de semillas totalmente sumergidas, los coleoptilos WT crecen en 57 días 51.2-67.4 mm, mientras que coleoptilos rad solo 15.4  8.9 mm en 7 días. La
cantidad de ATP en rad era solo el 37% de WT después del primer día, por eso se
piensa que crece más despacio.
Cuando se producía la germinación en condiciones aerobias y luego se sumergían los
coleoptilos, los coleoptilos WT y rad habían elongado por igual al cabo de 2 días.
En condiciones anaerobias juega un papel fundamental la ADH ya que por medio de
este experimento se comprobó que los
coleoptilos de cepas salvajes se elongaban
más que los coleoptilos mutantes
deficientes en ADH.
Aunque la fermentación alcohólica
sea esencial para este proceso, un exceso
de actividad puede resultar perjudicial para
la célula. En el caso del arroz, una elevada
producción de etanol aumenta la tolerancia
a la anoxia, sin embargo en otras especias
como el algodón o el tabaco, el efecto de la
ADH es la de disminuir aún más la
tolerancia a bajas concentraciones de O2. No obstante, la producción de etanol en los
coleoptilos de arroz es mayor que la de los cereales intolerantes a la anoxia, por lo que
se cree que la toxicidad del etanol no es la principal causa de la sensibilidad de estas
plantas a la anoxia.
Experimento para comparar el efecto de la anoxia en tres especies diferentes
Se realizó un experimento para determinar el efecto de la anoxia en tres tipos de
cereales: arroz, cebada y avena. Dicho experimento se basó en los parámetros de
elongación del coleoptilo, concentración de etanol y azúcares solubles, y actividad de
alcohol deshidrogenasa y α-amilasa. El valor de estos parámetros se determinó bajo
condiciones de estrés anóxico tras un proceso de germinación en condiciones
aeróbicas.

Crecimiento de los coleoptilos
La elongación de los coleoptilos de las tres especies, respecto a los coleoptilos control
fue de 29% en el caso de la cebada, 25% en el caso de la avena y 71% en el caso del
arroz. Por lo tanto, los coleoptilos de arroz son más tolerantes a la anoxia que las otras
dos especies.

Concentración de ATP
El estrés anóxico redujo las concentraciones de ATP en todos los coleoptilos. La
concentración en los coleoptilos, respecto a los coleoptilos control en cebada, avena y
arroz fueron de 21%, 18% y 57% respectivamente. Por lo tanto, el arroz mantiene los
niveles de ATP en sus coleoptilos con mayor eficacia que la avena y la cebada.
-
Actividad de Alcohol deshidrogenasa y producción de etanol
El estrés anóxico aumentó la actividad de la
enzima alcohol deshidrogenasa en todos los
coleoptilos.
La actividad de la ADH en coleoptilos
anóxicos de cebada, avena y arroz,
respectivamente, fue 9,3, 8,5 y 26 veces
mayor que en los controles. Esto además
significa que la concentración de etanol
también aumenta bajo dichas condiciones,
sin embargo, el aumento de la concentración
de etanol en la coleoptilos de arroz era 3,3 y 3,5 veces mayores que en los coleoptilos
de cebada y de avena, respectivamente. Esto significa que la tasa de fermentación
alcohólica en arroz en condiciones de anoxia es superior a la de las otras dos
especies.
-
Actividad de α-amilasa
La actividad α-amilasa no fue detectada en los coleoptilos de avena, cebada y arroz en
ninguno de los dos casos, ni en los coleoptilos control ni en los anóxicos. Sin embargo,
dicha actividad sí fue encontrada en los endospermos de las tres especies control y
anóxicas. La actividad aumentó en condiciones control durante una incubación de 24
horas, en las tres especies, sin embargo, se vio inhibida con el estrés anoxico. Por lo
tanto, no había diferencias significativas en los coleoptilos anoxicos de las tres
especies.
-
Concentracion de azúcares en coleoptilos y endospermas
El estrés anóxico redujo la concentración de azúcares tanto en coleoptilos como en los
endospermos de arroz, cebada y avena. Los coleoptilos anoxicos de arroz contenían
un 69% de los azucares solubles del coleoptilo control. Los coleoptilos anóxicos de
cebada y avena solo contenían un 9% y un 11% del azúcar contenido en los
coleoptilos control. Sin embargo, las concentraciones de azúcar en los endospermos
de las tres especies en anoxia, no eran significativamente diferentes.
Conclusión:
El dato más importante obtenido a partir de este experimento se refiere a las
concentraciones de azúcares en distintas partes de la semilla que está germinando.
La concentración de azúcares solubles en los coleoptilos de arroz anóxicos era
superior a la de los coleoptilos de avena o cebada. No obstante, α-amilasa, que
cataboliza las reservas de hidratos de carbono para convertirlos en azucares solubles,
estaba activa en el endospermo de avena, cebada y arroz anóxicos en cantidades muy
similares. Por lo tanto, el efecto del estrés anóxico debe ser necesariamente una
reducción en la eficacia del transporte de los azúcares del endospermo a los
coleoptilos. Esta eficacia se ve afectada negativamente más en las plantas de avena y
cebada que en las de arroz.
Como la disponibilidad de azúcar es esencial para llevar a cabo la glicolisis y la
fermentación en las células, la habilidad de transportar los azucares del endospermo a
los coleoptilos puede ser una de las maneras de distinguir la tolerancia o intolerancia
de las plantas a las condiciones de anoxia.
Regulación del pH y acidificación del citoplasma
Otro factor importante para la estrategia que confiere tolerancia a la anoxia en plantas
es el control del pH citoplasmático.
En condiciones de anaerobiosis, el pH citoplasmático tiende a acidificarse por diversos
procesos que se activan por la ausencia de oxígeno. Al entrar en condiciones de
anaerobiosis, LDH recicla nucleótidos de piridina por fermentación láctica, produciendo
lactato y como consecuencia, acidificando el citoplasma.
Algunos autores sugieren además, que la acidificación del medio no ocurre
directamente por la producción de lactato, sino por los protones liberados que
acompañan a la liberación de Pi de los NTP. Este proceso se ha observado
inmediatamente después de que las plantas se pongan en anaerobiosis.
Otra posible causa de la acidificación del citoplasma puede ser la liberación de
protones de las vacuolas. En condiciones de hipoxia, el pH vacuolar aumenta al mismo
tiempo que el pH citoplasmático disminuye. El transporte activo de protones del
citoplasma a las vacuolas es un importante sistema de regulación del pH
citoplasmático. No obstante, la hipoxia afecta negativamente al mantenimiento de este
gradiente de protones provocando una acidificación del citoplasma.
Las distintas capacidades de las plantas para soportar o evitar la acidificación del
citoplasma pueden ser la razón directa que explique las diferencias en su tolerancia a
la hipoxia/anoxia. Por ejemplo, Potamogeton pectinatus elonga los coleoptilos de
manera mucho más rápida que el arroz. Esta característica es coincidente con la
estricta regulación del pH citoplasmático, que apenas sufre de acidificación.
En el caso del arroz, este puede mantener su pH anóxico muy similar al pH aeróbico
durante horas, mientras que otras plantas intolerantes se acidifican después de unas
pocas horas de anoxia.
Se ha sugerido que el consumo de protones causado por la síntesis de ATP por
fermentación alcohólica, lleva a cabo un papel muy importante en la regulación del pH
citoplasmático reduciendo su acidificación. Otra forma de regular este pH es el
aumento de alanina y GABA, que tienen el poder de contrarrestar el efecto de la
acidificación causada por el lactato.
También se ha propuesto una posible función de la reducción de los nitratos como
alternativa para la re-oxidación de NADH y NADPH en condiciones de hipoxia. Esto se
debe a que la nitrato reductasa se activa a pH bajo. Al reducir el nitrato consume
protones elevando así el pH citoplasmático.
Conclusiones
Son pocas las plantas cuyas semillas son capaces de germinar en condiciones de
anaerobiosis, pero aquellas que si están preparadas para realizar este proceso, han
tenido que adquirir diversas adaptaciones.
En el caso concreto de Oryza sativa, el mecanismo se basa en un rápido crecimiento
de los coleoptilos dotados de aerénquima, para alcanzar la superficie con oxígeno.
Gracias al tejido aerénquimático, el oxígeno será transportado de manera eficaz hacia
el resto de estructuras.
La energía para el crecimiento de los coleoptilos se obtiene principalmente a través de
las vías fermentativas, que no requieren oxígeno. No obstante, estos procesos tienen
inconvenientes. En primer lugar, la energía obtenida es muy inferior a la de la vía
aeróbica, por lo que el gasto de ATP debe estar dirigido a actividades muy concretas
como son la síntesis de novo de proteínas necesarias para la germinación.
El segundo inconveniente es que la fermentación produce la acidificación del medio.
Por esta razón las plantas adaptadas a la germinación fermentativa, deben ser
capaces de regular perfectamente el pH del citoplasma.
Los azúcares metabolizados para obtener energía, se encuentran en el endosperma
de la semilla. Para emplear estas moléculas en el crecimiento de los coleoptilos, estas
deben ser trasladadas a dichas estructuras, y cuanto más eficaz sea este proceso de
transporte, más probable será que se realiza la germinación fermentativa.