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UNIVERSIDAD DE MAYORES
PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA Y
BIOTECNOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA I
DRAS. MARÍA LUISA ORTIZ Y ANA PEDREGOSA
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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOMEDICINA I
MICROBIOLOGÍA I
I) PRIMER DÍA DE PRÁCTICAS
En cada taquilla se dispone de dos microorganismos, crecidos en tubos con
medio agar nutritivo, que se utilizarán en el desarrollo de las prácticas:
Bacteria Gram - : Escherichia coli
Bacteria Gram+: Staphylococcus aureus
I.1.- Resiembra de bacterias en tubo de agar inclinado.
Los microorganismos se deben de mantener de forma adecuada en el laboratorio
para poder utilizarlos cuando se requiera. Los microorganismos se pueden conservar
en diversos medios de cultivo contenidos en tubos o placas; sin embargo, es necesario
realizar cada cierto tiempo su resiembra en medio nuevo. En esta práctica se va a llevar
a cabo la resiembra de dos microorganismos por taquilla (Escherichia coli y
Staphylococcus aureus); cada uno se inoculará en un tubo con medio agar nutritivo
nuevo.
Procedimiento a seguir:
Se toma el asa de siembra y se esteriliza a la llama del mechero, hasta que se
pone al rojo.
Se destapa el tubo que contiene el microorganismo, tomando el tapón con el
dedo meñique de la mano derecha. Se esteriliza la boca del tubo pasándolo ligeramente
por la llama del mechero. Se introduce el asa, se roza suavemente la superficie del
cultivo, y se saca el asa con cuidado para no tocar las paredes del tubo. Se esteriliza la
boca del tubo y se cierra.
Se abre el tubo que contiene el medio nuevo y se esteriliza la boca en la llama
del mechero. Se introduce el asa de siembra (que contiene una muestra del
microorganismo) hasta el fondo del tubo. Al sacar de nuevo el asa se avanza en zig-zag
sobre la superficie del medio sólido. Se flamea la boca del tubo antes de cerrarlo de
nuevo y el asa de siembra se esteriliza a la llama del mechero.
Los tubos inoculados se incuban en una estufa a 371C durante 24 horas,
escribiendo el nombre del microorganismo resembrado en el tubo nuevo.
I.2.- Inoculación de microorganismos en medios selectivos y diferenciales:
Inoculación mediante siembra en placa por agotamiento.
En Microbiología se pueden utilizar diferentes medios de cultivo para el
crecimiento de los microorganismos. Los medios generales son aquellos que permiten
el crecimiento indiscriminado de gran número de microorganismos (el agar nutritivo es
un medio general). Los medios selectivos favorecen el crecimiento de unos
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microorganismos frente a otros. Los medios diferenciales permiten diferenciar o
distinguir a algunos microorganismos según el crecimiento que tengan en estos medios.
En esta práctica vamos a observar el crecimiento de microorganismos en varios
medios selectivos y diferenciales. Los microorganismos usados son: Escherichia coli y
Staphylococcus aureus. Los medios son agar Levine y manitol salado. Se dispone de
una placa Petri de cada uno de estos medios. Se inoculará Escherichia en agar Levine y
Staphylococcus en Manitol Salado.
La inoculación se realizará según el procedimiento de siembra en estría en
superficie de una placa, según se indica:
Se parte del tubo con el microorganismo; el tubo se destapa, se flamea la boca y
con el asa de siembra se toma una muestra.
Se lleva el asa de siembra a una placa con el medio sólido correspondiente. Se
desliza el asa suavemente sobre la superficie del medio, dibujando varias líneas
paralelas próximas (estrías) en un borde de la placa.
Esterilizar de nuevo el asa de siembra, dejándola enfriar. Repetir dos veces la
operación anterior, haciendo nuevas estrías en ángulo con las precedentes.
Incubar en la estufa de cultivo a 371C durante 24 horas, colocando la placa Petri
en posición invertida.
Este tipo de siembra recibe el nombre de Asiembra por agotamiento@ porque
el número de microorganismos que se inocula en cada dirección es cada vez mas
pequeño. Mediante este procedimiento, en algún sitio de la placa aparecerán colonias
aisladas de los microorganismos inoculados. Este método de siembra nos permite
obtener cultivos puros de los mismos (un cultivo puro es aquel que contiene un sólo
tipo de microorganismo).
A continuación se indican algunos aspectos de la composición de los medios que
determinan el diferente crecimiento de los microorganismos en ellos.
Agar levine o EMB.
Fundamento. Este medio contiene colorantes (azul de metileno y eosina), que
inhiben el crecimiento de las bacterias Gram+. El medio contiene lactosa como fuente
de carbono, que es usada por diversas enterobacterias con producción de ácido.
Crecimiento de microorganismos en el medio: Escherichia coli crecerá en el
medio al ser un microorganismo Gram-. Al fermentar lactosa, produce una
acidificación muy intensa del medio; por ello, los colorantes precipitan originando
colonias de color oscuro con tono verde metálico brillante característico.
Manitol salado
Fundamento: Este medio contiene una elevada concentración de cloruro sódico,
lo que permite el crecimiento sólo de microorganismos tolerantes a ella, entre los que
se encuentran los pertenecientes al género Staphylococcus. Además, el medio contiene
como fuente de carbono manitol, que es utilizado por los microorganismos
produciendo ácido que ocasiona un viraje del colorante rojo de fenol que contiene el
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medio, que cambia a amarillo.
Crecimiento de microorganismos: En manitol salado tienen que crecer sólo
estafilococos, formando colonias pequeñas amarillas rodeadas de un halo amarillo.
I.3.- Observación del crecimiento de microorganismos presentes en los dedos
La superficie de la piel está colonizada por diferentes microorganismos, cuya
presencia se va a detectar en esta práctica. En cada taquilla se dispone de dos placas
Petri con medio agar nutritivo. Cada alumno presionará suavemente con los dedos de
una mano sobre la superficie del medio de una placa. Incubar a 371C con la placa en
posición invertida.
II) SEGUNDO DÍA DE PRÁCTICAS
II.1.- Tinción de bacterias. Observación de microorganismos presentes en el
yogur mediante tinción simple con azul de metileno.
La observación de los microorganismos al microscopio óptico se facilita con la
realización de diferentes tinciones. La tinción simple de denomina así porque emplea
un sólo colorante. Se llevará a cabo la tinción simple de yogur para observar los
microorganismos presentes en el mismo. En la producción de yogur se utilizan, en
general, los microorganismos Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus lactis
(actualmente denominado Lactococcus lactis).
Procedimiento de tinción: Método de Loeffler.
- Con el asa de siembra estéril se toma una muestra del yogur.
- Se coloca la muestra en un portaobjetos, extendiéndola sobre su superficie.
- Fijar la preparación calentando el porta muy ligeramente sobre la llama del
mechero hasta que esté seco (un exceso de calor podría destruir las bacterias).
- Se realiza una tinción simple con azul de metileno, cubriendo la preparación
con el colorante durante 5 minutos.
- Lavar con agua destilada.
- Secar la preparación al aire.
- Observar al microscopio óptico.
Las bacterias aparecen teñidas de color azul. Los lactobacilos se observan como
bacilos muy alargados y los estreptococos como cocos que forman cadenas.
II.2.- Tinción de bacterias. Tinción de Gram.
La tinción de Gram es una tinción diferencial. En ella se emplean dos colorantes.
Sirve para diferenciar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, lo que es
debido a la diferente estructura de su pared celular.
Se llevará a cabo la tinción de dos bacterias: Staphylococcus aureus y
Escherichia coli, que son microorganismos Gram+ y Gram-, respectivamente.
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Procedimiento:
- Con el asa de siembra estéril se toma una muestra del cultivo bacteriano,
rozando suavemente el extremo del asa en la superficie del cultivo.
- Se coloca una gota de agua en un portaobjetos y sobre ella se deposita el
microorganismo, extendiendo la suspensión de bacterias sobre la superficie del porta.
- Fijar la preparación calentando el porta muy ligeramente sobre la llama del
mechero hasta que esté seco (un exceso de calor podría destruir las bacterias).
- Cubrir la preparación con el colorante cristal violeta (colorante primario)
durante 2 minutos. Lavar con agua.
- Escurrir el exceso de colorante y aplicar una solución de lugol durante 1
minuto.
- Decolorar con alcohol de 961 hasta que no salga mas colorante. Lavar con
agua.
- Aplicar safranina (colorante de contraste) durante 1 minuto.
- Lavar con agua, secar al aire y observar la preparación con el objetivo de
inmersión del microscopio óptico.
Las bacterias Gram positivas aparecen coloreadas en violeta y las Gram
negativas presentan una coloración rojiza.
II.3.- Observación de la resiembra en tubo de agar inclinado.
Se observará si se ha producido crecimiento de los microorganismos inoculados
en la superficie del agar inclinado.
II.4.- Observación del crecimiento de los microorganismos en medios selectivos y
diferenciales.
Para la observación del crecimiento de los microorganismos inoculados el día
anterior en diferentes medios selectivos y diferenciales, consultar el apartado I.2.
III) TERCER DÍA DE PRÁCTICAS
III.1.- Observación del crecimiento de microorganismos presentes en los dedos
Se observará la placa de agar nutritivo para determinar si se ha producido
desarrollo de colonias correspondientes a los microorganismos presentes en los dedos.
III.2.- Observación de otros microorganismos (hongos filamentosos y levaduras)
Se llevará a cabo la observación en fresco de hongos mediante tinción con azul
de lactofenol, siguiendo el siguiente procedimiento:
Se deposita una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos.
Se toma una muestra del cultivo del microorganismo a observar con el asa de
siembra estéril y se resuspende sobre el colorante.
Se coloca un cubreobjetos encima y se observa al microscopio.
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