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AG ISSN 0020 - 0867
eNEA 344
Marcación de Cepas
Bacterianas Gram Negativas
con Radioyodo 131
R. A. Ugalde
Ana M. Vigliocco
Aída Colma
Comisión
Nacional
de Energía
Atómica
República Argentina
Buenos Aires, 1973
Beatriz Gutiérrez
H. Reig
A. E. A. Mltta
INIS CLASSIFICATION AND KEYWORDS
B13
LABELLED COMPOUNDS
IODINE 131
TRACER TECHNIQUES
ANTIGENS
STABILlTY
BRUCELLA
SALMONELLA TYPHIMURIUM
ESCHERICHIA COLI
LABELLlNG
COMISION NACIONAL DE ENERGIA ATOMICA
DEPENDIENTE DE LA PRESIDENCIA DE LA NACION
MARCACION DE CEPAS BACTERIANAS
GRAM NEGATIVAS CON RADIOYODO 131
R.A. Ugalde", Ana M. Vigliocco', Aída Colma',
Beatriz Gutiérrez', H. Re ig" y A.E.A. Mirra"
RESUMEN
Se marcaron diversas cepas bacterianas Gram negativas con radioyodo.
La técnica utilizada fue la de Me Farlane con modificaciones menores. El
rendimiento radioquímico osciló entre 30-50 %. Se estudió la estabilidad de
las distintas cepas marcadas y se efectuaron controles de la estabilidad antigénica de las paredes bacterianas marcadas, <siendo los resultados altamente satisfactoricsf
SUMMARY
Several Gram negative bacterial strains were labelled with radioiodine.
Me Farlane' s technique, slightly modified, was fol1owed and the radioch emical yield obtained was about 30-50 %. The stability of the different Iabelled strains was studied. Antigenic stability of the labelled bacterial walls,
was highly satisfactory.
"
*
CNEA, Departamento de Biología Nuclear Aplicada
CNEA, Departamento de Química
Trabajo realizado en el Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGIA AGROPECUARIA, Castelar, prov, de Buenos Aires,
en virtud del convenio de colaboración INTA-CNEA.
- 4INTRODUCCION
En estos últimos años se ha venido demostrando la utilidad del uso de
bacterias marcadas con radioisótopos, en el estudio de la depuración sanguínea de las mismas por células del Sistema Retículo Endotelial (S.R.EJ. Los
parámetros obtenidos a través de la técnica de la depuración sanguínea, permiten inferir el estado funcional del S.R. E..
A fin de valorar dichos parámetros, se utilizaron cepas bacterianas marcadas con radioyodo según la técnica de Mc F arlane (1).
Las condiciones experimentales del sistema de trabajo elegido para valorar la fagocitosis "in vivo" exigió la obtención de bacterias marcadas con
adecuada actividad específica y que a la vez mantuvieran intacta su estructura antigénica.
MATERIALES Y METODOS
Material biológico
Brucela abortus S 19; Brucela abortus 45/20; Salmonella Typhimurium
LT2; Salmonella Typhimurium (aislada de epizootia de cobayos); Escherichia
coli.
Cultivo de cepas bacterianas
Brucela .abortus S 19, Brucel a abortus 45/20, y ambas salmonellas
fueron cultivadas en medio de Trypticase Soy Agar (T.S.A.) de BBL a 36°C
durante 72 horas. Escherichia coli fue cultivada en Trypticase Soy Broth
(T.S.s.) BBL a 36°C durante 24 horas con agitación constante.
Inactivación de las cepas bacterianas
Las cepas fueron cosechadas por centrifugación a 10.050 g durante 15 minutos y lavadas cuatro veces con solución fisiológica estéril fenicada l 5 0 / 0 0 J.
Las bacterias lavadas y sedimentadas por centrifugación fueron resuspendidas en solución fisiológica fenicada y dejadas 72 horas a 36°C en estufa, con agitación constante. Previo control de viabilidad, la suspensión bacteriana fue nuevamente lavada con solución fisiológica estéril y ajustada a 20
miligramos de peso húmedo por ml en solución fisiológica.
,- 5Las suspensiones bacterianas así obtenidas dieron los siguientes valores en proteínas totales, dosadas por el método de Biuret utilizando como patrón albúmina bovina (Sigma):' Brucela abortus S 19, 2,00 mg/ml; Brucela
abortus 45/20, 1,60 mg/ml; Escherichia coli , 6,16 mg/rnl y ambas salmonellas 1,60 mg/ml.
Determinación del número de bacterias
Brucela abortus S 19 fue cuantificada por mediciones en cupl a entre
Xi = 0.0. 660 mil (leídas en un espectrometro Bausch y Lornb) e Yi = número
de bacterias contadas en cámara Petroff-Hauser. El rango de lecturas 0.0.
estuvo comprendido entre 0,020 y 0,120. La ecuación de regresión obtenida
fue:
Yi
=
0,2059334 + 42,183996 Xi
Las demás cepas fueron cuantificadas por conteo directo en cámara. El
número de bacterias por mililitro de suspensión utilizadas para la marcación
correspondió a un valor promedio de 2,30 x 1010.
Solución stock de mono c loruro de yodo
En un tubo cónico graduado de 20 ml de capacidad con tapón esmerilado, .se disolvieron 167 mg de KI (l mM) 'y 107 mg de KIO] (0,5 mM) 'en 2,5 ml
de agua destilada, ,se añadieron gota a gota y agitando 2,4 ml de HCI concentrado y 1 rnl de Cl.C. Se llevó luego a 10 ml con agua destilada..
Solución de trabajo
Se tomó un rnl de solución stock y se le añadió 47 rnl de CINa 1M y 2 rnl
HONa N.
Solución molar de glicina en ClNa M/4
Se disolvieron 7,5 gramos de glicina y 1,46 gramos de CINa en 100 ml
de agua destilada.
- 6Solución alcalina de glicina
Se mezclaron 9 ml de glicina molar en molar/4 de CINa y se añadió 1 ml
de HONa N.
Método de marcación
En un Erlenmeyer de 200 ml de capacidad, con agitador magnético, se
colocó una suspensión salina de aproximadamente 20 ml de bacterias y se
añadió 0,5 - 1 ml de solución reguladora de glicina pH 9,1. Aparte se colocó
1 ml de solución de trabajo de ~loruro de yodo, al que se agregó 5-10 mCi de
l31INa sin portador ni reductor y 0,5 ml de solución reguladora de glicina,
pH 9,1. Esta solución se añadió rápidamente en el Erlenmeyer, haciendo funcionar el agitador magnético durante 30-60 minutos. Finalmente se agregó un
ml de solución de yoduro de sodio al 1 %. Las bacterias marcadas se lavaron
con solución salina 3-4 veces (2).
Controles
1. Se midió la radiactividad de los productos en una cámara de ioniza-
ción Mediac modelo 63.620.
2. El control de radioyoduro inorgánico se realizó (3) mediante cromato-
grafía en papel Whatman NQ 1, solvente metanol 85 %, tiempo de corrida 2 1/2 horas en la oscuridad RfI = 0,8, Re Bact. = 0,0. Las tiras
se pasaron luego por un radioscanner Packard Mod. 7200 y los porcentajes se determinaron por pesadas.
Control antigé nic o
La integridad antigénica se determinó por seroaglutinación contra sueros patrones. Los datos se cuantificaron por lectura espectrofotométrica
comparándolos contra cepas sin marcar.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
El rendimiento de la marcación fue de 30-50 %. Las bacterias marcadas
con una actividad específica de 0,26 mCi/mg de proteínas son estables durante varios días, si se mantienen a 4°C y al abrigo de la luz.
-7Al estudiarse la estabilidad de las distintas cepas bacterianas marcadas, conservadas a 4°C dentro de las dos semanas posteriores a la marcación,
se comprobó que ninguna cepa liberó más del 5 % de radioyodo.
Las verificaciones de integridad antígena demostraron la no existencia
de diferencias entre las cepas marcadas y sin marcar. En la figura 1 se ilustran los resultados obtenidos.
CONTROL DE ANTIGENICIDAD
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Figura 1
-8BIBLIOGRAFIA
1. A.S. Me FARLANE. Nature
2. D. SULITZEANU.
182 (958) 53.
J. OF INMUNOL. 82 (959) 304.
3. MANUAL DE CONTROLES RADIOFARMACEUTICOS. CNEA. (970).