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Cienc. Tecnol. Mar, 28 (2): 15-25, 2005Aislamiento de bacterias dinoflagicidas
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AISLAMIENTO DE BACTERIAS DINOFLAGICIDAS Y DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA
EVALUAR EL EFECTO DE SUSTANCIAS EN LA ACTIVIDAD BACTERIANA DE FONDO MARINO
ISOLATION OF DINOFLAGICIDAE BACTERIA AND DEVELOPMENT OF AN ASSAY TO EVALUATE THE
EFFECT OF CHEMICALS ON BACTERIAL ACTIVITY FROM THE SEA BOTTOM*
JUANA BUSTAMANTE
JOSÉ LUIS CÓRDOVA*
Fundación Ciencia para la Vida
Av. Maratón 1943, Ñuñoa, Santiago, Chile.
* Dirección Actual: José Córdova PhD Gerente R&D Finbiotec S.A. Los Tres Antonios 2406 Macul, Santiago, Chile.
Fono: (56-2) 315-4864/Fax: (56-2) 358-9843 E-mail: [email protected]
Recepción: 20 de septiembre de 2000 - Versión corregida aceptada: 30 de marzo de 2005.
RESUMEN
Algunas de las bacterias marinas aisladas de las muestras obtenidas durante el crucero CIMAR 3
Fiordos poseen actividad dinoflagicida in vitro para Alexandrium catenella y Protoceratium reticulatum
organismos causantes de Floraciones Algales Nocivas (FANs). Aunque el mecanismo bacteriano mediante
el cual son destruidas no se ha esclarecido, los resultados sugieren su participación en la limitación de la
FAN en un área geográfica determinada. También, las bacterias de fondo marino obtenidas durante este
crucero, permitieron desarrollar un ensayo simple, rápido y económico que permite evaluar el posible
impacto negativo de compuestos químicos con potencial para controlar los quistes de los organismos
causantes de FANs.
Palabras claves: Bacteria dinoflagicida, floración algal.
ABSTRACT
Some marine bacteria isolated from the samples obtained during the CIMAR 3 Fiordos cruise, have
dinoflagicidae activity in vitro for Alexandrium catenella and Protoceratium reticulatum, organisms that
produce Harmful Algal Blooms (HABs). Although the bacterial killing mechanism has not been elucidated,
the results suggest their participation in limiting the HAB blooms within a specific area. Also, using bacteria isolated from the sea bottom during this cruise, had allowed to develop a simple, fast and economic
assay that allows to evaluate the possible negative impact of chemicals with potential use to control cysts
of organisms that produce HABs.
Key words: Dinoflagicidae bacteria, algal bloom.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias marinas son organismos que forman parte del nanoplancton marino que están
involucradas en diferentes procesos biológicos,
siendo quizás el principal de ellos, la transformación de la materia orgánica en el nivel primario.
Además, estudios demuestran la existencia de
bacterias de vida libre capaces de producir toxi*Proyecto CONA-C3F 97-09.
nas del tipo paralizante (Gallasher & Birkbeck,
1992; López et al., 1999; Tamplin, 1990).
Debido al aumento de los Florecimientos
Algales Nocivos (FANs) en el ámbito mundial
(Hallegraeff, 1993), su dispersión en los océanos (Carlton, 1985) y sus efectos en la
marinicultura en todos sus niveles (Córdova, 1999;
ICES, 1992; Rensel, 1995), se está buscando
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alternativas de control para evitar tanto la dispersión de los organismos de FANs (Bolch &
Hallegraeff, 1993) como para su control directo
(Maruyama et al., 1987).
La primera prueba orientada a desarrollar una
estrategia de control químico de las FANs fue el
empleo del sulfato de cobre para eliminar los
florecimientos de Gymnodinium breve en Florida,
Estados Unidos. Si bien este compuesto destruye
al organismo no permite controlar la FAN por la
extensión geográfica que abarcó, pero además se
demostró que el químico empleado tenía efectos
colaterales no deseados, pues afectan mortalmente a otros organismos causando un severo impacto al ambiente marino (Marvin & Proctor, 1966).
Este y otros intentos (Shirota, 1989) fueron realizados para lograr una respuesta a los problemas
ocasionados por las FANs a nivel mundial. Nuevas
investigaciones han permitido identificar posibles
organismos para su empleo en el control biológico
(Córdova, 1997, Córdova et al., 1998; Fritz & Nass,
1992; Furuki & Koboyashi, 1993; Yoshinaga et
al., 1995) o químico de las FANs (Córdova, 1996;
Sawayama et al., 1993).
Evaluación in vitro del efecto dinoflagicida
bacteriano.
Los cultivos de A. catenella cepa chilena
ASACQ-001 y P. reticulatum cepa Reti-1, fueron
incubados en placas de 24 pocillos e incubadas
a 12 oC. Después de 24 horas de iniciado el cocultivo, se agregó en cada uno de los 24 pocillos
de la placa, 20 µl de muestras totales de cada
cultivo bacteriano siguiendo el esquema presentado en la Fig. 1. El efecto dinoflagicida causado
por las bacterias fue analizado a 1 y 24 horas
después de la inoculación mediante una evaluación visual del estado de las células al microscopio invertido. El efecto en la motilidad y la integridad celular fueron los parámetros empleados para
determinar el daño bacteriano a los dinoflagelados.
El porcentaje de mortalidad se expresa
cualitativamente por comparación con respecto de
las células del pocillo control.
Evaluación in vitro del efecto de inhibidores en la
actividad metabólica bacteriana.
Durante la realización del presente proyecto,
fueron analizados dos aspectos: el primero fue la
identificación de bacterias productoras de toxinas
del tipo paralizante (López et al., 1999) y el segundo, la identificación in vitro de bacterias
dinoflagicidas para organismos que causan FANs
en Chile. Las bacterias se obtuvieron de las muestras obtenidas en las dos etapas del Crucero
CIMAR 3 Fiordos realizadas en octubre 1997 y
octubre 1998 entre los paralelos 52o y 56o, y que
crecieron bien en las condiciones de laboratorio.
Estas bacterias fueron evaluadas para determinar
si son capaces de matar in vitro a Alexandrium
catenella y Protoceratium reticulatum , dinoflagelados
asociados al veneno paralizante y yessotoxina, respectivamente. También permitieron desarrollar un
ensayo para evaluar el efecto de químicos en la
actividad metabólica de bacteria de fondo marino y
con potencial de ser empleados en el control
químico de los quistes de los organismos que
producen FANs.
Algunas muestras de bacterias de fondo marino cambian el color amarillento del medio agarZobell a negro a medida que transcurre el tiempo. Basados en esta observación, se empleó la
cepa bacteriana CFB-1 que causa este cambio en
7 días. Diferentes inhibidores metabólicos
(inhibidores de proteasas) de los cuales se tenía
evidencia de que afectan in vitro la viabilidad de A.
catenella (Córdova, 1996), fueron agregados a
cada tubo que contenía agar- Zobell 24 h antes
de ser inoculados con las bacterias empleando
la concentración dinoflagicida (Tabla I). El efecto
de los inhibidores en la viabilidad bacteriana esta
indirectamente evaluada mediante el cambio de
color del medio. Un aumento o bloqueo total o
parcial del color del medio en un tiempo determinado representa cualitativamente un efecto en la
actividad metabólica bacteriana. El análisis se
realizó a los 10 días de incubación permanente.
El resultado de los inhibidores de proteasas se
comparó con la inhibición bacteriana causada por
dos diferentes antibióticos como son la ampicilina
y β-Mciclina.
MATERIAL Y MÉTODOS
RESULTADOS
Obtención, procesamiento y almacenamiento de
bacterias. Las muestras de superficie se obtuvieron
empleando un recipiente limpio y la roseta. Para obtener las muestras de fondo marino o sedimento se
empleó el box-core o el pistón-core. Inmediatamente
después de haber obtenido la muestra, se sembraron 100 µl en un tubo conteniendo 5 ml de agar Zobell
y se mantuvieron a 10 oC.
Efecto dinoflagicida in vitro de bacterias marinas. Para determinar la capacidad dinoflagicida
de las bacterias, éstas aisladas fueron co-cultivadas con A. catenella y P. reticulatum como se
describe en la Fig. 1. La capacidad dinoflagicida
bacteriana se describe en dos rangos: aquellas
cuya letalidad oscila entre el 90-100% (alta, círculos rojos) y entre el 70-89% (intermedia, círculos
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Aislamiento de bacterias dinoflagicidas
Tabla I. Inhibidores metabólicos evaluados en bacterias. Los compuestos que se indican fueron incubados en agar
Zobell 24 h antes de inyectar el inóculo bacteriano. Las concentraciones empleadas son aquellas que causan la muerte del dinoflagelado in vitro y que serían la exposición máxima a la cual las bacterias podrían
estar sometidas y sin considerar el efecto de dilución en el agua mar. La inhibición metabólica inducida por
los inhibidores de proteasas es comparada con la inhibición inducida por antibióticos.
Table I. Metabolic inhibitors tested on bacteria. The listed chemicals were incubated in Zobell agar for 24 h before
the bacteria inoculum was placed in. The used concentrations are lethal for dinoflagellates in vitro, and
represent the maximun concentrations to which the bacteria will be exposed, without considering dilution
effect in sea water. The metabolic inhibition caused by protease inhibitor is similar to that induced by antibiotics.
Inhibidores Metabólicos
r–aminobenzadina–1
r – aminobenzadina–2
Aprotinina
2– deoxi–D– glucosa
Leupeptina
Pepstatina–A
s–Fenantrolina–1
r –Ab1
r –Ab2
Aprot
2–DG
Leu
Peps
1–10phe
Agentes inhibidores Quelantes
EDTA
EGTA
EDTA
EGTA
Antibióticos
Ampicilina
b - Mciclina –1
b -Mciclina–2
Amp
BMC –1
BMC –2
Concentración Final (mM)
500
1600
8
760
215
7
500
Concentración Final (m M)
500
250
Concentración Final (m M)
200
0.1
0.5
2. Cultivo de dinoflagelado
3. Análisis al Microscopio
1. Bacterias
Fig. 1: Ensayo in vitro para detectar bacterias dinoflagicidas. Las células de Alexandrium catenella y Protoceratium
reticulatum fueron cultivadas en placas de 24 pocillos y 24 horas después, fueron co-cultivadas con 20µl de
cultivo bacteriano proveniente de los diferentes puntos de muestreo. La viabilidad de la célula fue determinada por la pérdida del movimiento e integridad celular, lo cual fue monitoreado al microscopio invertido 1 y
24 horas después de iniciarse el co-cultivo.
Fig. 1: In vitro procedure to detect dinoflagicide bacteria. Alexandrium catenella and Protoceratium reticulatum cells
were culture in 24 well plates and 24 h after they were co-culture with 20 µl of bacterial culture obtained from
different geographical sampling points. The cell viability was monitored by cellular integrity and movement,
which was assessed under the microscope 1 and 24 h after initiated the co-culture.
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Revista Ciencia y Tecnología del Mar, Vol. 28 (2) - 2005
Tabla II. Capacidad dinoflagicida de las bacterias marinas. Los cultivos de A. catenella y P. reticulatum fueron
expuestos a los cultivos bacterianos totales aislados durante el crucero CIMAR 3 Fiordos. La colección
realizada durante octubre de 1997 tiene menos bacterias (67% / 71%) que afectan A. catenella comparado
con octubre 1998 (97% / 97%), mientras que en ambos años la letalidad para P. reticulatum se mantiene
alta (89% / 96% y 91% / 97%) tanto en la superficie como en la profundidad.
Table II. Dinoflagicidae capability of marine bacteria. The cultures of A. catenella and P. reticulatum were exposed to
total bacteria cultures isolated during CIMAR 3 Fiordos cruise. The recollection made during October 1997
had less bacterias (67% / 71%) that affect A. catenella compare to October 1998 (97% / 97%). However,
in both years, the letality to P. reticulatum is high (89% / 96% and 91% / 97%) in surface as well as in deep
sea.
Parámetros
Alexandrium Catenella
Protoceratium reticulatum
Crucero CIMAR 3 Fiordos, Etapa I, octubre 1997
Letalidad
Superficie
Profundidad
Superficie
Profundidad
90-100%
13/42
31%
6/28
21%
25/42
60%
23/28
82%
70-89%
15/42
36%
14/28
50%
12/42
29%
4/28
14%
Total
67%
71%
89%
96%
Crucero CIMAR 3 Fiordos, Etapa II, octubre 1998
Letalidad
Superficie
Profundidad
Superficie
Profundidad
90-100%
30/33
91%
29/35
83%
30/33
91%
28/35
80%
70-89%
2/33
6%
5/35
14%
0/33
0%
6/35
17%
Total
97%
anaranjados) y se presentan en las Figs. 2 y 3 para
las bacterias de la I etapa y en las Figs. 4 y 5 para
las bacterias aisladas durante la II etapa del crucero. También se presentan los datos individualizados
para las bacterias obtenidas de muestras de superficie y profundidad (Tabla II). Letalidades menores
no fueron consideradas pero se conservan los registros.
En la Fig. 2A se presenta el origen dinoflagicida
de las bacterias superficiales de alta (31%, 13/
42 sitios) e intermedia (36%, 15/42) letalidad para
A. catenella. Mientras que en la Fig. 2B las bacterias de profundidad con alta (21%, 6/28) e intermedia (50%, 14/28) letalidad. La suma total letal
es de 67% para la superficie y de un 71% para la
profundidad (Tabla II). También se observa que las
bacterias de superficie presentan mayores sitios
de alta letalidad comparado con las de profundidad. En forma similar se describe la letalidad
bacteriana para P. reticulatum en la Fig. 3, donde
se observa que las mismas bacterias tienen un
aumento significativo de letalidad total para este
97%
91%
97%
dinoflagelado 89% para la superficie (Fig. 3A) y 96%
para las de profundidad (Fig. 3B, Tabla II).
Cuando se analizan las muestras bacterianas tomadas de lugares similares durante la etapa II del
crucero, se observa un incremento en la letalidad
total bacteriana para con A. catenella de un 97% tanto para la superficie como para la profundidad (Figs.
4A y 4B, Tabla II). Así mismo, la letalidad para P.
reticulatum aumenta de un 89% a 91% a nivel superficial, y se mantiene alta en la profundidad, de 96% a
97% (Tabla II). Además, se destaca que la letalidad
intermedia para ambas especies disminuye con respecto de la etapa I del crucero, pero claramente hay
un aumento de la letalidad alta (Tabla II), incluso no
se detectó letalidad intermedia en las bacterias
de origen superficial (Fig. 4C).
El efecto dinoflagicida bacteriano se evaluó
en cultivos de Prorocentrum lima, Leptocylindrum
minimun y Pseudonitzchia australis. Sin embargo, la determinación del daño celular (motilidad e
integridad celular) no fue evidente, razón por la
Aislamiento de bacterias dinoflagicidas
19
Fig. 2: Origen geográfico de bacterias dinoflagicidas de A. catenella. Las bacterias dinoflagicidas que causan entre un
90%-100 % de muerte (un círculo magenta), mientras que las bacterias que ocasionan muerte entre un 70%89% (círculo cyan). En la Fig. 2A están las bacterias de origen superficial y las de profundidad en la Fig. 2B. Se
aprecia un mayor número de sitios de superficie con bacterias dinoflagicidas.
Fig. 2: Geographic source of dinoflagicidae bacteria for A. catenella. The dinoflagicidae bacteria that kills between
90-100% (are magenta), while those that cause death between 70-89% (cyan). In the Figure 2A are the
superficial bacteria, while in the Figure 2B those isolated from deep sea. It is observe a more number of
places at surface level with dinoflagicidae bacteria.
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Revista Ciencia y Tecnología del Mar, Vol. 28 (2) - 2005
Fig. 3: Origen geográfico de bacterias dinoflagicidas de P. reticulatum. Las bacterias dinoflagicidas que causan
entre un 90%-100% de muerte están indicadas con un círculo magenta, mientras que las bacterias que
ocasionan muerte entre un 70%-89% con un círculo cyan. En la Fig. 3A están las bacterias de origen superficial y las de profundidad en la Fig. 3B. Se aprecia un número similar de sitios con bacterias dinoflagicidas
tanto en la superficie como en la profundidad.
Fig. 3: Geographic source of dinoflagicidae bacteria for P. reticulatum. The dinoflagicidae bacteria that kills between
90-100% (are magenta), while those that cause death between 70-89% (cyan). In the Figure 3A are the
superficial bacteria, while in the Figure 3B those isolate from deep sea. It is observe a similar number of
places with dinoflagicidae bacteria at surface level as well as in deep sea.
Aislamiento de bacterias dinoflagicidas
21
Fig. 4: Origen geográfico de bacterias dinoflagicidas para A. catenella. Las bacterias dinoflagicidas que causan a las
24 h de co-cultivo entre un 90%-100% de muerte están indicadas con un círculo magenta, mientras que las
bacterias que ocasionan muerte entre un 70%-89% con un círculo cyan. En la Fig. 4A están las bacterias de
origen superficial y las de profundidad en la Fig. 4B. Se observa un mayor número de sitios con bacterias
dinoflagicidas de alta toxicidad en la superficie con respecto de las de profundidad.
Fig. 4: Geographic source of dinoflagicidae bacteria for A. catenella. The dinoflagicidae bacteria that kills between 90100% (magenta), while those that cause death between 70-89% (cyan). In the Figure 4A are the superficial
bacteria, while in the Figure 4B those isolated from deep sea. It is observe a more number of places at
surface level with dinoflagicidae bacteria.
22
Revista Ciencia y Tecnología del Mar, Vol. 28 (2) - 2005
Fig. 5: Origen geográfico de bacterias dinoflagicidas para P. reticulatum. Las bacterias dinoflagicidas que causan a
las 24 h de co-cultivo entre un 90%-100% de muerte, están indicadas con un círculo rojo, mientras que las
bacterias que ocasionan muerte entre un 70%-89% con un círculo anaranjado. En la Fig. 5A están las bacterias de origen superficial y las de profundidad en la Fig. 5B. Sólo se detectaron sitios con bacterias
dinoflagicidas de alta toxicidad en la superficie mientras que en la profundidad se detectó altas e intermedias.
Fig. 5: Geographic source of dinoflagicidae bacteria for P. reticulatum. The dinoflagicidae bacteria that kills between
90-100% (magenta), while those that cause death between 70-89% (cyan). In the Figure 5A are the superficial bacteria, while in the Figure 5B those isolated from deep sea. Only were detected places with dinoflagicidae
bacteria at surface level and not at deep sea.
Aislamiento de bacterias dinoflagicidas
23
Fig. 6. Ensayo para evaluar el efecto de sustancias dinoflagicidas en el metabolismo bacteriano. La actividad
metabólica de bacterias aisladas de fondo marino cambia el color del medio agar de cultivo como se observa
en la Fig. 6A. Este cambio de color del medio puede ser empleado como reportero directo de la actividad
metabólica bacteriana. Así, se puede evaluar el efecto potencial de inhibidores metabólicos que afectan la
viabilidad de los quistes de A. catenella y la actividad eutrófica bacteriana de fondo marino como se observa
en la Fig. 6B: tubos 3, 4 y 5, y en la Fig. 6C: 1', 4', 5' y 6'; también es posible determinar algún efecto
positivo de los compuestos como se observa en la Fig. 6B: 6 y Fig. 6C: 2' y 3'. El efecto citotóxico de los
inhibidores es comparado con la adición de antibióticos (Fig. 6B: 1, 2 y 3). La concentración empleada se
presenta en la Tabla I.
Fig. 6: Assay to evaluate the effect of dinoflagicidae substances over bacterial metabolism. The bacterial metabolic
activity from isolates from the sea bottom can change the color of the agar medium as observed in Figure 6A.
This change the of color could be used as direct reporter of the condition of bacterial metabolic activity.
Therefore, it is possible to evaluate the potential effect of metabolic bloxkers that affect the cysts viability of
A. catenella and the eutrophic bacterial activity as observed in Figure 6B: tubes 3, 4 and 5 and in Figure 6C,
1', 4', 5' and 6'. Also, it is possible to determine a positive effect of some elements as observed in Figure
6B tube 6 and Figure 6C, tubes 2' and 3'. The citotoxic effect of the inhibitors is compared to the addition of
antibiotics (Figure 6B, tubes 1, 2 and 3). The concentration used is presented in Table I.
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cual fueron excluidos del estudio y no se presentan en el presente artículo.
Ensayo in vitro para evaluar efectos en la actividad metabólica bacteriana. Las bacterias de
fondo marino durante su cultivo en agar Zobell
cambian el color amarillento del medio a negro
(Fig. 16 A). Los inhibidores de proteasas (Tabla I)
afectan in vitro la viabilidad de A. catenella y también la actividad metabólica bacteriana de fondo
marino como se observa en la Figs. 6B y 6C. La
aprotinina, EDTA, EGTA, 1-10 fenantrolina,
leupeptina y pepstatina la afectan seriamente. Mientras que la 2-deoxi-glucosa y (ρ-benzamidina no la
afectan y pareciera que la favorecieran. Estos resultados fueron comparados con el efecto de
antibióticos como la ampicilina y β-Mciclina.
DISCUSIÓN
El impacto negativo de las FANs en la salud
humana, la extracción y comercialización de los
mariscos han gatillado el desarrollo de estrategias de control de las FANs, las cuales pueden
agruparse en control biológico y control químico
pero que no son necesariamente excluyentes.
Tanto los organismos o los compuestos químicos
a emplearse en el desarrollo de las estrategias
de control de las FANs requieren de su aislamiento e identificación y de ensayos rápidos que permitan evaluar su efecto en las microalgas FAN
así como en otros organismos marinos.
Los reportes de bacterias o sus productos que
afectan la viabilidad en condiciones de laboratorio a organismos FAN son candidatos para ser
empleados en el desarrollo de estrategias de control biológico. Sin embargo, un inconveniente importante en el desarrollo de este tipo de estrategia, además de determinar la especificidad de la
bacteria dinoflagicida, es la introducción de organismos provenientes de otras latitudes a nuestro
medio marino por desconocer cuál sería el comportamiento de la especie foránea y su impacto en
nuestro ambiente marino. Por lo tanto, es indispensable aislar e identificar bacterias dinoflagicidas presentes en nuestro mar. Ayudados con el ensayo
descrito en la Fig. 1 se pudo aislar bacterias con
capacidad dinoflagicida presentes en los lugares
de muestreos durante las dos etapas del crucero
CIMAR 3 Fiordos como se presentan en las Figs.
2, 3, 4 y 5. Las bacterias que producen la muerte
de A. catenella y P. reticulatum en más de un 70%
en 24 h fueron consideradas como positivas. Actualmente se está purificando el ADN de las bacterias dinoflagicidas rápidas (efecto dinoflagicida en
10 minutos) para su identificación molecular (análi-
sis del gen 16 S ribosomal y el número mínimo de
bacterias que matan así como el mecanismo de
muerte empleado). Es importante mencionar que
durante el año de 1997 la toxicidad de los mariscos
con veneno paralizante bajó en la XII Región y disminuyó más aún en 1998. Este resultado coincide,
aunque no necesariamente debe ser considerado
como causa-efecto directo, con el incremento detectado de bacterias dinoflagicidas para A. catenella
que está presente en la Región desde 1972 (Guzmán
& Lembeye, 1975; Tabla II). También es importante destacar, que en ambos períodos de muestreo
bacteriano, se mantiene un alto efecto letal para
P. reticulatum (Tabla II). Esta observación podría
significar que las bacterias dinoflagicidas participarían en condicionar la colonización de ciertas áreas
geográficas por organismos causantes de FANs en
conjunción con otros factores (Ogata et al., 1987).
Además, la actividad dinoflagicida es considerada
independiente de la competencia establecida en el
co-cultivo entre el dinoflagelado y las bacterias
por los nutrientes del medio, porque se observó
que en los pocillos negativos había un crecimiento bacteriano igual o mayor al observado en los
pocillos con actividad dinoflagicida. Finalmente,
se demostró que el ensayo desarrollado (Fig. 6A)
para evaluar el efecto de los inhibidores de
proteasas que son citotóxicos para A. catenella
(Tabla I) afectan la actividad metabólica
bacteriana de fondo marino, distinguiendo los
compuestos que afectarían dicha actividad, y que
podrían emplearse en la destrucción de quistes
de los organismos que causan FANs.
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