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Recibido 28/06/2012, Aceptado 17/07/2012, Disponible online 07/12/2012
Weissella confusa como un agente bioprotector en la inocuidad
alimentaria contra patógenos Gram negativos
Liliana Serna-Cock1*, Luisa Fernanda Rubiano-Duque1, Nancy Bonnie Loaiza-Castillo1, Cruz
Elena Enríquez-Valencia2
1
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de Ingeniería y Administración,
Carrera 32 vía Candelaria, Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Tel. 2868888 Ext. 35720.
2
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de ciencias agropecuarias,
Carrera 32 vía Candelaria, Palmira, Valle del Cauca, Colombia.
*[email protected]
RESUMEN
La calidad de los productos de la industria alimentaria, se mide no solamente por factores
nutricionales y organolépticos si no por aspectos de inocuidad. Las bacterias ácido lácticas
se han considerado microorganismos seguros y agentes bioprotectores para garantizar la
inocuidad de algunos alimentos. En este trabajo, se evaluó la actividad antimicrobiana de
una bacteria ácido láctica, Weissella confusa, contra Escherichia coli ATCC 25922 y
Klebsiella pneumoniae, dos patógenos Gram negativos causantes de enfermedades
transmitidas por alimentos. W. confusa se produjo a través de fermentación discontinua, en
sustrato comercial MRS. Las fermentaciones se llevaron a cabo por 6 horas, sin aireación, a
33 °C, 100 rpm y agitación continua. Cada hora de fermentación se tomó una muestra del
fermentado y se separaron las células de sus compuestos metabólicos mediante
centrifugación y posterior lavado de células con NaCl al 0,9%. A las células libres de
metabolitos se les denominó W. Se midió la actividad antimicrobiana de W, mediante la
técnica de difusión en gel. W presentó actividad antimicrobiana contra los dos patógenos en
prueba. En esta investigación se demostró que W. confusa presenta actividad antimicrobiana
contra las dos bacterias Gram negativas evaluadas. Los resultados sugieren que W. confusa
y sus metabolitos podrían utilizarse en la industria de alimentos, como agente bioprotector
contra E. coli ATCC 25922 y K. pneumoniae, lo cual representa un aporte importante en la
garantía de inocuidad de alimentos.
Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, actividad
antimicrobiana, enfermedades trasmitidas por alimentos.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 102
ABSTRACT
The quality of the food industry products, is measured by organoleptic, nutritional factors
and safety aspects. Lactic acid bacteria have been considered safe and bioprotectors agents
to ensure the safety of some foods. The antimicrobial activity of lactic acid bacterium,
Weissella confuse was evaluated against two Gram-negative pathogens causing foodborne
illness, Escherichia coli ATCC 25922 and Klebsiella pneumoniae. W. confusa was grown by
batch fermentation in MRS commercial substrate. Fermentations for 6 hours, without
aeration, at 33 °C, 100 rpm and continuous stirring were performed. Every hour of
fermentation, a sample was taken, and cells of metabolic compounds were separated.
Thereafter, washing cells with 0.9% NaCl were made. The cell-free metabolites were named
W. The antimicrobial activity of W was measured using the technique of gel diffusion. W
presented antimicrobial activity against both pathogens tested. This research showed that W.
confusa has antimicrobial activity against both Gram-negative bacteria tested. The results
suggest that W. confusa could be used in the food industry as a biocontroler agent against E.
coli ATCC 25922 and K. pneumoniae, which represents an important contribution in ensuring
food safety.
Key Words: Lactic acid bacteria, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, antimicrobial
activity, foodborne diseases.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy- 103
I.
INTRODUCCIÓN
En un sentido estricto, la inocuidad de
alimentos se ha definido como la
probabilidad
de
no
contraer
una
enfermedad como consecuencia del
consumo de cierto tipo de alimento. En un
sentido amplio, la inocuidad de un
alimento
también
comprende
las
características y propiedades nutricionales
(Grunert, 2005). De tal manera que, las así
llamadas enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA’S) están directamente
relacionadas con la inocuidad alimentaria.
Éste tipo de enfermedades pueden
contraerse por la ingestión de alimentos
y/o
bebidas
contaminados
con
microorganismos patógenos que afectan
la salud del consumidor (González-Flores
y Rojas-Herrera, 2005). En general, las
categorías de alimentos de carnes,
productos lácteos y granos son las fuentes
más importantes de ETA´S, el agua
aunque no es considerada como un
alimento revela una fuente importante de
enfermedades como E. coli, V. cholerae y
Shigella spp (Pires et al., 2012).
Las ETA`S constituyen un importante
problema de salud pública debido al
incremento
en
su
ocurrencia,
el
surgimiento de nuevas formas de
transmisión, el aumento de la resistencia
de los patógenos a los compuestos
antimicrobianos
y
el
impacto
socioeconómico
que
ocasionan
(González-Flores y Rojas-Herrera, 2005).
Varios pueden ser los patógenos
asociados a ETA`S, patógenos tales como
bacterias, virus, parásitos y hongos
(Havelaar et al., 2012). Entre las bacterias
más reconocidas como causantes de
ETA`S se encuentra la cepa de E. coli
O157:H7, un importante patógeno en
humanos que por más de dos décadas, ha
causado considerables brotes de un
amplio rango de enfermedades clínicas en
el mundo (Holck et al., 2011; Pires et al.,
2012), e importantes índices de mortalidad
y morbilidad tanto en países desarrollados
como en países en desarrollo (Ho et al.,
2012).
El impacto de E. coli sobre la salud
pública es alto (Karch et al., 2005). Cepas
patógenas de E. coli pueden causar
diferentes enfermedades. La enfermedad
más común es gastroenteritis (Acuña et
al., 2012), sin embargo, puede producir
otros
síndromes
como
síndrome
hemolítico urémico (Gould et al., 2009)
dentro del cual se incluyen importantes
trastornos de salud como anemia
hemolítica, trombocitopenia e insuficiencia
renal aguda (Loirat et al., 2012).
Dentro
del
grupo
de
las
Enterobacteriáceas además de cepas
mutantes de E. coli resistentes a
antibióticos,
se
encuentran,
cepas
mutantes de Klebsiella pneumoniae
(Wong-Beringer
et
al.,
2002).
K.
pneumoniae es un importante patógeno
nocosomial que al igual que E. coli, puede
estar presente en alimentos (Calbo et al.,
2011),
ambos
patógenos
son
colonizadores
normales
del
tracto
gastrointestinal y son causa común de
bacteremia (Hsin-Yun et al., 2006).
K. pneumoniae, también ha causado
preocupación de salud pública en el
mundo por su capacidad de producir βlactamasas de amplio espectro (Liu et al.,
2012). En pacientes con bacteremias
producidas
por
K.
pneumoniae
comúnmente se encuentran enfermedades
como acceso hepático piógeno (Casella et
al., 2009) e infección del tracto respiratorio
(Hsin-Yun et al., 2006). Sin embargo,
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también puede producir alteraciones del
tracto urinario y diarreas con sangre
(Guerin et al., 1998).
Desde el comienzo de la década de
1990, la Organización Mundial de la Salud
(OMS) desarrolló una estrategia para
fomentar la capacidad de vigilancia de
enfermedades
transmitidas
por
los
alimentos, en respuesta a la creciente
incidencia de ETA`S, Sin embargo, las
deficiencias en la vigilancia de ETA`S
persisten (Pires et al., 2012), lo que hace
urgente
la
búsqueda
de
nuevos
alternativas
para
su
control
y
mejoramiento de la inocuidad en los
alimentos.
Las bacterias ácido lácticas (BAL), son
bacterias Gram positivas, generalmente no
móviles y no esporuladas, las cuales
producen
ácido
láctico
(Ringø
y
Gatesoupe, 1998). Su carácter de GRAS
(generalmente reconocidas como seguras)
ha
permitido
que
se
desarrollen
numerosas
líneas
de
investigación
relativas a su utilización para asegurar la
biopreservación y la inocuidad de los
alimentos (Roldán et al., 2011).
Weissella confusa es una BAL que ha
sido aislada de una gran variedad de
nichos naturales (Björkroth, et al., 2002)
como
vegetales
frescos,
alimentos
fermentados, productos cárnicos (Diez, et
al., 2009) y rumen bovino (Serna et al.,
2010). Este género al igual que otras BAL,
poseen actividad antimicrobiana por la
producción de acido láctico, peróxido de
hidrogeno, diacetilos y compuestos que
actúan como bacteriocinas los cuales no
han sido aún identificados (Matamoros, et
al. 2009). Las bacteriocinas, generalmente
son reconocidas como compuestos
“naturales” capaces de influenciar en la
inocuidad y calidad de los alimentos
(Settanni y Corsetti, 2008); sin embargo, la
sensibilidad de bacterias Gram negativas
a bacteriocinas producidas por BAL no es
común (Riaz et al., 2010), en general,
éstas bacteriocinas son más activas contra
bacterias Gram positivas que bacterias
Gram negativas (Askari et al., 2012).
Existen reportes científicos de la
producción de bacteriocinas por el género
Weissella. Lee (2005), encontró que una
especie de Weissella Kimchi PL 9023,
aislada del tracto vaginal de mujeres,
presentó actividad antagónica contra
patógenos vaginales Candida albicans,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Streptococcus
agalactiae
con
la
producción de sustancias similares a
bacteriocinas. Pal y Ramana (2009),
encontraron la producción de compuestos
antimicrobianos
no
asociados
a
bacteriocinas secretadas por Weissella
paramesenteroides DFR- 8; aislado a
partir de material vegetal; los cuales tenían
amplio espectro de acción sobre
patógenos transmitidos por alimentos.
Espeche
et
al.
(2009),
aislaron
compuestos antimicrobianos producidos
por
especies
de
Weissella
paramesenteroides aisladas de muestras
de leche de bovinos sanos, con efecto
antimicrobial
contra
Streptococcus
dysgalactiae ATCC 27957 y Escherichia
coli. Serna, et al. (2010), reportaron la
actividad antimicrobial de especies de
Weissella confusa aisladas de líquido
ruminal bovino contra especies de
Staphylococus aureus y Streptoccocus
agalactiae principales patógenos causales
de mastitis bovina.
De acuerdo con lo anterior, la
capacidad antimicrobiana del género
Weissella
contra
patógenos
Gram
negativos causales de ETA´S representa
una importante alternativa de investigación
como una estrategia para mejorar la
calidad e inocuidad de los alimentos. El
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objetivo de este trabajo fue evaluar la
actividad antimicrobiana de Weissella
confusa contra una cepa comercial de E.
coli y K. pneumoniae patógenos Gram
negativos causales de ETA’S.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Bacteria ácido láctica
Como bacteria ácido láctica se utilizó
una cepa de W. confusa crioconservada
en glicerol (-20 °C), obtenida y además
caracterizada en investigaciones de Serna
et al. (2010), la cual fue seleccionada de
un grupo de bacterias ácido-lácticas
aisladas de líquido ruminal de hembras
bovinas de raza Hartón del Valle.
Para la reactivación de la cepa, se
inoculó el 10 % (v/v) del cultivo de W.
confusa en 5 ml de caldo MRS (Scharlau
Microbiology, España) suplementado con
40 g/L de glucosa (Merck, Alemania) y se
incubó a 32 °C por 24 horas.
Patógenos Indicadores Gram negativos
Para evaluar la actividad antimicrobiana
de células de W. confusa libres de
metabolitos se utilizaron dos cepas
patógenas indicadoras, se utilizó una cepa
de E. coli ATCC® 25922, a concentración
de 108 ufc.ml-1 y una cepa nosocomial de
K. pneumoniae (concentración de 107
ufc.ml-1) donada por el laboratorio clínico
de Imbanaco, Cali Colombia.
Crecimiento de W. confusa
W. confusa se hizo crecer bajo el
proceso de fermentación en sustrato
comercial MRS. Se realizaron tres
fermentaciones en discontinuo por 6
horas. Cada fermentación se realizó en
erlenmeyer de 1000 mL, (800 mL de
volumen efectivo) sin aireación, en
agitación continua con agitador orbital
(model 5000I, VWR, USA) fijado en 33 °C
y 100 rpm. En cada una de las
fermentaciones, se utilizó un inóculo inicial
de W. confusa del 10% con respecto al
volumen de sustrato de fermentación. La
fermentación se ajustó a pH 6,0 utilizando
NaOH (4M).
Obtención y separación de células de
W. confusa
En cada una de las fermentaciones,
cada hora se tomaron 45 ml del
fermentado. El fermentado se llevó a
centrifugación durante 30 minutos a 2860
g (modelo 5804R Eppendorf CITI,
Germany). Transcurrido el tiempo de
centrifugación, se separaron el precipitado
y el sobrenadante. El precipitado,
correspondiente a células de W. confusa,
se sometió a un proceso de lavado con
solución de NaCl al 0,9%, se agitó
suavemente, se centrifugó por 5 min a
2860 g y se desechó el sobrenadante. De
esta forma se obtuvieron células de
W.confusa libres de metabolitos (W). El
mismo procedimiento se realizó a las
horas 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de fermentación.
Evaluación
de
la
capacidad
antimicrobiana de células libres de
metabolitos (W) contra E. coli y K.
pneumoniae
La actividad antimicrobiana de W contra
cepas comerciales de E. coli ATCC®
25922 y K. pneumoniae se midió a través
de la técnica de difusión en pozo. Para el
crecimiento de E. coli y K. pneumoniae, se
utilizaron placas de agar nutritivo
(Scharlau Microbiology, España) de 5 mm
de espesor. En las placas en las cuales se
midió la actividad antimicrobiana de W se
realizaron
orificios
utilizando
un
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sacabocado estéril de 15 mm de diámetro.
Cada placa se sembraron por separado
con 100 µl de cultivos de E. coli y K.
pneumoniae a concentraciones de 108 y
107 ufc.ml-1, respectivamente.
Posteriormente, en forma aséptica, se
tomaron círculos de agar MRS estéril de 5
mm de espesor y de 15 mm de diámetro,
los cuales se inocularon por separado, con
0,06 ml de W (a concentraciones que
dependían del tiempo de fermentación).
Los círculos de agar inoculados se
depositaron en los orificios realizados en
las cajas con agar Eosin-azul de Metileno
las cuales contenían el patógeno.
Finalmente, todas las cajas se
incubaron a 33 °C por 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación, se
midieron los halos de inhibición de
crecimiento
contra
los
patógenos,
utilizando regla milimétrica.
Análisis estadístico
Para
evaluar
la
capacidad
antimicrobiana de Weissella confusa
contra E. coli y K. pneumoniae se utilizó
un diseño unifactorial con dos niveles.
Como variable de respuesta se midió la
actividad antimicrobiana de W contra E.
coli y K. pneumoniae en 7 tiempos de
fermentación, hora 0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. La
hora 0 correspondió a las condiciones
iniciales de fermentación. Los tratamientos
se realizaron por triplicado. Los resultados
se analizaron a través del programa
estadístico SAS versión 9.13. La
comparación entre promedios se llevó a
cabo a través de la prueba Tukey con una
probabilidad de p<0,05.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como se muestra en la figura 1, se
encontró que W. confusa posee capacidad
antimicrobiana contra los dos patógenos
Gram negativos en prueba. Según los
resultados estadísticos se encontraron
diferencias significativas (p<0,05) de la
capacidad antimicrobiana entre patógenos
evaluados. Se encontró mayor actividad
antimicrobiana de W contra BAL.
Diferentes
investigaciones
han
demostrado capacidad antimicrobiana de
BAL y de bacteriocinas contra E. coli
(Ogawa et al., 2001; Savadogo et al. 2004;
Kuwano et al., 2005; Mufandaedza et al.,
2006; Belfiore et al., 2007; Youssef et al.,
2012); sin embargo, hasta la actualidad,
no
se
ha
reportado
actividad
antimicrobiana de BAL y/o bacteriocinas
contra K. pneumoniae. Recientemente,
Askari et al., (2012) aisló un grupo de
bacterias ácido lácticas a partir de frutas
secas y evaluó su actividad antimicrobial
contra patógenos Gram negativos y
patógenos Gram positivos, los autores
encontraron actividad contra cocci,
Staphylococcus aureus, S. epidermis,
Streptococcus spp, S. sanguins, Hafnia
alveie y Yersinia spp, sin embargo, no
encontraron
actividad
antimicrobiana
contra
K.
pneumoniae,
E.
coli,
Pseudonones aerugenose, Acinetobacter
baunanii y Pseudomonas fluorescens.
Se ha descrito que la capacidad de
inhibición de las BAL contra bacterias
patógenas varía de acuerdo al serotipo del
patógeno. Savadogo et al. (2004), aislaron
8 cepas de BAL a partir de muestras de
leche fermentada, los autores encontraron
que las cepas patógenas indicadoras
Gram positivas fueron mucho más
sensibles a las bacteriocinas producidas
por las BAL aisladas que las cepas
patógenas indicadoras Gram negativas,
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donde una sola cepa Gram negativa fue
inhibida (E. coli 105182 CIP), similares
A
resultados fueron encontrados por (Askari
et al., (2012).
B
Figura 1. Actividad antimicrobiana de células de Weissella confusa contra Escherichia coli
(A) y Klebsiella pneumoniae (B).
Generalmente, la habilidad preservativa
de las BAL en los alimentos es atribuida a
la
producción
de
metabolitos
antimicrobiales
incluyendo
ácidos
orgánicos y bacteriocinas (Castellano et
al., 2008). En cuanto a los mecanismos de
inhibición utilizados por las bacteriocinas,
la formación de poros en la membrana
citoplásmica de células sensibles parece
ser un mecanismo de acción común. La
estructura de estos péptidos, α-helice o ßhelice, forman dos capas, una hidrofilica y
otra hidrofóbica creando oligómeros que
atraviesan la membrana formando poros
(Vásquez
et
al.,
2009).
Como
consecuencia, a través del poro se
observa, una pérdida de ATP, iones K y en
algunos casos de aminoácidos y
moléculas pequeñas. La pérdida de estas
sustancias origina a su vez una pérdida
del potencial de membrana, consumo de
las
reservas
energéticas
celulares,
descenso en la síntesis de ADN, ARN y
proteínas, originando finalmente la muerte
celular (Klaenhammer, 1993 citado por
Vásquez et al., 2009).
Hasta el momento, el mecanismo de
acción de la capacidad antimicrobiana de
BAL contra patógenos Gram negativos no
está completamente dilucidado.
La
resistencia de las Gram negativas o su
baja sensibilidad a la actividad de las BAL
comúnmente es atribuida a la naturaleza
particular de su envoltura celular
(Savadogo et al., 2004). El exterior de la
membrana de bacterias Gram negativas,
la
cual,
está
compuesto
por
lipopolisacáridos (LPS) actúa como una
barrera de permeabilidad que es capaz de
excluir macromoléculas y sustancias
hidrofílicas confiriéndole resistencia a
compuestos
antimicrobiales
(Nikaido,
1989). Sin embargo, aunque, la membrana
exterior de las Gram negativas protege a
la célula de muchos agentes externos, es
posible debilitarlo a través de diversos
agentes
llamados
colectivamente
permeabilizadores que desintegran la
capa de LPS e incrementan la
permeabilidad de la membrana (Vaara,
1992; Alakomi et al., 2006).
Por ejemplo, nisina un péptido
antimicrobial producido por Lactococcus
lactis subsp. lactis (Carr et al., 2002) es la
única bacteriocina autorizada para ser
utilizada en alimentos. La inhabilidad de
nisina contra bacterias Gram negativas es
debido a la protección de la membrana
(Belfiore et al., 2007). No obstante,
investigadores han encontrado actividad
antibacteriana de nisina contra Gram
negativas cuando ésta es usada junto con
agentes
permeabilizadores
de
la
membrana (Alakomi et al., 2000; Hoffman
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 108
et al., 2001; Branen y Davidson, 2003;
Belfiore et al., 2007). En este trabajo, no
se utilizó un agente permeabilizador para
mejorar la sensibilidad de E. coli y K.
pneumoniae sin embargo se encontró
actividad antimicrobiana de W contra los
dos patógenos, lo cual representa
relevancia e importancia de investigación
de
Weissella
confusa
en
la
biopreservación de alimentos e inocuidad
alimentaria.
W
contra K. pneumoniae. K. pneumoniae es
un importante patógeno nocosomial que al
igual que E. coli, se puede encontrar
presente en alimentos (Calbo et al., 2011).
Este patógeno es una causa común de
bacteremia (Hsin-Yun et al., 2006), el cual,
generalmente se encuentra asociado a
enfermedades como acceso hepático
piógeno (Casella et al., 2009) e infección
del tracto respiratorio (Hsin-Yun et al.,
2006).
Como se puede observar en la figura 2,
presentó actividad antimicrobiana
Figura 2. Curvas de la actividad antimicrobiana de células de Weissella confusa (W) contra
E. coli y K. pneumoniae
Dadas las consecuencias de las ETA`s
en la salud humana, los consumidores
cada vez más están exigiendo alimentos
mínimamente procesados libres de
agentes
patógenos,
con
menos
conservantes y aditivos, pero con buena
calidad sensorial (Castellano et al., 2008).
La aplicación potencial de bacteriocinas
como biopreservantes es significativa
dado que son menos tóxicos o menos
carcinogénicos
que
los
agentes
antimicrobiales normales (Savadogo et al.
2004). Muchas bacteriocinas de LAB son
seguras e inhibidores naturales de
patógenos y de bacterias que causan
deterioro de los alimentos (Françoise,
2010), por lo tanto, el uso de BAL con
capacidad
antimicrobiana
contra
patógenos, como cultivos de bioprotección
puede mejorar su vida útil e inocuidad
(Castellano et al., 2008).
En este trabajo, no se encontró
diferencia significativa de la capacidad
antimicrobiana de W a través del tiempo
de fermentación (Figura 2), contra los dos
patógenos en prueba. Para E. coli, se
encontraron promedios de diámetro de
inhibición entre 2,6 y 3,0 cm y para K.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 109
pneumoniae se encontraron promedios de
inhibición entre 2,33 y 2,63 cm.
En recientes investigaciones de Serna
et al., 2010 y Serna et al., 2011, los
autores demostraron que W. confusa y sus
metabolitos
poseen
capacidad
antimicrobiana contra patógenos Gram
positivos como Streptococcus aglactiae y
Staphylococcus aureus. Teniendo en
cuenta los resultados de este conjunto de
investigaciones, la búsqueda de aplicación
de W. confusa y W10b en la inocuidad de
los alimentos incrementa su importancia,
además, Serna et al., (2012) tienen
demostrado que cuando W. confusa se
hace crecer en sustrato MRS, su actividad
se conserva por más de seis semanas de
almacenamiento en liofilización y que por
el contrario cuando se hace crecer en
sustrato que contiene leche extracto de
levadura y glucosa, su actividad se puede
conservar hasta por seis semanas bajo
refrigeración, resultados los cuales
facilitan la búsqueda de uso de W y W10b
como un método de biopreservación de
los alimentos, tanto de bacterias
patógenas causales de ETA´s como
bacterias que causan deterioro de los
alimentos.
IV. CONCLUSIONES
Se demostró que W. confusa presenta
actividad antimicrobiana contra patógenos
Gram negativos, específicamente contra
E. coli y K. pneumoniae. En este trabajo,
no se utilizó un agente permeabilizador de
membrana para medir la actividad
antimicrobiana de la bacteria ácido láctica
contra los patógenos Gram negativos, por
lo cual los resultados de esta investigación
son de gran relevancia. Estos resultados
permiten demostrar y proponer a
Weissella confusa como una alternativa de
biopreservación de alimentos, por lo cual,
merece
mayores
esfuerzos
de
investigación para ser utilizada en
inocuidad
y
seguridad
alimentaria,
especialmente en la prevención de ETA´S.
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AGRADECIMIENTOS
Los
autores
expresan
su
agradecimiento a la Universidad Nacional
de Colombia por la financiación de la
investigación.
Vol 21, No 27 (2012), Revista Alimentos Hoy - 114