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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ASIGNATURA:
BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO
ELABORARON: M.C. MARIA DEL ROCIO VILLA GONZALEZ
MVZ. ERICK CECILIO FERNANDEZ MENESES.
M.C. CARLOS GERARDO CASTILLO SOSA
OTOÑO 2012
Tecamachalco, Pue.
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
CONTENIDO
Pag
I.
Plan institucional de desarrollo de la Facultad de Medicina
1
Veterinaria y Zootecnia
II.
Introducción
2
III.
Ubicación de la asignatura en el mapa curricular
3
IV.
Nivel de desempeño
4
V.
Mapa del sistema de practicas
5
VI.
Practicas
generales
de
seguridad,
reglamentos
y
procedimientos generales
VII.
Practica 1: Conocimiento, manejo del material y aparatos del
laboratorio
Práctica 2: Tinción de Gram
Práctica 3: Tinción de Bacterias Ácido alcohol Resistente
Práctica 4: Tinción de cápsula
Práctica 5: Tinción de esporas
Practica 6: Esterilización y Desinfección
Práctica 7: Preparación de medios de cultivo
Práctica 8: Siembra en medios de Cultivo
Práctica 9: Metabolismo Bacteriano
Práctica 10: Morfología celular
Práctica 11: Susceptibilidad a Quimioterapéuticos
Práctica 12: Toma y Envío de Muestras
Práctica 13: Diagnóstico Bacteriológico
Bibliografía
6
10
15
24
28
33
37
44
53
62
68
76
81
90
91
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
I.
PLAN INSTITUCIONAL DE DESARROLLO DE LA FACULTAD
DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MISIÓN
Formar Médicos Veterinarios Zootecnistas que coadyuven a la sustentabilidad de
los sistemas de producción, bienestar, salud animal y salud pública, con un
enfoque integral, innovador y humanista basado en el desarrollo de conocimientos,
habilidades, actitudes y valores adquiridos con base en las necesidades del
contexto en el que se desarrolla.
VISIÓN
Ser un programa educativo acreditado y reconocido que de respuesta a las
necesidades del entorno regional, nacional e internacional. Tener una planta
académica con postgrado, especializada o certificada, líneas de investigación
pertinentes, intercambios que fortalezcan la movilidad estudiantil y docente,
además de contar con infraestructura y tecnología de punta. El programa será
ampliamente aceptado y reconocido socialmente, evidencia dada por la
aceptación de los egresados en el ámbito laboral, y su inserción en procesos de
desarrollo comunitario.
- 1 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
II.
INTRODUCCION
El presente Manual de Prácticas de Bacteriología surge como una
necesidad de contar con un material didáctico que sirva de apoyo para el
estudiante de la licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Benemérita
Universidad Autónoma de Puebla y pretende ser una guía práctica en su Trabajo
de Laboratorio, cabe mencionar que las prácticas aquí propuestas fueron
revisadas, analizadas, modificadas y adaptadas a las condiciones que exige
nuestro programa de estudios y a la infraestructura propia de nuestra Universidad.
En este Manual se han diseñado una serie de prácticas, las cuales serán
realizadas en el transcurso del cuatrimestre y obedeciendo al programa de
estudios vigente de la materia en la Unidad Académica, que abarcan desde la
morfología bacteriana hasta las pruebas bioquímicas características que permiten
dar un diagnóstico confirmativo, vinculando así la Teoría con la Práctica.
Queremos puntualizar que cualquier material didáctico por sí solo no
representa un medio eficaz para la adquisición, comprensión y aplicación de los
conocimientos, sino que mucho depende de la forma, el orden y la disciplina con el
que sea manejado. Entonces invitamos a ALUMNOS-PROFESOR DE LA
MATERIA, PROFESOR DE LABORATORIO Y TODOS LOS QUE LABORAN EN
ESTE DEPARTAMENTO a que con juntemos nuestros esfuerzos para que este
Manual cumpla con el objetivo para el cual fue creado.
Esperamos que después de haber trabajado con este manual realicemos
las críticas constructivas pertinentes que permitan mejorarlo.
PONGAMOS NUESTRO MAYOR ESFUERZO PARA
CONJUNTEMOS UN MISMO OBJETIVO “TRABAJO”
QUE
TODOS
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
III.
UBICACIÓN
DE
CURRICULAR.
LA
ASIGNATURA
DEJAR
UNA
EN
HOJA
EN
EL
MAPA
BLANCO
Y
NOSOTROS (SECRETARIA ACADÉMICA LA INCLUYE)
Periodo Escolar
No
CODIGO
NOMBRE DE LA ASIGNATURA
HT/HP por
periodo
HT/HP por
semana
Total de
Créditos por
área
Requisitos
NIVEL BÁSICO
2) Área de: Básicas
1
MVZM-001
Biología Celular Veterinaria
80
5
5
SR
2
MVZM-002
Etología y Manejo Animal
80
5
5
SR
3
MVZM-003
Anatomía Veterinaria Comparada
80
5
5
SR
4
MVZM-004
Metodología de la Investigación
Veterinaria
32
2
2
SR
5
MVZM-005
Fisiología Aplicada Veterinaria
80
5
5
SR
6
MVZM-006
Bioquímica Aplicada Veterinaria
64
4
4
SR
7
MVZM-007
Morfología Veterinaria
80
5
5
Anatomía
Veterinaria
Comparada
8
MVZM-008
Inmunología Veterinaria
64
4
4
SR
9
MVZM-009
Biología Tisular Veterinaria
80
5
5
SR
10
MVZM-010
Bacteriología y Micología Veterinaria
80
5
5
SR
11
MVZM-011
Parasitología Veterinaria
80
5
5
SR
12
MVZM-012
Virología Veterinaria
64
4
4
SR
13
MVZM-013
Farmacología y Toxicología Veterinaria
80
5
5
SR
14
MVZM-014
Bioestadística Veterinaria
64
4
4
SR
15
MVZM-015
Endocrinología de la Reproducción
Veterinaria
64
4
4
SR
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
IV.
NIVEL 1
NIVEL 2
NIVEL DE DESEMPEÑO
•
Se realizan funciones rutinarias de baja complejidad.
•
Se reciben instrucciones.
•
Se requiere de baja autonomía
•
Se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo,
variadas y aplicadas en diversos contextos.
•
Algunas actividades son complejas y no rutinarias.
•
Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonomía en las
decisiones.
•
A menudo requiere de colaboración con otros y trabajo en
equipo.
NIVEL 3
•
Se requiere un importante nivel de toma de decisiones.
•
Tiene bajo su responsabilidad recursos materiales con los que
opera su área, así como control de recursos financieros para
adquisición de insumos.
NIVEL 4
•
Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza
diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos
para conciliar intereses.
NIVEL 5
•
Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo.
•
Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza
diversa, en las que se tiene que mostrar un alto nivel de
creatividad, así como buscar y lograr la cooperación entre
grupos e individuos que participan en la implantación de un
problema de magnitud institucional.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
V.
MAPA DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS
Tema
Práctica
UNIDAD
I
GENERALIDADES
•
•
•
UNIDAD II
MORFOLOGÍA Y
TAXONOMÍA.
•
•
•
UNIDAD III
NUTRICION
Y
CARACTERISTICAS
DE CRECIMIENTO
DE
•
•
•
UNIDAD V
ACCION
•
LOS
CONOCIMIENTO Y MANEJO
DEL MATERIAL
TINCION DE GRAM
TINCION DE BACTERIAS
ACIDO ALCOHOL
RESISTENTE
TINCION DE DE CAPSULA
TINCION DE ESPORAS
PREPARACION DE MEDIOS
DE CULTIVO
SIEMBRA EN MEDIOS DE
CULTIVO
MORFOLOGIA COLONIAL
METABOLISMO
BACTERIANO
SUSCEPTIBILIDAD
QUIMIOTERAPEUTICOS
Ámbito de
desarrollo
Semana
Laboratorio
3
Laboratorio
4y5
7,8y9
Laboratorio
A
AGENTES
Laboratorio
10
Laboratorio
6
Laboratorio
Y
Posta
Zootécnica
11
ANTIMICROBIANOS
UNIDAD
VI.
•
ESTERILIZACON
DESINFECCION
VIII.
Y
DE
•
TOMA
Y
MUESTRAS
IX.
•
ESTERILIZACIÓN Y
DESINFECCIÓN
UNIDAD
COLECCIÓN
ENVIO
MUESTRAS.
UNIDAD
GÉNEROS
BACTERIANOS
MICÓTICOS
ENVIO
Y
DE
DIAGNOSTICO
BACTERIOLOGICO
Y
DE
Laboratorio
12
INTERÉS
VETERINARIO
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
VI.
PRACTICAS GENERALES DE SEGURIDAD, REGLAMENTOS
Y PROCEDIMIENTOS GENERALES
REGLAMENTO INTERNO PARA LOS PARTICIPANTES
1.
Se prohíbe estrictamente la entrada al laboratorio sin bata.
2.
Portar el protocolo de la práctica y conocer el tema así como el procedimiento
de la misma.
3.
No se permitirá la entrada 10 minutos después de iniciada la práctica.
4.
El equipo que no traiga material que se solicitó para la práctica, NO la podrá
realizar.
5.
Una vez iniciada la practica, no se permitirá la salida del laboratorio.
6.
Se prohíbe ingerir alimentos, fumar y hacer desorden.
7.
Se prohíbe usar teléfono celular durante la práctica.
8.
Solamente se prestara material con vale y credencial de la Facultad.
9.
Todos los integrantes de cada equipo de trabajo, se harán responsables del
material que se les entregue para la práctica.
10. Todo material deteriorado o destruido por descuido o intransigencia, deberá
ser reemplazado a la mayor brevedad posible (durante el periodo escolar que
se este cursando), de lo contrario se le suspenderá el desarrollo a prácticas
en el Laboratorio hasta su reposición.
11. Al término de la práctica, se deberá dejar el material y la mesa limpia para que
sea devuelto el vale y la credencial de préstamo de material.
12. El reporte de la práctica se entregará 8 días después de su realización.
13. Cada práctica, será realizada en hora y fecha preestablecida, salvo previo
aviso para su suspensión.
14. No se repondrán prácticas.
15. No ingresar a personas ajenas al grupo y a la práctica.
16. Toda actividad y actitud estará sujeta a evaluación por parte del profesor y/o
personal de apoyo académico.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
17. De no apegarse a las disposiciones y reglas del presente reglamento puede
ser motivo de sanción. El incumplimiento y la reincidencia puede ser motivo de
expulsión temporal o definitiva del laboratorio.
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual deberá ser blanca y de
manga larga. Es indispensable portar la bata abotonada y guardar el
comportamiento apropiado durante la estancia.
2. El alumno se familiarizará con los sitios en donde se encuentran localizadas las
regaderas, extinguidores, botes de basura.
3. En ningún momento se permitirá la aplicación de cosméticos, fumar, ingerir
alimentos o ambos dentro del laboratorio.
4. Limpiar con desinfectante
las mesas de trabajo antes y después de cada
práctica, así también durante la práctica si se ha derramado un reactivo o
muestra biológica.
5. Para evitar quemaduras se deberán apagar mecheros, planchas calientes o
ambos, cuando éstos no se utilicen. Así también se deberán emplear gradillas
o pinzas para sostener o transportar tubos calientes.
6. Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas
calientes o ambos.
7. No deberá olfatear, probar reactivos o ambos, o las soluciones, no se debe
mirar nunca el interior de un tubo de ensaye que se esté calentando, ni apuntar
hacia alguna persona porque el contenido podría proyectarse en cualquier
momento. La misma precaución debe tomarse cuando se mezclan reactivos o
se agiten vigorosamente los tubos.
8. Utilizar gafas de seguridad cuando se manejen ácidos, hielo seco o sustancias
desconocidas.
9. Utilizar pipetores o perillas de goma para la medición de los líquidos corrosivos,
ácidos, bases, sustancias volátiles, venenos, entre otros. No aspirar con la
boca.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
10. Evitar agregar agua sobre ácidos para evitar quemaduras por proyección. Para
diluir cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y NUNCA agua sobre
ácido. Emplear baño de hielo o baño de agua fría para preparar diluciones
diluidas de ácidos.
11. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames.
12. Lavarse las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.
13. Reportar inmediatamente el profesor del laboratorio cualquier accidente o
lesión que suceda para que se tomen las medidas apropiadas.
ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE
1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojo o boca, se
recomienda enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir
su acción por dilución, para ello existen en el laboratorio las tarjas, regaderas y
lavaojos.
2. En caso de ingestión de corrosivos, NUNCA provocar vómito. Si existe
ingestión de ácidos hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato
de sodio (dos cucharadas soperas en dos vasos de agua); en caso de
soluciones cáusticas (hidróxido de sodio p potasio), ingerir una cucharada de
vinagre o 25 ml. De jugo de limón en agua.
3. Si existe derramamiento de un ácido, neutralizar agregar bicarbonato de sodio
y en caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar
agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza.
4. Al ingerir otras sustancias químicas, hacer vomitar a la persona accidentada,
vigilar que exista una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas
permeables mientras se traslada al hospital.
5. En caso necesario llamar a los teléfonos de emergencia 066.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
RECOMENDACIONES PARA TENER ÉXITO EN LAS PRÁCTICAS
1. El alumno leerá la práctica completa y la discutirá con el profesor entes de la
realización de la misma.
2. Los útiles y aspectos personales deberán ser colocados en el lugar indicado.
3. El asa bacteriológica deberá estar estéril antes y después de la práctica.
4. Antes de preparar las mezclas de reacción, etiquetará apropiadamente cada
uno de los tubos con marcador indeleble.
5. Por ningún motivo alterará el orden de adición de reactivos de la práctica.
6. Utilizar agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar
agua.
7. Mantener los frascos de reactivos tapados, para evitar contaminación,
evaporación de los mismos o ambos.
8. Utilizar solo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los
mismos.
9. Evitar regresar excedentes de reactivos al frasco de donde se extrajo el mismo.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 1
CONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO Y MEDIDAS DE
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• El alumno conocerá el material básico y su empleo en el laboratorio
de bacteriología.
• Conocerá las medidas de seguridad que se deben de guardar al
trabajar en un laboratorio de bacteriología, para evitar accidentes.
INTRODUCCIÓN
El éxito de los procedimientos de laboratorio para proporcionar datos que
conduzcan al diagnóstico exacto de una enfermedad depende de muchos
factores. Los tres mas importantes son: 1) selección y conservación de un número
adecuado de muestras tomadas asépticamente de los sitios anatómicos más
convenientes durante el estadio adecuado de la enfermedad, para el aislamiento o
demostración del o de los patógenos, 2) toma de muestras de suero sanguíneo al
tiempo en que el título de anticuerpos es adecuado para el diagnóstico y 3). el
conocimiento y la habilidad de los laboratoristas quienes deben seleccionar los
procedimientos adecuados por su experiencia en enfermedades similares bajo
sospecha y el poderlos aplicar con las precauciones y controles adecuados.
Los laboratoristas deberán tener plena confianza en sus equipos. medios de
cultivo, cultivos celulares, animales de laboratorio y embriones de pollo, así como
en sus reactivos, soluciones, antígenos, antisueros y colorantes.
Para que esta confianza sea permanente, es necesario que se ejerza un estricto
control de calidad y de esterilidad microbiológica Además el laboratorio como
institución deberá actualizar frecuentemente a su personal, mantener un inventario
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
fácilmente disponible de materiales y probar regularmente todo el equipo. El viejo
adagio “Lo que bien comienza bien acaba” se aplica perfectamente al trabajo de
laboratorio. Sin embargo, el precio que hay que pagar por el éxito es una
constante preparación y atención a los pequeños detalles.
Existen muchas trampas, en la que caen los incautos. Se pueden obtener
resultados falsos e inútiles si los materiales y equipos no han sido esterilizados
adecuadamente. Los cultivos celulares y de microorganismos, pueden inhibirse o
destruirse si la cristalería, los tapones y los medios de cultivo se contaminan con
detergentes o restos de compuestos tóxicos; las placas y los efectos citopáticos
observados en los cultivos celulares pueden deberse a las infecciones latentes
que pueden reactivarse, los cultivos puros se pueden contaminar y en los pases
subsecuentes se pueden perder por el crecimiento de los microorganismos
contaminantes, cuando los antisueros para diagnóstico se preparan en animales
que no han sido convenientemente probados, pueden contener anticuerpos contra
otros antígenos que no fueron inoculados y dar reacciones que resultan en
diagnósticos equivocados.
Cuando se hacen tinciones pueden aparecer artificios que se confunden
con bacterias, hongos o cuerpos de inclusión.
Verdaderos desastres ocurren por accidentes o por descuido en las
medidas de seguridad en el laboratorio de bacteriología, así pues, se pueden
infectar los propios laboratoristas, se pueden escapar los agentes infecciosos e
infectar a los animales de la vecindad y las enfermedades se pueden diseminar
por medio de productos biológicos contaminados. Otro desastre potencial puede
ocurrir por la incapacidad de reconocer o sospechar de una enfermedad exótica a
tiempo para evitar su diseminación. Para el clínico de campo y el laboratorista, una
historia clínica adecuada y la información acerca de las enfermedades que afectan
a la población animal bajo estudio, son de gran ayuda en la evaluación primaria de
la enfermedad que se trata de diagnosticar.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Todos los laboratorios de microbiología deben extremar las precauciones al
trabajar con agentes infecciosos para evitar una o más de las siguientes
eventualidades:
1) infección accidental o contaminación cruzada dentro del laboratorio que
nulificaría o confundiría los resultados experimentales.
2) contaminación o diseminación de la infección a granjas adyacentes,
comunidades o zonas amplias
3) infección del personal del laboratorio; y
4) difusión de la infección a través de la liberación de productos biológicos.
Probablemente todos los laboratorios de microbiología han sufrido
contaminación cruzada, ya sea como contaminaciones mezcladas en los cultivos
bacterianos, o como infecciones indeseadas o mixtas en animales y cultivos
celulares. Los reajustes para corregir estas faltas son muy costosos y causan
pérdidas de tiempo.
Centraremos nuestra atención a las medidas de seguridad que se aplican en un
laboratorio por las necesidades presentes.
⇒ La desinfección de las mesas o área de laboratorio pueden incluir todas o
algunas de las medidas siguientes, de acuerdo al agente infeccioso involucrado:
1. Lavado con agua corriente para desechar excretas, restos de alimento y polvo;
2. Cepillado de toda el área con solución detergente;
3. Enjuague del detergente;
4. Aplicación de aerosoles de un desinfectante adecuado para el germen o
inundación del piso con desinfectante si se considera necesario;
5. Desinfección y desalojo de objetos innecesarios;
6. Enjuague del desinfectante
En el caso de agentes infecciosos de gran peligro para la salud humana, se puede
iniciar el procedimiento con la esterilización gaseosa. El vapor de formaldehído es
un desinfectante económico y práctico que puede usarse en habitaciones y
gabinetes cerrados.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
⇒ Las manipulaciones de las agujas para inoculación, las asas bacteriológicas, las
pipetas, las jeringas, las centrífugas, producen partículas de aerosoles cargadas
con virus y bacterias que pueden ser inhaladas e infectarte, por lo que antes y
después de su uso deben de ser esterilizadas. Por lo que se recomiendan las
siguientes técnicas generales para todos los microorganismos.
Mantener el área de trabajo limpia y ordenada y que ofrezca protección si hay
derrames o goteo de microorganismos.
Desinfectar el área de trabajo y desinfectar o esterilizar todos los equipos que
entraron en contacto con microorganismos o que potencialmente están
contaminados. Es una buena práctica al volver a esterilizar los objetos que
estuvieron en el área de trabajo, aun cuando no se hayan utilizado, antes de
colocarlos en el área de materiales estériles.
Etiquetar claramente todas las preparaciones. El material que se va a congelar
deberá guardarse en envases que resistan la congelación y descongelación ya
que es difícil desinfectar los congeladores.
Siempre que sea posible, los tubos o matraces que contengan material infeccioso
deberán ser trasladados de tal forma que el fondo descanse sobre la palma de la
mano.
El traslado de material infeccioso hacia las áreas de depósito deberá ser con
mucho cuidado.
Utilizar bata y guantes de hule cuando se manipule material infeccioso.
Desinfectar todas las partes expuestas al final de la operación.
Evitar pipetear directamente con la boca cualquier material infeccioso o tóxico. Se
usarán sólo pipetas con tapón de algodón. Nunca soplar líquidos contaminados
que queden como remanentes en las pipetas.
Antes de centrifugar, revisar los tubos para detectar cualquier fisura en ellos.
Utilizar únicamente jeringas que sellen sobre la cabeza de la aguja.
PARTICULARIDADES
∗ La bata será la vestimenta de protección que utilizarás en éste laboratorio
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
∗ Desinfectarás cada día de práctica la cubierta de las mesas.
El espacio físico y todo lo utilizado durante la práctica lo dejarán LIMPIO (en el
caso de cultivos bacterianos los depositarás en el área de material y medios
contaminados) y ORDENADO.
Con el propósito de evitar accidentes en este Laboratorio todo alumno que
conscientemente o por negligencia no acate la normatividad estipulada será
sancionado con la suspensión de la entrada al mismo.
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 2
TINCIÓN DE GRAM
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• El alumno realizará la técnica de tinción de Gram con la
modificación de Reed.
• Diferenciará las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
• Explicará las diferencias estructurales de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIÓN
En 1884 el médico Danés, Christian Gram, desarrolló un método de tinción
que lleva su nombre y que es de valiosa utilidad en cualquier Laboratorio de
Bacteriología. La técnica, además de revelar detalles referentes a la forma y
agrupación bacterianas como cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a
las bacterias en dos grandes grupos: GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS.
Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de peptidoglicano
responsable de la rigidez característica de la pared. Sin embargo, existen
diferencias estructurales en lo que respecta a las capas más externas. Así en las
Gram Negativas, existe una membrana externa cuya constitución química es
similar a la de cualquier otra membrana biológica (fosfolípidos y proteínas) pero
que posee además un alto contenido de lipopolisacáridos (endotoxina).
Durante el proceso de tinción, tanto las bacterias Gram positivas como las
Gram negativas, toman el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente
decolorante, la pared de las bacterias Gram positivas sufren una deshidratación
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
que impide la salida del colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el
agente decolorante destruye la membrana externa, incrementando así su
permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario.
Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fácilmente en
las bacterias Gram positivas debido a la deshidratación de su pared; además de
que estas bacterias quedaron previamente teñidas con el colorante primario. Por
el contrario las bacterias GRAM (-) se tiñen fácilmente con el colorante de
contraste. El resultado final es que las bacterias Gram (+) se tiñen de color violeta
y las Gram (-) de rojo.
La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la
identificación de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos
bacterianos en los cuales la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, por
ejemplo: las espiroquetas, los micoplasmas, las micobacterias, las clamidias y las
riquetsias.
El método de la tinción de Gram ha sufrido varias modificaciones y algunas
de estas son incluso mejores que el método original.
Los objetivos principales para modificar la tinción han sido:
1. Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que este se
deteriora rápidamente.
2. Reducir el tiempo requerido para completar la técnica.
En esta práctica se utilizará la técnica de tinción de Gram modificada por
Reed, la cual cumple con los objetivos antes señalados.
MATERIAL. Laminillas
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
Microscopio
Mechero Bunsen
Aceite de Inmersión
Cultivo de bacterias en medio líquido y sólido
Agua destilada
Colorantes para la tinción de Gram.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PREPARACIÓN DE UN FROTIS FIJO PARA TINCIÓN.
Antes de teñir, se debe “fijar” el material que se va a observar. Los
portaobjetos o laminillas que se empleen para realizar las extensiones deben estar
limpios y bien marcados para su identificación y para la delimitación del área en
que hay que colocar la muestra, el portaobjetos puede dividirse en varias
secciones con un lápiz graso y colocar varias extensiones en una misma laminilla,
a condición de que todas se vayan a teñir de la misma manera.
PROCEDIMIENTO:
• La técnica para realiza el frotis bacteriano es variable, si el cultivo se encuentra
en medio sólido se procederá a colocar una gota de agua destilada en el
portaobjetos y con el asa se tomará una asada del cultivo, se mezclará bien. Si
el cultivo se encuentra en medio líquido, tomar con el asa una pequeña gota de
este cultivo, colocarlo en el portaobjetos y se extiende.
• Al extender la gota sobre el portaobjetos formar una capa fina, frotis demasiado
gruesos NO SIRVEN.
• Secar los portaobjetos al aire o manteniéndolos sobre la llama del mechero de
Bunsen.
• Cuando se haya secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama
del mechero con la cepa hacia arriba, teniendo cuidado de no aplicar el calor en
forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y la estructura de los
microorganismos que se van a teñir. (Ver la figura 2)
No es el único método de fijación, pero este será el utilizado en el transcurso de
estas prácticas.
NOTA: Es importante recordar que la fijación por calor puede no matar las
bacterias, por lo que todas las laminillas deben de ser tratadas con el respeto y
precaución inherentes a todo objeto presuntamente patógeno.
Existen algunas variantes que pueden afectar los resultados de la tinción de Gram,
por ejemplo:
a) Las bacterias en los cultivos viejos (más de 24 Horas de incubación) liberan
enzimas por auto lisis. Estas atacan a la pared celular de las bacterias y
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
modifican sus propiedades estructurales, propiciando que las bacterias Gram
positivas se tiñan de rojo. Esta misma situación se puede presentar al observar
frotis directo de los tejidos de animales infectados.
b) Una decoloración excesiva puede ocasionar que las bacterias Gram positivas
se tiñan de rojo.
c) Una decoloración deficiente puede ocasionar que las bacterias Gram (-) se
tiñan de violeta.
d) Los frotis gruesos pueden teñirse irregularmente.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Medio sólido
Medio líquido
Fig. 2 Preparación de un frotis “fijo” para tinción.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
1 Cubre el frotis con la solución de
cristal violeta (colorante primario).
Cubrir el área del frotis, una o dos
gotas son suficientes. Agregar una
cantidad igual
bicarbonato
de la solución de
de
sodio,
la
cual
alcaliniza y acelera la tinción de las
células. Deja actuar esta mezcla
por 15 segundos
Lava con agua corriente (de la llave) a
chorro de agua. Sacude la laminilla para
eliminar las gotas gruesas de agua.
2 Aplicar la solución de Iodo (Lugol,
mordente) y déjala actuar durante
15 segundos
Lava con agua corriente de la llave.
Sacude el frotis
Procedimiento para la técnica de GRAM
- 20 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
3 Aplicar el Alcohol-Acetona (Agente
decolorante)
durante
3
a
5
segundos
Lava nuevamente con agua de la llave.
Sacude la laminilla
4 Agrega
la
Fucsina
básica
(colorante de contraste) y déjala
actuar durante 15 segundos.
Lava con agua corriente de la llave
Seca el frotis por presión con una toalla
absorbente o al aire, y observa al
microscopio con el objetivo de inmersión
(100X)
¡RECUERDA!, las bacterias Gram (+) se tiñen de color violeta mientras que
las Gram (-) de rojo
.
- 21 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRUEBA DE HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) AL 3%
La prueba de KOH al 3% nos permite ratificar los resultados de la tinción de Gram.
Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3% y con
el asa hacer en ella una suspensión de colonias de la bacteria problema,
mezclando con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos. Si al separar el asa
de la mezcla se forma una hebra viscosa, esto indica que se trata de bacterias
Gram (-). Si la hebra no se forma, se trata entonces de bacterias Gram (+). (Ver la
siguiente figura)
⇒ Gram Negativas; al separar el
asa de la mezcla queda entre
ellas una hebra viscosa dentro
de los 60 segundos a 3 minutos.
⇒ Gram positivas no existe dicha
viscosidad
Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente:
1) ¿Cuál fue la reacción al método de Gram de cada uno de los
microorganismos con que trabajaste?
2) ¿Qué morfología presentaban?
3) ¿Cuál es la utilidad diagnostica de la técnica de Gram?
4) Comparar los tamaños
de
diferentes bacterias
entre sí
y con las
levaduras.
5) Identificar las formas y agrupaciones de las bacterias
6) Dibuja y colorea tus observaciones
- 22 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________
- 23 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 3
TINCIÓN PARA BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES
(B A A R)
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• Realizará la técnica de tinción de Zielhl-Neelsen para teñir frotis fijos
a partir de cultivos bacterianos.
• Distinguirá las bacterias ácido-alcohol resistentes de las no ácidoalcohol resistentes.
• Conocerá las características estructurales de la pared celular de las
bacterias ácido alcohol resistentes.
INTRODUCCIÓN:
Las bacterias
ácido
alcohol
resistentes
forman
un
grupo
de
microorganismos se definen con base en sus propiedades tintoriales. Son
relativamente impermeables a los colorantes básicos, pero una vez teñidos
retienen el colorante con tenacidad, resistiendo la decoloración con solventes
orgánicos acidificados (por ejemplo alcohol-ácido).
La ácido-alcohol resistencia está determinada por la composición de la pared
celular, la cual además de contener peptidoglicano está constituída por un alto
porcentaje de glucolípidos hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son
los ácidos micólicos. La presencia de estas capas hidrofóbicas previenen la
penetración de soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos
microorganismos no pueden teñirse con los métodos convencionales (tinción de
Gram).
- 24 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Uno de los métodos de tinción mas comúnmente usados para demostrar la
ácido-alcohol resistencia es el método de Ziehl-Neelsen. En este método la
penetración del colorante primario se facilita debido a que este se encuentra
disuelto en fenol ya que es aplicado en presencia de calor.
Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana, este se combina
con las mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria
(ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y además reacciona con ácidos micólicos libres,
lo cual hace que la pared celular se vuelva aun más hidrofóbica.
Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol resistentes
como las no ácido-alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin
embargo, al aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcoholácido, este no solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido-alcohol
resistentes se decoloran fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar el
colorante de contraste. El grupo de bacterias ácido-alcohol resistentes está
representado principalmente por el género Mycobacterium. Algunas especies de
este género juegan un papel muy importante como agentes etiológicos de la
tuberculosis y otras enfermedades crónicas granulomatosas tanto en el hombre
como en los animales.
En el análisis de un frotis de material clínico sospechoso de contener
bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo ácido- alcohol resistente puede
tener valor diagnóstico, ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin
embargo, la interpretación del hallazgo de un solo bacilo ácido-alcohol resistente
debe hacerse con cautela y con base en la historia clínica y otras pruebas de
laboratorio, ya que la presencia de especies saprofitas de Mycobacterium podría
conducir a un diagnóstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de
Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como
bacterias ácido-alcohol resistente.
MATERIAL.
Laminillas
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
- 25 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Microscopio
Platina caliente
Trozos de papel filtro
Aceite de Inmersión
Cultivo de bacterias
Agua destilada
Colorantes para la tinción de Ziehl-Neelsen.
PROCEDIMIENTO:
Utilizando una laminilla, prepara un frotis fijo (ya se te indicó el
procedimiento anteriormente) a partir del cultivo que vas a trabajar.
Tíñelos siguiendo la técnica de Ziehl-Neelsen, que a continuación será
descrita.
TÉCNICA DE LA TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN.
a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra
solo el frotis y no toda la laminilla.
b) Humedece el papel con la Fucsina Fenicada (colorante primario). El frotis no
deberá secarse, así que añade continuamente colorante para evitar esto.
c) Permite la emisión de vapores durante 5 minutos. Retira el frotis de la platina,
quítale el papel, déjalo enfriar y lava con agua corriente de la llave.
d) Decolora con el Alcohol-Ácido, permitiéndole actuar durante 2 minutos. Es
importante realizar la decoloración perfectamente, ya que de no ser así se
corre el riesgo de observar reacciones falsas positivas.
Lava con agua corriente de la llave.
e) Contrasta con azul de metileno de Loeffler durante un minuto.
Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo
de inmersión.
RECUERDA: Los microorganismos ácido -Alcohol-Resistentes se tiñen de color
ROJO. Los no ácido-Alcohol-Resistentes de color AZUL.
Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente:
- 26 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
1. Escribe la composición química de la pared celular de bacterias Gram
positivas, negativas y ácido alcohol resistentes.
2. ¿En que tipo de muestras clínicas
es recomendable realizar frotis
directos y teñirlos mediante la técnica de Ziehl- Neelsen?
3. Dibuja y colorea tus observaciones.
4. ¿Cuál
de las dos cepas bacterianas resultó ser ácido alcohol
resistente?
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________
- 27 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 4
TINCIÓN PARA ESPORAS
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• Realizará La técnica de tinción de Schaeffer y Fulton para teñir frotis
fijos a partir de cultivos bacterianos.
• Mencionará las principales características estructurales de la
espora bacteriana, así como su función.
• Distinguirá
y clasificará a las esporas bacterianas por su
localización en la célula bacteriana.
INTRODUCCIÓN:
La espora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rígida,
que es formada por algunos géneros bacterianos. Los géneros bacterianos de
interés en Medicina Veterinaria que son capaces de esporular son Bacillus y
Clostridium. Estos responden de manera diferente al efecto que las condiciones
ambientales tienen sobre la formación de la espora. Por ejemplo; el B. anthracis,
microorganismo aerobio estricto, solamente puede formar esporas en condiciones
de aerobiosis, de manera similar, los bacilos del género Clostridium anaerobios,
no forman esporas en aerobiosis.
La esporulación es un mecanismo especializado cuya función es encerrar
un genoma en un vehículo aislante que le permita la germinación posterior en un
medio adecuado. Las esporas bacterianas mantienen un estado de criptobiosis o
vida latente, con escasa actividad metabólica.
- 28 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Así mismo, muestran una marcada resistencia al calor, a la desecación, a la
congelación, a diversos agentes químicos y radiaciones.
La espora bacteriana está compuesta por seis capas de afuera hacia
adentro:
a) Exosporium
b) Capa
c) Corteza
d) Pared
e) Membrana interna
f) Centro (Protoplasma)
La capa está constituida por proteínas parecidas a la queratina, las cuales vuelven
impermeable a la espora y la protegen de la acción de substancias químicas. El
centro contiene dipicolinato de calcio, el cual aunado al alto estado de
deshidratación del protoplasma, es responsable de la marcada resistencia que
muestra la espora al calor y a la desecación.
Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse
tanto intracelularmente, como fuera de la bacteria (célula vegetativa). Por su
localización dentro de la célula pueden ser centrales, subterminales o terminales
(como lo representa la Fig. 4) y presentan además variación en su tamaño. Estas
características son de utilidad taxonómica para la identificación de algunas
especies de los géneros capaces de esporular.
En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen
como cuerpos refringentes sin teñir. Para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer
y Fulton en la que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del colorante
primario (verde de malaquita) y una ves que este ha penetrado, al lavar la
preparación y agregar un colorante de contraste (safranina), las células
vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece teñida de VERDE.
- 29 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Fig. 4 tipos de esporas bacterianas: terminal, subterminal, central, esférica y
oval
MATERIAL.
Laminillas
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
Microscopio
Platina caliente
Mechero
Aceite de Inmersión
Cultivo de bacterias esporuladas
Agua destilada
Colorantes para la tinción de esporas
PROCEDIMIENTO:
Prepara dos frotis fijos a partir del cultivo que tienes en la mesa de trabajo. Uno de
los frotis será teñido utilizando la tinción de Gram y el otro será teñido con el
método de Schaeffer y Fulton como se describe a continuación:
a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que
cubra solo el frotis y no toda la laminilla.
b) Aplica Fulton A (verde malaquita) y calienta en la platina, hasta la emisión
de vapores, durante un minuto (recuerda que el colorante no debe
- 30 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
evaporarse, por lo tanto a añadirás continuamente colorante para evitar
esto).
c) Lava con agua corriente de la llave.
d) Contrasta con Fulton B (safranina) durante 15 segundos.
e) Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el
objetivo de inmersión (100X).
f) El método de tinción de Schaeffer y Fulton puede practicarse en frío,
permitiendo actuar al Fulton A durante 10 minutos.
RECUERDA: Con la tinción de Gram las esporas se observan como cuerpos
refringentes SIN TEÑIR, mientras que con el método de Schaeffer y Fulton las
esporas se observan de color VERDE y las formas vegetativas se ven ROJAS.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué diferencias encontraste entre el frotis teñido por el método de
Gram y el frotis teñido por el método de Schaeffer y Fulton?
2. ¿Qué posición tenía la espora dentro del cuerpo bacteriano y qué
forma tenía ésta?
3. ¿Cuál es la importancia de las esporas bacterianas?
4. ¿Cuando se forman las esporas bacterianas?
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
- 31 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________
- 32 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 5
TINCIÓN DE CÁPSULAS
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• El alumno realizará las técnicas de tinción de Maneval y tinta china
para poner de manifiesto la presencia de cápsula bacteriana.
• Distinguirá la presencia de cápsula en un frotis teñido con la técnica
de Maneval y con Tinta China.
• Describirá la composición química y función de la cápsula
bacteriana.
INTRODUCCIÓN:
Muchas bacterias están rodeadas por compuestos químicos superficiales
que se tiñes con mucha dificultad y que ha sido denominada cápsula. La mayoría
de las cápsulas bacterianas están constituidas químicamente por polisacáridos,
aunque en el género Bacillus consiste en un polipéptido del ácido D-Glutámico.
La cápsula desempeña un papel importante en la virulencia de algunas
bacterias patógenas, ya que les confiere propiedades antifagocíticas que
interfieren con los mecanismos de defensa del organismo.
El grosor de la cápsula varía no solo de una especie de microorganismos a
otra, sino que también entre las diferentes cepas de la misma especie y
dependiendo de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentra el cultivo.
El diámetro de la cápsula puede ser varias veces mayor al diámetro del cuerpo
celular, como en el caso de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae.
Por el contrario, en otras bacterias su diámetro puede ser mucho menor,
- 33 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
poniéndose de manifiesto solamente mediante procesos bioquímicos y serológicos
como en el caso de algunas cepas de Pasteurella spp.
Las bacterias con cápsula, en los medios de cultivo, forman colonias lisas y
mucoides mientras que las bacterias no capsuladas producen colonias rugosas.
Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teñidos con las
técnicas usuales porque son incapaces de retener el colorante y porque los
procesos de fijación al calor y lavado las disuelven. Por lo tanto l mejor método
para observarlas es el de las tinciones negativas.
La Fig. 5 nos pone de manifiesto la presencia de cápsula bacteriana
mediante la tinción negativa con tinta china.
Frotis delgado
Frotis grueso
Fig. 5
Demostración de cápsula bacteriana, utilizando el método de Tinta
China.
Los siguientes ejemplos son géneros bacterianos y micóticos que pueden
presentar cápsula.
a)
b)
c)
d)
e)
Klebsiella
Pasteurella
Bacillus
Escherichia
Yersinia
a)
b)
c)
d)
e)
Streptococcus
Haemophilus
Neisseria
Moraxella
Cryptococcus
- 34 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
• MATERIAL.
Laminillas
Cubreobjetos
Lápiz graso
Asa bacteriológica (Asa)
Microscopio
Mechero de Bunsen
Aceite de Inmersión
Pulque
Tinta China filtrada
Colorantes para la tinción de Maneval
PROCEDIMIENTO:
Determina la presencia de cápsula bacteriana utilizando el pulque que has
traído, con los métodos de tinción negativa que a continuación se describen:
TINCIÓN NEGATIVA CON EL MÉTODO DE MANEVAL MODIFICADO.
Coloca una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla.
Toma un poco de pulque y mézclalo con la gota de Maneval A, haciendo
movimientos giratorios con el asa.
Extiende la suspensión de manera que quede una película delgada.
Deja secar la preparación a temperatura ambiente. NO FIJES EL FROTIS AL
CALOR.
Cubre la preparación con Maneval B (Fucsina ácida) y deja que actúe durante un
minuto. Lava suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis mediante
un ligero contacto con una toalla de papel. Observa al microscopio Con el objetivo
de inmersión.
Las cápsulas se observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa
de un color oscuro y las células bacterianas de color rojo.
TINCIÓN NEGATIVA CON TINTA CHINA.
En una laminilla coloca una gota de tinta china y una gota de pulque, suspéndelo
homogéneamente.
Coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y observa al microscopio.
- 35 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
La cápsula se observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos,
gracias al contraste proporcionado por la coloración negra tanto del espacio
intercelular como de las células microbianas
Cuestionario
Anota tus observaciones tomando en consideración lo siguiente:
1) ¿Por qué este tipo de preparaciones no deben fijarse al calor?
2) ¿Cuál de los dos métodos puso mejor de manifiesto la cápsula bacteriana?
3) Comparar el grosor de la cápsula con el diámetro de la célula.
4) Relacionar el tamaño de la cápsula con la viscosidad del medio.
5) ¿Cuál es la función de la cápsula en una infección bacteriana?
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________
- 36 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 6
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• El alumno explicará el proceso de esterilización mediante el método
de calor seco y calor húmedo.
• El alumno aplicará los conocimientos teóricos seleccionando el o
los métodos de esterilización mas adecuados para esterilizar cada
uno de los materiales que se le presentan.
INTRODUCCIÓN:
La esterilización es un proceso que destruye todo tipo de vida en el material o
sustancia de que se trate. Esto puede realizarse por métodos físicos o químicos.
MÉTODOS FÍSICOS.
Dentro de los métodos físicos de esterilización pueden mencionarse:
Calor Húmedo
I.- CALOR
Calor seco
Ebullición
A 100 ºC por 1015 minutos.
Vapor a presión A 121 ºC a 15 lb.
(autoclave)
de presión por
15 minutos.
Flameado
Incineración
Aire
caliente A 160-170 ºC, de
(Horno Pasteur) 60-120 minutos
II. FILTRACIÓN
Filtros de columna
Filtros de membrana
Con poros de
0.8, 0.6, 0.45,
0.2 y 0.1
µm
de
diámetro.
- 37 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
III. RADIACIÓN
Radiaciones ionizantes Rayos α β,γ y X
Radiaciones
ionizantes
no Rayos
ultravioleta
infrarrojos.
e
A continuación se describirán cada uno de estos métodos.
I. CALOR.
El efecto esterilizante del calor se debe a que se desnaturaliza (coagula) las
proteínas. El factor que más influye cuando s esteriliza por éste método es la
presencia o ausencia de humedad, ya que es ésta la que determina la temperatura
exacta a la que mueren los microorganismos. En términos generales, la
esterilización por calor húmedo es más eficaz.
Ebullición: Por este proceso las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias
mueren en 10-15 minutos a una temperatura de 90-100 ºC. Sin embargo, las
bacterias esporuladas requieren de mayor tiempo de exposición. La ebullición
puede utilizarse para esterilizar material de cristalería, instrumental de cirugía,
jeringas, recipientes, etc.
Vapor a Presión. La esterilización por medio de vapor a presión se realiza en un
recipiente herméticamente cerrado (autoclave) (ver figura 6) en el que se produce
presión de vapor de agua, lo cual permite lograr temperaturas mayores a las que
se obtienen en la ebullición. Durante este procedimiento es importante una
completa evacuación del aire del recipiente, ya que la temperatura de la mezcla de
Aire-Vapor es más baja que la del vapor puro. A este proceso de eliminación del
aire se le denomina “purga del autoclave” y se realiza a través de una válvula de
escape que puede variar de acuerdo con las especificaciones del modelo de
autoclave que se utilice.
Las autoclaves deben de tener un manómetro que indique la presión interna. La
presión que debe alcanzarse es de 15 libras /1.1 Kg/cm2), y a esta presión la
temperatura alcanzada es de 121 ºC. Para lograr un efecto esterilizante deben
mantenerse la presión y temperatura mencionada durante 15 minutos por
- 38 -Pag -
lo
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
menos, debiendo aumentarse el tiempo cuando el volumen de material es grande.
Después de este periodo, el autoclave debe dejarse enfriar hasta que la presión
en el manómetro marque cero libras.
El autoclave es de utilidad para destruir tanto formas vegetativas como
esporas bacterianas presentes en substancias termoestables, material de cirugía
y curación, ropa, material de cristalería, filtros, etc.
Flameado. Consiste en la aplicación directa de la flama sobre el material a
esterilizar. El material puede calentarse al rojo blanco o sumergirse en alcohol y
pasarlo por la flama para que éste se consuma. Es utilizado para asas
microbiológicas, espátulas, pinzas, tijeras, etc. La Fig. 6 muestra el flameado como
método de esterilización.
Incineración. Es la forma más eficaz y rápida para la destrucción de hisopos
contaminados, material de curación, muestras de desecho, así como cadáveres de
animales infectados.
Aire caliente. La esterilización por medio de aire caliente se realiza en una cámara
(horno Pasteur) (Ver figura 6) que puede compararse con un horno doméstico. En
el debe alcanzarse una temperatura mínima de 160 ºC durante l Hr. por lo menos.
Es un requisito indispensable que el aire caliente circule para que cada objeto a
esterilizar alcance la temperatura deseada y ésta destruya a todos los
microorganismos tanto esporulados como no esporulados. El Horno Pasteur es
ampliamente usado en la esterilización de material de cristalería y material de
cirugía. NO ES RECOMENDABLE para substancias líquidas, algodón, telas y
plásticos, ya que estos materiales tienden a deteriorarse por deshidratación a
inclusive pueden carbonizarse.
II. FILTRACIÓN.
Es la remoción mecánica de los microorganismos presentes en una substancia
líquida. Para esto se utiliza un tamiz con poros de un diámetro de menor tamaño al
de los microorganismos que se desean remover. Los filtros, deben ser
esterilizados previamente a su uso y generalmente en el autoclave.
La filtración es particularmente útil para la esterilización de soluciones de
antibióticos y líquidos termolábiles.
- 39 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
III. RADIACIONES
De las radiaciones que se utilizan con fines de esterilización existen dos grupos:
a) Ionizante (alta energía)
b) No ionizantes (baja energía)
Radiaciones ionizantes: este tipo de radiaciones son de corta longitud de onda y
actúan ionizando moléculas a su paso. Son altamente letales a su efecto sobre al
ADN. Ejemplo de este tipo de radiaciones son los rayos alfa (
gamma ( γ
α ), beta ( β
),
) y equis ( X ).
Radiaciones no ionizantes: Dentro de esta categoría se incluyen los rayos
infrarrojos y los rayos ultravioleta. Los primeros son de longitud de onda más larga
que la luz visible y se absorben en forma de calor. Su acción esterilizante se debe
a la desnaturalización de proteínas generada por el calor.
Los rayos ultravioleta tienen una longitud de onda más corta que la luz visible y
provocan la muerte de los microorganismos debido a que al ser absorbidos
ocasionan “lesiones” en el ADN y en algunas proteínas de la célula microbiana.
Las radiaciones, tanto ionizantes como no ionizantes, se utilizan para esterilizar
recintos cerrados, materiales plásticos, materias primas para alimentos de
animales, papel, hojas delgadas de metal y algodón, entre otros.
MÉTODOS QUÍMICOS.
Los métodos químicos par esterilización utilizan agentes como el óxido de etileno
y l formaldehído, ambos son gases y se les usa para esterilizar recintos cerrados
como quirófanos, laboratorios, incubadoras y nacedoras. El óxido de etileno es
también utilizado en la esterilización de materiales sólidos termolábiles (materiales
plásticos).
Desinfección.
La desinfección involucra agentes químicos que generalmente no tienen efecto
esterilizante,
aunque
destruyen
virtualmente
todos
los
microorganismos
patógenos. Solo algunos desinfectantes pueden tener efecto esterilizante cuando
se usan apropiadamente, tal es el caso del formaldehído, el fenol, el
glutaraldehído, el óxido de etileno, el peróxido de hidrógeno y el ácido paracético.
- 40 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Hay desinfectantes que, debido a que no produce daño celular, pueden aplicarse
sobre superficies corporales. A estos desinfectantes se les conoce como
antisépticos, por ejemplo el alcohol etílico, el iodo, la tintura de benzalconio, el
cloruro de benzalconio, el mercurocromo, etc.
Los desinfectantes pueden clasificarse según su mecanismo de acción en:
1. Detergentes
catiónicos
2. Alcoholes
3. Fenoles
4. Halógenos
5. Agentes alquilantes
6. Agentes oxidantes
7. Colorantes
8. Metales pesados
Ejemplo:
Cloruro de benzalconio
Alcohol etílico
Fenol
Cloro, Iodo
Formaldehído, óxido de etileno
Peróxido de hidrógeno, ácido paracético
Violeta de genciana, azul de metileno
Soluciones de cobre, plata y mercurio.
Flameado
Vapor a presión
Autoclave
Flameado
Aire caliente
Horno Pasteur
Fig. 6 Equipo que puede ser utilizado para la esterilización de materiales.
- 41 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
MATERIAL:
Autoclave
Horno Pasteur
Jeringas
Hisopos contaminados
Cultivos bacterianos en medio sólido y líquido
Asa microbiológica
Espátulas
Alcohol
Tijeras
Guantes de latex
Cajas de Petri
Tubos de ensaye
Pipetas
Hisopos
Mortero
PROCEDIMIETOS:
1. En tu mesa de trabajo encontrarás material para esterilizar, observa,
clasifica y selecciona el método a utilizar para la esterilización de dicho
material.
2. Espera la explicación del profesor sobre algunas particularidades
previas a la aplicación del método de esterilización.
CUESTIONARIO
1.
Con base en su bibliografía y el trabajo realizado, indicar si aplicó los
métodos de esterilización adecuados para el material y medios de cultivo que
preparó
2 Indicar si el proceso de esterilización aplicado a los medios de cultivo fue
eficiente.
3
Comparar la eficacia del calor seco y del calor húmedo como medios de
esterilización.
4 Comparar la resistencia al calor de las células vegetativas de las bacterias
con la de las esporas bacterianas.
- 42 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
5 ¿Qué clase de materiales se esterilizan por lo general por filtración?
6 ¿En que se fundamenta la esterilización por tindalización?
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 7
CLASIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
• Conocerá la importancia del cultivo de bacterias “in vitro”.
• Enunciará
la
utilidad
práctica
de
los
medios
según
sus
características físicas.
• Preparará y clasificará los medios de cultivo problema.
INTRODUCCIÓN:
Para realizar el estudio de los microorganismos es necesarios recuperarlos
del habitad natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios
artificiales
que
proporcionen
sus
requerimientos
nutricionales,
a
este
procedimiento se conoce como cultivo “in vitro”.
La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de
diferentes sustancias alimenticias y principios activos en la cual intervienen
factores físicos como la temperatura, el pH, el factor redox.
Para su crecimiento todos los microorganismos requieren agua, además
deben estar presentes en forma utilizable el carbono, oxígeno, nitrógeno,
hidrógeno, calcio, fósforo y el fierro, muchos microorganismos dependen además
de oligoelementos como el magnesio, molibdeno, zinc, cobre.
Los microorganismos exigentes tienen necesidad además de factores de
crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas u otras sustancias que no
pueden sintetizar ellos mismos.
El carbono se necesita en la mayor parte de las veces en forma e
compuestos orgánicos, que luego sirven como fuente de energía, el oxígeno se
toma principalmente de la atmósfera, las necesidades de hidrógeno se cubren con
compuestos orgánicos y, en casos particulares, también a partir de compuestos
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
inorgánicos. El nitrógeno proviene de sales en forma de nitratos, nitritos o
compuestos amónicos, o de componentes más complejos como aminoácidos,
peptonas o proteínas. Los otros elementos se toman principalmente de sales.
Los medios de cultivo sintéticos están compuestos de una serie de
substancias químicas definidas exactamente, los medios de cultivo complejos
contienen diferentes extractos, hidrolizados u otros aditivos.
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LOS MEDIOS
a) Medios líquidos
Son medios que no contienen agar (agente solidificante),
son envasados en tubos, botellas y matraces.
b) Medios semisólidos
Son medios que contienen 0.5 a 0.75% de agar. Son
envasados en tubo.
c) Medios sólidos
Existen dos tipos, los que contienen 1.5% de agar y los
que contienen 3 a 7% de agar llamados medios duros.
Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos.
El agar-agar es un extracto seco gelificante, obtenido de algunas especies
de algas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y
Adanthopeltis.
En el medio de cultivo pueden estar presentes colorantes e indicadores
cuyo cambio de color será característico para un determinado intervalo de pH.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Como es lógico suponer no todos los medios de cultivo son utilizados para
el aislamiento de todas las cepas bacterianas, utilizados para el aislamiento de
todas las cepas bacterianas, en ocasiones no solo son aptos para el aislamiento
de microorganismos en general, sino que además poseen la capacidad de inhibir a
algunos y favorecer el desarrollo de otros.
Basados en el propósito para el cual son fabricados los medios de cultivo se
pueden clasificar de la siguiente manera:
MEDIOS DE CULTIVO BÁSICOS.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para
promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente.
Reciben también el nombre de medios generales y pueden ser utilizados en
análisis cuantitativos, para muestreo de medio ambiente, superficies y para
conservar cepas.
Ejemplos: Caldo nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar nutritivo. Agar
soya tripticasa.
MEDIOS ENRIQUECIDOS.
Son medios que se suplen con factores de crecimiento para el desarrollo de
bacterias y hongos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios
generalmente contienen uno o más de los siguientes ingredientes: sangre, suero,
líquido ascítico, huevo, carne, vitaminas y aminoácidos específicos, entre otros.
Ejemplos: Agar sangre, agar Sabouraud con ácido nicotínico, agar LowesteinJensen, caldo infusión cerebro corazón.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.
Son muy utilizados, sobre todo en cultivos entéricos, estos medios se utilizan para
aumentar la propagación de ciertos organismos sin favorecer a otros. Son muy
eficaces en el aislamiento de Salmonella a partir de heces.
Ejemplos: Caldo selenito de sodio, caldo selenito y cistina, caldo tetrationato,
caldo-sal-colistina, agar sangre + levadura de cerveza, agar yema de huevo con
leche.
MEDIOS SELECTIVOS.
Son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas del
cuerpo que poseen una flora normal abundante (faringe, boca, piel nariz, vagina,
etc.). En estos se incorporan substancias inhibidoras de la propagación de un
grupo de bacterias, pero permiten en cambio el crecimiento de otros grupos. Así
para el cultivo entérico, los medios usados de modo habitual contienen ciertos
colorantes e ingredientes que inhiben los organismos Gram positivos y permiten la
propagación de los bacilos entéricos Gram negativos.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Ejemplos: Agar verde brillante (VB), agar Salmonella Shigella (SS), que son
medios selectivos para Salmonella, agar Mac Conkey (Mac C), agar ENDO y agar
Eosina azul de metileno (EMB), que son selectivos para enterobacterias, agar
manitol sal (MSA), agar Staphylococcus 110 y Chapman Stone, selectivos para
Staphylococcus.
MEDIOS DIFERENCIALES.
Este tipo de medios, debido a los componentes químicos e indicadores que
contienen, permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies
bacterianas, por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios
selectivos son también diferenciales.
Ejemplos: Agar verde brillante, agar Salmonella-Shigella, agar Mac Conkey, agar
ENDO, agar eosina azul de metileno. Estos permiten diferenciar enterobacterias
fermentadoras de la lactosa (coliformes) de las no fermentadoras de la lactosa (no
coliformes).
MEDIOS PARA EL ESTUDIO DE CARBOHIDRATOS.
En los medios de cultivo, los carbohidratos y glucósidos son muy utilizados como
fuente de energía por las bacterias, y particularmente para diferenciar géneros e
identificar especies se utiliza generalmente agua peptonada como base para el
estudio de los azúcares, las soluciones de carbohidratos empleados para estas
pruebas, deben esterilizarse por filtración, ya que al calentarse los azúcares sufren
varios fenómenos, como la formación de productos de oxidación y reaccionar con
algunos otros componentes de los medios de cultivo como aminoácidos.
Ejemplos: Medio basal OF de Hugh y Leifson, medio para MR-VP y todos aquellos
en los cuales se pruebe algún azúcar en particular (agua peptonada + glucosa,
manitol, sucrosa, sorbitol, galactosa, etc.).
MEDIOS DE TRANSPORTE.
Son medios utilizados en el envío de muestras de laboratorio, algunos contienen
sustancias reductoras, o nutrientes que permiten a los microorganismos
conservarse viables hasta llegar al laboratorio.
Ejemplos: Medio de transporte de Stuart, caldo tioglicolato, medio de Carry-Blair.
MATERIAL: Diferentes medios de cultivo sintéticos
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Matraces Erlenmeyer
Mechero
Espátulas
Cajas de Petri
Autoclave
Balanza granataria
Papel aluminio
Tubos de ensaye
PROCEDIMIENTO:
Los fundamentos de preparación, distribución y esterilización de los medios
de cultivo son esencialmente iguales, utilizando las formas deshidratadas o bien
añadiendo los distintos ingredientes por separado.
Casi todos los medios de cultivo utilizables se encuentran en el comercio en
forma deshidratada y se determina simplemente la cantidad necesaria de polvo,
según las instrucciones y se añade al agua destilada necesaria. Es importante
utilizar un frasco o matraz Erlenmeyer lo suficientemente grande para que se
pueda remover o agitar bien para disolver el medio.
Una vez preparado el medio, se distribuyen recipientes adecuados mientras
están todavía calientes, los métodos de distribución de los medios disueltos en
cajas de Petri, tubos o frascos, dependen del tipo de medio y de la finalidad de su
empleo.
PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN CAJAS DE
PETRI. Ver Fig. 7
Fig. 7
Preparación de un medio de cultivo. Material necesario para la
reconstrucción de los medios de cultivo.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Pesar la cantidad requerida del medio
deshidratado utilizando un papel o papel
aluminio, evitando con éste pérdidas del
polvo sobre la balanza.
El medio se añade a una pequeña cantidad
de agua destilada o desmineralizada, fría y
se distribuye uniformemente por agitación,
enseguida añadir la cantidad restante de
agua y se homogeniza.
Se deja reposar la solución durante 10 a 15
minutos a temperatura ambiente, para que el
agar
pueda
hincharse.
Para
disolver
completamente los medios deben calentarse
a más de 95ºC.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Los medios de cultivo clarificados, se
esterilizan en autoclave utilizando la forma
convencional de 121ºC por 15´ y a 15 lb de
presión, estas constantes van a depender
del tipo de medio a esterilizar.
El medio agarificado, todavía líquido se
vierte en las cajas de Petri. El volumen es
variable y depende del tamaño de las cajas;
se recomienda 15 a 20 ml para las cajas de
31/2 plg. y de 20 a 35 ml para las cajas de 4
plg.
Si aparecen burbujas de aire en las cajas, se
eliminan pasando la llama del mechero de
Bunsen por la superficie. Las cajas se pasan
por una prueba de esterilidad que consiste
en incubarlas por 24 horas a 37 ºC.
Una
vez
transcurrido
el
tiempo
de
incubación, las cajas y los tubos son
revisados.
Aquellos
que
muestren
contaminación se desechan; por el contrario,
los libres de contaminación se refrigeran
entre 4-15 ºC hasta su utilización.
NOTA:
Para preparar las cajas de Petri, se tendrán que esterilizar primero y a
continuación se llenan con el medio, hasta una altura de 3 mm. Hay que dejar
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
enfriar el medio a unos 50-55 ºC con el objetivo de prevenir la condensación de
humedad en las paredes del recipiente.
1.- En tu mesa encontrarás diferentes medios de cultivo deshidratados
(comerciales).
2.- Clasifícalos de acuerdo a su uso.
3.- Lee las instrucciones de cada uno de los medios.
4.- Procede a prepararlos según las indicaciones de cada uno de ellos y con base
al procedimiento antes mencionado; tu profesor te
revisara los cálculos
matemáticos que realizaste.
CUESTIONARIO:
1. Menciona la clasificación de los medios de cultivo según sus características
físicas.
2. De acuerdo a la composición química. menciona la clasificación de los medios
de cultivo
3. Menciona dos ejemplos de medios selectivos y de transporte.
4. Por que es importante saber que medio de cultivo utilizar para la siembra de
bacterias y la siembra de hongos.
5. Que puntos debes de seguir para la preparación de un medio de cultivo.
6. Una vez preparados los medios en que tipo de recipientes se pueden distribuir
y por que.
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación en la practica
Puntualidad
Presentación (Bata blanca
manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRACTICA No. 8
SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
•
El alumno aplicará las técnicas de sembrado en medios de cultivo
líquidos, semisólidos y sólidos.
INTRODUCCCION
La mayoría de las bacterias pueden multiplicarse formando colonias visibles en
medios de cultivo artificiales, los cuales, una vez preparados y listos para ser
inoculados con bacterias, pueden tener varias presentaciones en cuanto a su
consistencia, la cual está determinada por la concentración de agar presente en el
medio o la ausencia del mismo. El instrumento más utilizado para la inoculación
(sembrado) de bacterias es el asa bacteriológica, la cual puede ser de alambre de
platino, nicromo u otro material parecido el cual se inserta en un mango. Existen
en el mercado asas microbiológicas calibradas para tomar un volumen constante
de inóculo, las más utilizadas con este fin son las de 0.01 y 0.001 ml, las cuales
son utilizadas para el análisis bacteriológico cuantitativo de agua y orina sin diluir.
El sembrado de cada uno de los medios de cultivo, se realiza de manera diferente
de acuerdo al fin que se persigue, el aislamiento de las bacterias de las muestras
remitidas al laboratorio, se realiza casi siempre por sembrado en la superficie de
una placa de agar en líneas paralelas por medio de un asa este procedimiento
asegura la suficiente dilución, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas que
pueden emplearse para la obtención de “ cultivos puros”, en los que se puede
realizar la identificación.
A partir del inóculo se realizan una serie de estrías como lo muestra la Fig.
8., donde se explica el procedimiento para el sembrado de medio sólido en caja
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
de Petri. Es indispensable que se emplee una técnica adecuada para la siembra
ya que la mayor parte de estas colonias aisladas serán “cultivos puros”.
- Con un asa esterilizada, se colocan dos
asadas del material cerca del borde de la
placa y se realiza una estría inicial
- Se esteriliza es asa en la llama del mechero
y se deja enfriar.
- Después, se emplea el asa para distribuir la
muestra en la placa en estrías, presionando
ligeramente sin romper el agar.
- Recordar que el
asa de inoculación deberá
esterilizarse
cada
entre
cambio
de
estría
utilizando la flama del mechero de Bunsen.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Fig. 8 Procedimiento para el “sembrado” en medio sólido.
- A partir del extremo de la primera estría
se realiza una segunda y así sucesivamente
hasta completar las cuatro estrías.
- Al concluir el sembrado en la placa, esterilizamos
nuevamente el asa, evitando con esto, posibles
contaminaciones a otros medios.
- Aspecto final de la placa sembrada, utilizando la
técnica descrita anteriormente.
Las placas una vez inoculadas se incuban en posición invertida con los medios
hacia arriba a 37 C y se examinan a intervalos de 24-48 horas. Después de que la
placa ha sido incubada y para la obtención de cultivos puros, cualquier colonia
bien aislada es removida con un asa, pero tal vez sea más conveniente emplear el
asa recta sobre todo si las colonias están muy juntas. La colonia es suspendida en
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
un medio líquido, o bien sembrada directamente en otra caja conteniendo algún
medio específico dependiendo del agente que se sospeche.
Para cierto tipo de muestras, por ejemplo, las de orina o sangre, se coloca una
cantidad determinada de la muestra en una placa de Petri estéril y se vierta
encima del agar derretido (enfriado a 50 C), luego se hace rotar la placa para
mezclar minuciosamente el material con el medio. Una vez que se haya
solidificado a temperatura ambiente de invierte la placa, se incuba a 37 y se
examinan las colonias, esta técnica ofrece la ventaja de dar una determinación
cuantitativa de las bacterias. Si las muestra están muy contaminadas, es
necesario realizar una dilución.
El resembrado de las colonias obtenidas en el aislamiento primario, asegura la
purificación de las diversas cepas bacterianas y por lo tanto, la obtención de “
cultivos puros”.
INOCULACIÓN DE TUBOS CON AGAR INCLINADO.
Los cultivos en una superficie de agar inclinado, se realizan con frecuencia para
mantener las cepas puras y para efectuar ciertos estudios bioquímicos.
La inoculación, se realiza a partir de una colonia aislada, tomada de una placa
con el asa, se traslada el inóculo a la superficie del medio que se siembra
enteramente por estrías (Ver Fig. 9), a veces es necesario practicar una incisión
en la superficie del agar, por ejemplo en el agar TSI para organismos entéricos, la
incisión nunca llega hasta el fondo.
La Fig. 10 nos muestra diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado
Fig. 9
“Sembrado”
agar inclinado
en
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
1.ARBORECENTE
2. DIFUSO
3. ESPINOSO
4. RIZOIDE
5.ARROSARIADO
6.- PILIFORME
1
2
3
4
5
6
Fig. 10 Diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado
INOCULACIÓN DE TUBOS CON MEDIO SÓLIDO HORIZONTAL.
La
inoculación de algún medio sólido presentado en tubo de ensayo con
superficie horizontal, se realiza utilizando es asa recta. El método de sembrado
consiste en quitar la tapa con el dedo meñique, flamear la boca del tubo e inocular
por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio ( Ver Fig. 11).
Fig. 11 Inoculación de un medio sólido por picadura.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
INOCULACIÓN DE MEDIOS SEMISÓLIDOS.
Los medios semisólidos se emplean para los estudios de movilidad (medio de
SIM), carbohidratos (medio basal OF)
o bioquímicos (gelatina) se inoculan
utilizando un alambre recto, tratando de que la incisión no llegue al fondo del tubo.
(Ver Fig. 12)
Fig. 12 “Sembrado” por picadura de un medio semisólido
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
INOCULACIÓN EN MEDIOS LÍQUIDOS
La inoculación de los caldos de cultivo, se
efectúa con asa recta, a partir de la muestra
u otros cultivos, agitándola dentro del medio
como lo muestra la Fig. 13.
El crecimiento en estos medios se manifiesta
de tres formas:
1. enturbiamiento, una opacidad más o
menos densa
2. Formación de velo: pequeña masa de
Fig. 13 “Sembrado en
medios líquidos
células que flota en la parte superior del
cultivo,
3. Sedimento: deposito celular que
permanece en
la parte inferior del
cultivo.
MATERIAL:
Medios de cultivo líquidos (Caldo nutritivo).
Medios de cultivo sólido.
Asa.
Mechero.
Cepas bacterianas.
Portaobjetos.
Juego de colorantes para la tinción de Gram.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PROCEDIMIENTO:
1. En tu mesa de trabajo encontrarás medios de cultivo líquidos,
semisólidos y sólidos, los cuales inocularás según la técnica descrita
anteriormente, según corresponde.
2. Espera la instrucción del profesor para saber que cepas inocularás en
cada uno de los medios
3. Realiza la tinción de GRAM de cada cepa inoculada.
4. Marca perfectamente los tubos y cajas inoculadas para evitar
confusiones con las demás.
5. Inocula los medios de cultivo (Todos) a 37 C en la estufa
bacteriológica, durante 24 horas.
6. Después de las 24 horas, sacarás tus cultivos y los guardarás en el
refrigerador, para utilizarlos en la siguiente práctica.
CUESTIONARIO:
1. Menciona los calibres de las asas mas utilizados para el análisis
bacteriológico cuantitativo.
2. Cuales son los diferentes tipos de sembrado de acuerdo al fin que se
persigue.
3. Después de sembrar las placas que se debe realizar con ellas.
4. Como debe ser la inoculación de medios de cultivo semisólidos.
5. Como se puede manifestar el crecimiento de bacterias en los medios
líquidos.
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación
en
practica
Puntualidad
SI
NO
la
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Presentación
(Bata
blanca manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
______________________________________________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRACTICA No. 9
MORFOLOGÍA COLONIAL Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS.
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
•
Definirá el concepto de colonia bacteriana
•
Describirá la morfología de diferentes colonias bacterianas y
mencionará la utilidad diagnóstica que ésta representa.
INTRODUCCIÓN:
El estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia debido a que
gracias a ésta puede iniciarse una identificación preliminar de microorganismos
aislados.
Cuando una célula bacteriana prolifera sobre una superficie sólida, ésta da lugar a
la formación de un acumulo de millones de bacterias que pueden observarse a
simple vista y reciben el nombre de colonia
Las
colonias bacterianas presentan características morfológicas
muy
variadas, mismas que son constantes para cada especie de bacteria en idénticas
condiciones de cultivo. Estas características pueden modificarse cuando factores
tales como humedad relativa, medio de cultivo, temperatura y atmósfera de
incubación varían.
La descripción de las colonias bacterianas debe
realizarse cuando éstas
se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta
las siguientes características: tamaño, color, superficie, borde, opacidad, elevación
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
y estructura interna. La
bacterianas en cuanto a
Fig. 14 nos presenta
el aspecto de las colonias
su forma, borde y elevación (para más detalle
clasificaremos posteriormente de acuerdo a estos criterios a las colonias
bacterianas).
Tamaño. El tamaño de una colonia bacteriana puede variar desde unos
cuantos milímetros hasta varios centímetros. Los micoplasmas, por ejemplo,
forman colonias tan pequeñas que para poder observarlas es preciso utilizar el
microscopio estereoscópico. Estas colonias no aumentan su tamaño en forma
significativa aún después de varios días de incubación. Por otra parte gérmenes
como Brucella, E. coli y otros, forman colonias pequeñas cuando el cultivo es
joven, pero aumentan considerablemente su tamaño cuando la incubación se
prolonga. Existen
casos extremos como en el caso de Mycobacterium
paratuberculosis, donde debido a la baja velocidad de crecimiento las colonias no
son visibles sino hasta después de varias semanas de incubación.
Asimismo, existen algunas especies de los géneros Proteus, Bacillus y
Clostridium que invaden todo el medio de cultivo dando el aspecto de una colonia
única de varios centímetros de diámetro.
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
A)Plana, B) Elevada, C) Convexa, D) Pulvinada, E) Umbilicada, F)
Bajo la superficie
Fig. 14 aspectos de colonias bacterianas en cuanto a su
forma, borde y elevación.
Color: Hay especies bacterianas capaces de sintetizar pigmentos muy diversos,
los cuales son detectados fácilmente debido al color característico que le imparten
a las colonias o por la difusión de dichos pigmentos en los medios de cultivo (
sólido y líquido)
que no poseen colorantes o indicadores de pH. Algunos
ejemplos de bacterias productores de pigmento son:
2. Pseudomonas aeruginosa: pigmento verde amarillento.
3. Micrococcus roseus: Pigmento rosa- anaranjado.
4. Serraría marcescens: pigmento anaranjado- rojo.
5. Staphylococcus equi: pigmento rosa.
6. Mycobacterium spp:pigmento amarillo- rojo .
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
En el caso de las bacterias del género Mycobacterium, la producción de pigmento
tiene un valor taxonómico.
Las características de la superficie, borde, opacidad, elevación y estructura
interna, están sujetas a la interpretación subjetiva del observador. Para
describirlas es necesario el uso del microscopio estereoscópico, por lo que su
valor descriptivo es menos relevante. De acuerdo a estos criterios, las colonias
pueden clasificarse de la siguiente manera:
Lisas
Superficie
Granular
Estructura
Mucoide
interna
Rugosas
Filamentosa
Translúcidas
Opacidad
Opacas
Brillantes
Enteras
Onduladas
Borde Lobuladas
Umbilicadas
Elevación
Difusas
Erizadas
Planas
Filamentosas
Convexas
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias bacterianas
es la
producción de hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo
adicionados con sangre, donde la producción de hemolisinas conduce a la
formación de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de la colonia.
Al hacer la identificación de las colonias bacterianas aisladas no siempre será
necesario
detallar
todas
las
características
morfológicas
mencionadas,
generalmente se toman en cuneta aquellas que son más relevantes.
MATERIAL
1. Diferentes cultivos bacterianos ( trabajos en la práctica 7)
2. Asa
3. Mechero
4. Portaobjetos colorantes para la tinción de GRAM.
PROCEDIMIENTO:
1. Realiza la descripción morfológica de las colonias que crecieron en el
medio de cultivo sólido y elabora un cuadro de comparación de éstas
características, el cual te permita hacer la diferenciación morfológica entre
ellos.
2. Realiza la tinción de Gram, de una colonia de cada uno de los medios de
cultivo que trabajaste y compara este resultado con el que hiciste en la
práctica 7 (en cuanto a tinción de Gram se refiere).
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un cultivo puro?
2. ¿Qué es un cultivo mixto?
3. Describe como obtienes un cultivo puro
4. Cual es la importancia de determinar la morfología colonial
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación
en
la
practica
Puntualidad
Presentación
(Bata
blanca manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
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RECOMENDACIONES:_______________________________________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRACTICA No. 10
METABOLISMO E IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
INTRODUCCIÓN.
El interés de la bacteriología médica se centra alrededor de la identificación
de microorganismos aislados de muestras clínicas, con el fin de poder
relacionarlos con grupos previamente clasificados.
Para la identificación de las bacterias, el laboratorio de bacteriología
necesita conocer las características físicas y metabólicas de las mismas.
Dentro de las características físicas, se toman en cuenta: agrupación,
reacción a la tinción de Gram y algunas otras particularidades estructurales que se
pueden apreciar con tinciones específicas así como la morfología de las colonias
observadas en placas de agar.
Conocidas las características físicas de la bacteria, se analizan sus
reacciones
metabólicas
tales
como producción de enzimas,
metabolitos
intermedios, oxidación, oxidación y fermentación, entre otras. Esto se logra a
través de pruebas estandarizadas que se elaboran a partir de preparados
comerciales que son medios de cultivo conteniendo el compuesto sobre el cual las
enzimas bacterianas actúan e indicadores que ponen de manifiesto la reacción
que se llevó a cabo.
Una vez determinadas estas características se deben consultar esquemas,
cuadros o tablas de identificación, los cuales son variados, pero en todos los
casos conducen de una manera ordenada al conocimiento del género y especie
bacteriana que se desea identificar
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
La tendencia actual es la de utilizar una serie de complementos tales como :
pruebas biológicas, fagotipificación, análisis cromatográfico, serología. Nosotros
nos auxiliaremos de las pruebas bioquímicas:
A continuación se explicarán algunas de las pruebas más usadas en el
laboratorio
1. ACIDO SULFHIDRICO. INDOL. MOVILIDAD. (S.I.M.)
MEDIO: Semisólido en tubo y debe sembrarse por picadura con asa recta
hasta que las 2/3 partes del medio queden inoculadas. La siembra en un
solo tubo sirve para las 3 pruebas.
PRINCIPIO. Este medio sirve para realizar tres pruebas a la vez que deben ser
leídas y reportadas por separado, ejemplo:
S.I.M. +/-/- indica: ácido sulfhídrico positivo, indol negativo y motilidad negativa.
S.- Producción de ácido sulfhídrico: algunas bacterias son capaces de degradas
la cistina y
otros compuestos que contienen azufre, dando como resultado
la formación de ácido sulfhídrico (H2S). Para la detección de dicho ácido el
medio contiene sales de metales pesados (sulfato ferroso) que al combinarse
con el ácido sulfhídrico forman respectivos sulfuros.
RESULTADOS: Positivo. Formación de zonas negras.
Negativo. El medio permanece del color inicial.
I.- Producción de indol. Se trata de detectar la producción de indol a partir del
triptofano del medio, por medio de la triptofanasa de la bacteria, que hidroliza
dicho ácido. Para detectar la liberación del anillo indólico del triptofano, que es
el
único aminoácido que lo contiene, se agrega al medio después de la
incubación, una o dos gotas del reactivo de Kovac’s, la reacción es inmediata.
RESULTADOS: Positivo. El reactivo se torna rojo.
Negativo. Cuando no hay cambio en el reactivo que es amarillo.
M. Motilidad: la motilidad de las bacterias está dada por flagelos, misma que
puede apreciarse
por una sola picadura con asa recta en un medio
semisólido como éste.
- 69 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Algunas veces la producción excesiva
apreciación
de ácido sulfhídrico impide la
de la motilidad, por lo tanto es necesario realizar una
preparación húmeda a partir de un cultivo en caldo.
RESULTADOS: Positivo. Se manifiesta por una zona nebulosa más allá de la
línea de inoculación por picadura, se debe a la invasión del medio (dada a
su baja concentración de agar) por las bacterias flageladas.
Negativo. Solo se observa crecimiento en la línea de
inoculación.
INCUBACIÓN: De 24 a 48 horas a 37 C.
2.- UREASA.
MEDIO. Urea que es medio de color amarillo muy claro, sólido inclinado
en un tubo que se siembra por estría continua; contiene urea y rojo de
fenol como indicador de pH,
PRINCIPIO: Detectar la producción de ureasa por parte de la bacteria
con el consiguiente desdoblamiento de la urea en amoniaco y nitrógeno.
INCUBACIÓN: De 24 horas a siete días a 37 C.
El citrato como única fuente de carbono y a la sal de amonio como fuente
de nitrógeno.
INCUBACIÓN: De 24 horas a siete días a 37 C.
RESULTADOS: Positivo. Una marcada alcalinidad del medio debida a la
producción de amoniaco (NH3), hace que el rojo de fenol se ponga de
manifiesto con un intenso color rosa mexicano
Negativo. El medio permanece con un color original.
3.- CITRATO.
MEDIO: Citrato de Simmo’s. Es un medio de color verde oscuro de
superficie inclinada en tubo. Se siembra por estría continúa en la
superficie. Contiene citrato de sodio, una sal de amonio y un indicador de
pH que es el azul de bromotimol.
PRINCIPIO: Saber si la bacteria utiliza
RESULTADOS: Positivo. Color azul en el medio (pH alcalino)
Negativo. Permanece color original.
- 70 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
4.-CARBOHIDRATOS (azúcares)
MEDIO: Es un medio líquido de color rojo se siembra por agitación del asa.
Contiene solo uno de los carbohidratos ( solo el que desea probarse) que se
mencionan después y un indicador de pH, el rojo de fenol. Los azúcares que
pueden probarse son los siguientes: adonitol, arabinosa, celobiosa, dextrosa
(glucosa), dulcitol, galactosa, glicerol, inositol, inulina, lactosa, fructosa,
maltosa, manitol, manosa, rafinosa, rhamnosa (isoducitol), salicín, sorbitol.
sucrosa, trealosa y xilosa.
PRINCIPIO: Detectar si la bacteria problema es capaz de utilizar los
carbohidratos con o sin producción de gas. Es necesario que el tubo ya
inoculado se incuba con el tapón flojo.
Si la bacteria utiliza el azúcar puede producirse ácidos y gas, en algunos
casos solo se produce ácidos.
INCUBACIÓN: De 24 horas a seis días a 37 C.
RESULTADOS: Positivo. Esta indicado por un cambio de color del medio de
rojo a amarillo. Se recomienda incubar un tubo testigo: es decir sin inocular,
para verificar pequeñas variaciones en el color del medio.
Negativo. El color del medio permanece sin variaciones.
5.- CATALASA.
REACTIVO: Agua oxigenada (H2O2).
PRINCIPIO: Detectar si la bacteria problema produce la catalasa, que es una
enzima que desdobla el agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) en agua y
oxígeno libre, que se aprecia en el reactivo como formación de burbujas.
TÉCNICA: en un portaobjetos limpio y seco se coloca una gota del reactivo y
sobre ésta una asada de la colonia problema.
RESULTADOS: Positivo. Está indicado por una efervescencia o burbujeo
inmediatamente.
Negativo. No hay formación de burbujas.
- 71 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Nota:
Cuando la colonia problema se encuentra cultivada en gelosa sangre, el
asa no debe enfriarse en el espesor del medio, como se hace rutinariamente,
ni debe tocar la superficie del agar ya que las células sanguíneas contenidas
en la gelosa sangre, producen peroxidasas que pueden provocar reacciones
positivas falsas.
El siguiente diagrama puede ser utilizado como una guía general para la
identificación de los principales géneros bacterianos de interés veterinario:
CARACTERÍSTICAS
PRUEBAS
GENERALES
PRIMARIAS
GÉNERO
Catalasa
Staphylococcus Coagulasa,
manitol,
Micrococcus
urea.
Positivos. Aerobios
- Streptococcus
Bacillus
(aerobio)
+
Bacilos y cocobacilos.
Gram positivos
Aerobios y anaerobios
Esporas
PRUEBAS
COMPLEMENTARIAS
+
Cocos Gram
ALGUNAS
Clostridium
(anaerobio)
Listeria
- Erysipelothrix
O-F,
pigmento,
Utilización
de
carbohidratos; CAMPesculina, NaCl 6.5%
Motilidad,
hemolisis,
pruebas
biológicas,
Análisis cromatográfico
Catalasa,
hemolisis,
utilización
de
carbohidratos, H2S
Corynebacterium
- 72 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Bacilos y cocobacilos
Oxidasa
Moraxella
Brucella
+ Bordetella
Pasteurella
Pseudomonas
TSI, SIM, urea, citrato,
reducción de nitratos,
utilización
de
carbohidratos,
H2S,
fagotipificación
Enterobacterias
- Haemophilus
Fusobacterium
(anaerobio)
TSI, SIM, urea, citrato,
utilización
de
carbohidratos,
requerimientos
de
factores X y Y
Gram
negativos.
Aerobios y anaerobios
Crecimiento
+Actinomyces microaerobiosis,
catalasa.
Filamentos Gram
positivos
Crecimiento en
anaerobiosis
Bacilos ácido alcohol
resistente
Velocidad
de
crecimiento,
morfología de
colonias
y
producción de
pigmento
Espiroquetas y Vibrios
Crecimiento en
aerobiosis
-
Nocardia
en
Tinción de Kinyoun,
hidrólisis de caseína,
xantina y tirosina
Síntesis de niacina,
producción
de
Mycobacterium pirazinamidasa
+ Leptospira
Treponema
Campylobacter
Micro aglutinación
Crecimiento en micro
aerobiosis,
susceptibilidad
a
quimioterapéuticos,
serología.
- 73 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Síntesis de
pared
Formas “L”
pleomórficas
+ formas “L”
Micoplasma
- Ureaplasma
Acholeplasma
celular en
ausencia de
antibióticos
+ Chlamydia
Inclusiones
citoplasmáticas
basofílicas
Bacterias
Intracelulares
- Riquetsias
Según morfología y
tinción
de
Gram,
filtrabilidad (0.45 nm,
Digitonina,
urea,
Inhibición
de
crecimiento
y
de
metabolismo mediante
antisueros específicos
Producción de
glucógeno,
susceptibilidad a sulfas
inmunofluorescencia
Morfología
microscópica,
inmunofluorescencia
MATERIAL:
Diferentes pruebas bioquímicas
Asa
Mechero
Estufa bacteriológica
Portaobjetos.
PROCEDIMIENTO.
1. En tu mesa de trabajo encontrarás diferentes pruebas bioquímicas.
2. Tu profesor te dará una explicación de cómo debes realizarlas
3. Anota tus resultados para identificar tu bacteria problema.
CUESTIONARIO:
1. Cual es la importancia de sembrar las pruebas bioquímicas
2.
Investiga el fundamento de las siguientes pruebas bioquímicas OF, TSI
( agar hierro triple azúcar), LIA, Gelatina nutritiva
- 74 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación
en
la
practica
Puntualidad
Presentación
(Bata
blanca manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRÁCTICA No. 11
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA A QUIMIOTERAPÉUTICOS
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
•
El alumno realizará la prueba de difusión en agar según el método
de Bauer et al.
•
Interpretará la susceptibilidad a los quimioterapéuticos mediante la
observación de los halos de inhibición.
INTRODUCCIÓN:
Se piensa que los quimioterapéuticos actúan de forma similar en las en las
infecciones; Sin embargo, existe diversidad tanto en los grupos de antibióticos y
sus mecanismos de acción, como en los microorganismos causantes de infección
y susceptibilidad a aquellos, así como también debe considerarse al individuo
afectado y su estado inmunitario, sitio de infección de cronicidad y sensibilidad a
la droga. Por esto es necesario
realizar
la prueba de susceptibilidad a los
quimioterapéuticos para tratar adecuadamente un caso problema.
El uso indiscriminado de los antimicrobianos
ha originado la selección de cepas
bacterianas multirresistentes, por lo que resulta difícil predecir la susceptibilidad
con base en la sola experiencia clínica.
Muchas cepas de
microorganismos tradicionalmente sensibles a
ciertos
antibióticos, son ahora resistentes, principalmente debido a la amplia distribución
de plásmidos de resistencia múltiple (plásmidos R).
- 76 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
La susceptibilidad de microorganismos in vitro
a los antimicrobianos puede
medirse en el laboratorio, ya sea por pruebas de difusión en agar o de dilución en
caldo. También puede efectuarse mediante pruebas químicas sensibles para pone
de manifiesto
algunas
de las enzimas bacterianas como la penicilinasa que
inactiva a las penicilinas. Las pruebas in vitro de susceptibilidad bacteriana por
dilución en agar o en caldo son pruebas cuantitativas que permiten conocer la
concentración mínima inhibitoria para un determinado microorganismo. En estas
pruebas se hacen diluciones de un quimioterapéutico en un medio de cultivo
apropiado al que se agrega una concentración constante de bacterias. Después
de la incubación se determina la dilución máxima del quimioterapéutico en la que
hay
desarrollo bacteriano, correspondiendo la concentración del antibiótico en
esta dilución a la concentración mínima inhibitoria o MIC (Minimal Inhibitory
Concentration). Este resultado nos permite determinar la concentración necesaria
del quimiterapéutico en los tejidos afectados y por tanto ofrece al clínico una base
de objetividad de decisión terapéutica.
Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el método de difusión en agar
son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel impregnado con
concentraciones conocidas de los diferentes quimioterapéuticos. Estos discos se
colocan sobre la superficie de las cajas de agar previamente inoculadas con la
cepa problema. Después de la incubación se observan halos de inhibición del
desarrollo bacteriano alrededor de los discos con quimioterapéuticos a los cuales
el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la bacteria es resistente hay
crecimiento alrededor del disco.
Dentro de las pruebas de difusión en agar se encuentra el método de Bauer
et a., en el cual, además de estandarizar el inóculo, se toma en cuenta el tamaño
de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano para determinar el grado de
susceptibilidad
del
microorganismo
(RESISTENTE,
INTERMEDIO
O
SUSCEPTIBLE), por lo tanto la lectura del diámetro de inhibición del crecimiento
en mm debe interpretarse de acuerdo a una tabla de referencia, ver figuras (15,
- 77 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Fig. 15. técnica de difusión del disco en agar mostrando la zona de inhibición.
Para poder evaluar epidemiológicamente este tipo de interpretación se
tomaron en cuenta los valores de los MIC’S de cientos de cepas de cada
especie bacteriana clínicamente importante en humanos. Estos valores
fueron correlacionados con el diámetro de los halos de inhibición y con los
niveles séricos alcanzados por cada droga
a dosis terapéuticas, otro factor
Sensible
considerado fue la experiencia clínica obtenida durante muchos años en la
terapéutica, otro factor considerado fue la experiencia clínica obtenida
durante muchos años en la terapéutica antimicrobiana de infecciones
bacterianas.
En Medicina Veterinaria no existen métodos similares estandarizados para
cada una de las especies animales por lo que la aplicación de los estándares
establecidos por Bauer et al. deben interpretarse con
cautela. El clínico
debe estar consciente de las limitaciones de las pruebas de susceptibilidad in
vitro y, por lo tanto el resultado del laboratorio deberá ser solo uno de los
muchos criterios a considerar en la elección de un quimioterapéutico
clínicamente útil.
MATERIAL.
Cultivo bacteriano en medio líquido.
Hisopos estériles
Medio de cultivo líquido
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
Caja de agar Müeller Hinton (MH)
Pipeta Pasteur
Estándar de turbidez 0.5 de Mac Farland
Tarjeta para comparación de turbidez
Discos de papel filtro impregnados con quimioterapéuticos
(“sensidiscos”)
Pinzas
Frasco con alcohol
PROCEDIMIENTO.
1. En tu mesa de trabajo encontrarás un cultivo bacteriano en medio líquido.
2. Estandariza el inóculo agregando unas gotas del cultivo en el tubo que
contiene medio líquido, hasta alcanzar una turbidez igual a la el tubo de 0.5
de Mac Farland. Compare la turbidez de ambos tubos auxiliándose con la
tarjeta que te fue proporcionada para este fin.
La suspensión estandarizada debe ser inoculada en la caja de agar antes de
que transcurran 15 minutos, de lo contrario puede alterarse la cuenta
bacteriana.
3. Sembrar el microorganismo de Müeller- Hinton usando un hisopo.
4. Humedecer el hisopo con la suspensión bacteriana, quitando el exceso del
caldo presionándolo y girándolo sobre la pared interna del tubo por arriba
del nivel del caldo.
5. Sembrar en tres direcciones para obtener un sembrado uniforme. Dejar
reposar la placa de 2-5 minutos para que se seque el inóculo.
6. Flamea las pinzas en alcohol y con ellas coloca los sensidiscos.
7. Incuba las cajas de agar en posición invertida a 37 C y durante 24 horas
Determina el patrón de sensibilidad y resistencia de la cepa observando los
halos de inhibición alrededor de los sensidiscos
- 79 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
CUESTIONARIO:
1.- Investiga cuales son los mecanismos, por los cuales las bacterias crean
resistencia a los quimioterapéuticos.
2.- Solicita al auxiliar de laboratorio o a tu profesor la tabla
quimioteréuticos para
realizar
de los
la lectura correspondiente de los halos de
inhibición. Interpreta y discute tus resultados.
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación
en
la
practica
Puntualidad
Presentación
(Bata
blanca manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_____________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
_____________________________________________________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRACTICA No. 12
TOMA,
ENVIO
Y
MANEJO
DE
MUESTRAS
PARA
EL
ANÁLISIS
BACTERIOLÓGICO Y MICOLÓGICO.
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
El alumno aplicará los procedimientos generales para la toma, envío y
manejo de muestras clínicas al laboratorio
para el diagnóstico
bacteriológico y micológico, mediante la colección de una muestra
problema.
INTRODUCCIÓN:
La bacteriología y micología diagnóstica es el estudio de las muestras tomadas a
partir de pacientes de los cuales se sospecha de una infección que involucre a
estos agentes. El laboratorio puede apoyar al clínico de la siguiente manera:
- Confirmar el diagnóstico presuntivo.
- Sugiere la quimioterapia de la enfermedad.
- Colabora en el conocimiento epidemiológico de las enfermedades.
- Permite la elaboración de autobacterinas.
Los resultados del examen bacteriológico y micológico, así como la rapidez
con que éstos sean obtenidos, no dependen solo de los métodos de laboratorio
empleados, sino también de la forma en que sean colectadas y enviadas las
muestras clínicas. Dichos resultados pueden verse influenciados por la
presencia de microorganismos que son parte de la microflora normal, por la
migración bacteriana post-mortem o por la aplicación de antimicrobianos antes
- 81 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
del envío de la muestra. El clínico debe tener en mente estos factores para
realizar la interpretación de los resultados emitidos por el laboratorio.
TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS.
Los problemas más frecuentes para la identificación bacteriana y micológica
en el laboratorio son:
3. Envío de muestras en condiciones inadecuadas (sangre hemolizada, suero
turbio contaminado,
orina de más de 4 horas, hisopos sin medio de
transporte, muestras no refrigeradas).
4. Envío de muestras en condiciones inadecuadas (sangre hemolizada, suero
turbio contaminado
5. Envío de muestras no representativas de la lesión en cuestión
6. Toma de muestras sin antisepsia.
7. Falta de una historia clínica completa y de un diagnóstico presuntivo.
Por lo anterior, es indispensable que el clínico tenga un conocimiento sobre la
correcta obtención y envío de muestras al laboratorio.
A continuación se menciona algunas normas generales a considerar.
1.- Tomar la muestra del sitio anatómico más representativo del problema, de
preferencia en la etapa aguda de la enfermedad.
2.- Las muestras obtenidas a partir de animales muertos deberán tomarse
dentro de las primeras 3 horas de ocurrida la muerte o el sacrificio.
3.- Las muestras deben colocarse bajo estrictas condiciones de antisepsia
(limpiar la piel con alcohol al 70 % y posteriormente iodo por un minuto).
Tanto el material de colección como el recipiente en el que la muestra sea
transportada deberán ser estériles. Este último preferentemente debe tener
un tapón de rosca
4.-
Los
especimenes
colectados
no
deben
entrar
en
contacto
con
desinfectantes.
5.- Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie,
raza,
edad, sexo, arete o nombre del animal a partir del cual fueron identificadas,
- 82 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
así como dirección, teléfono y nombre del propietario del animal. (Etiqueta
de identificación).
6.- Una vez colectadas las muestras deben enviarse dentro de las siguientes 424 horas al laboratorio en condiciones de refrigeración ( 4 C). Esto puede
lograrse utilizando hielo o refrigerantes en cajas de poliuretano.
7.- Cuando sea necesario el uso de hisopos para la colección de las muestras
hay peligro de desecación por ello estos deben enviarse en medios de
transporte, que ayudan a la preservación de la bacteria pero no a la
multiplicación.
8.- Debe anexarse una historia clínica, que incluya la hora de la muerte del
animal, número de animales afectados, si el animal del que proviene la
muestra fue tratado con antimicrobianos, cuales y durante cuanto tiempo y un
diagnóstico presuntivo con base en signos clínicos y epidemiológicos.
9.- Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clínicas deben
realizarse con precaución debido a que algunos agentes involucrados en las
enfermedades infecciosas de animales constituyen un riesgo de zoonosis
para la salud del clínico y bacteriólogo.
10.- Si no son consideradas estas normas, el laboratorio podrá rechazar la
muestra para el análisis bacteriológico y micológico.
En las siguientes páginas aparecen las recomendaciones en forma de cuadros
para la toma y envío de muestras, de acuerdo a las condiciones patológicas
específicas.
MATERIAL:
- Será el que se requiera, en función a la muestra que se va a
trabajar y será solicitado por el equipo de trabajo al profesor de laboratorio.
PROCEDIMIENTO:
1.- De acuerdo a la información anterior, realiza correctamente tu toma de
- 83 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
muestra según corresponda.
2.-Una vez tomada la muestra transpórtala al laboratorio para que puedas
procesarla.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuándo tomar ese tipo de muestra?
2. ¿Cantidad de muestra a utilizar?
3. Materiales requeridos para la toma de muestra.
4. Técnica señalando paso a paso en la toma de la muestra
5. Cuidados que se deben guardar en la toma de la muestra para que ésta
sea de calidad.
6. Medio o medios de transporte a utilizar para la muestra ( en caso
necesario)
7.
Cuidados a guardar en el envío de la muestra,
8.
Microorganismos más frecuentes encontrados en la muestra.
9. Nombre de la enfermedad
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación
en
la
practica
Puntualidad
Presentación
(Bata
blanca manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
OBSERVACIONES:__________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________
RECOMENDACIONES:_____________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
- 85 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
RECOMENDACIONES PARA LA TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS DE ACUERDO A CONDICIONES PATOLÓGICAS
ESPECIFICAS
CONDICIÓN
TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD
FORMA DE COLECCIÓN Y OBSERVACIONES
PATOLÓGICA.
RECOMENDA
ENVIO
-FETO COMPLETO O CONTENIDO
FRASCOS.
EL
BOLSAS DE PLÁSTICO
ENVIARSE
HISOPOS
CUANDO
JERINGAS
CLAMIDIASIS
ABOMASAL (1 ML)
-PULMÓN, BAZO, HÍGADO Y
ABORTOS
RIÑÓN FETAL. (6 CM POR LADO).
FETO
Y
ÓRGANOS
EN
SE
PUEDEN
CONGELACIÓN.
SOSPECHA
ENVIAR
DE
HÍGADO
-PLACENTA Y PLACENTOMAS
MEDIO DE TRANSPORTE ESPECIAL.
-SECRECIÓN VAGINAL (1 ML)
ALIMENTO
-LECHE (15 ML)
AFLATOXICOSIS.
EN
CASO
EN
DE
-ALIMENTO (100 G)
ABSCESOS,
-EXUDADO PURULENTO (1 ML)
JERINGAS
EN
CASO
DE
GRANULOMAS
GRANULOMAS
-ABSCESO COMPLETO
HISOPOS
SOSPECHOSOS
DE
TUBERCULOSIS
Y EXUDADOS
-BIOPSIA
FRASCOS
DEBEN EXTREMARSE PRECAUCIONES.
BOLSAS DE PLÁSTICO.
ARTRITIS
- LÍQUIDO SINOVIAL (1 ML)
JERINGAS
DESINFECTAR
PIEL ANTES
- ARTICULACIÓN COMPLETA.
HISOPOS
ARTROCENTESIS.
DE
BOLSAS DE PLÁSTICO.
- 86 -Pag -
LA
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
OBSERVACIONES
CONDICIÓN
TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD
FORMA DE COLECCIÓN Y
PATOLÓGICA.
RECOMENDA
ENVIO
CLOSTRIDIASIS
-MÚSCULO NECRÓTICO (10 CM
FRASCOS
ENVIAR RÁPIDAMENTE AL
BOLSAS DE PLÁSTICO.
LABORATORIO EN ATMÓSFERA
INVASIVA
(MIOSITIS
NECRÓTICA,
HEPATITIS
POR
LADO).
-TEJIDO SUBCUTÁNEO
ANAEROBIA. EN ESTE CASO NO ES
EDEMATOSO (10 CM POR LADO).
RECOMENDABLE LA REFRIGERACIÓN.
-HÍGADO (10 CM POR LADO)
NECRÓTICA).
-INTESTINO
SEGMENTO LIGADO
ENTERO
-ÓRGANOS AFECTADOS,
DE INTESTINO
TOXEMIA
NÓDULOS LINFÁTICOS,
EN FRASCO
ENVIAR EN REFRIGERACIÓN.
RIÑÓN, HÍGADO Y BAZO
DERMATOFITOSIS
-PELOS.
FRASCOS
NO
ES
NECESARIO
QUE
LOS
-ESCAMAS.
SOBRES DE
RECIPIENTES ESTÉN ESTÉRILES. LAS
PAPEL NUEVOS
MUESTRAS DEBEN TOMARSE DE LA
PORTAOBJETOS
PERIFERIA DE LA LESIÓN.
- 87 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
-ORINA (6 ML)
CATÉTER,
LAS
INFECCIONES
-RIÑÓN COMPLETO Ó 6 CM
JERINGA,
DENTRO DE LAS SIGUIENTES 2 HORAS
URINARIAS
POR LADO
FRASCO ESTÉRIL.
A SU COLECCIÓN.
CONDICIÓN
TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD
FORMA DE COLECCIÓN Y
OBSERVACIONES
PATOLÓGICA.
RECOMENDA
ENVIO
-INTESTINO
SEGMENTO LIGADO
EN GRANDES ESPECIES TOMAR LAS
-HECES (1 G).
DE INTESTINO
HECES DIRECTAMENTE DEL RECTO Y
-N. LINFÁTICOS MESENTÉRICOS.
EN FRASCO ESTÉRIL,
EN PEQUEÑAS ESPECIES CON HISOPO.
-VESÍCULA BILIAR,
FRASCOS, BOLSAS,
EN CASO SOSPECHOSO A
-ALIMENTO (100G) Y
HISOPOS Y
PARATUBERCULOSIS ENVIAR
AGUA (100 ML).
GUANTES DE PALPACIÓN
RASPADO Y MUCOSA INTESTINAL.
-EXUDADOS (1ML)
HISOPOS, JERINGAS,
SI SE SOSPECHA DE
-LAVADOS PREPUCIALES O
FRASCOS O BOLSAS DE
CAMPILOBACTERIOSIS,
INFECCIONES
VAGINALES (10 ML)
PLÁSTICO (EN EL CASO
LEPTOSPIROSIS O MICOPLASMOSIS,
GENITALES
-ÓRGANOS: TESTÍCULO,
DE LOS ÓRGANOS)
LAS MUESTRAS DEBEN ENVIARSE
DIARREAS
MUESTRAS
DEBEN
ENVIARSE
EPIDÍDIMO, ÚTERO ETC.
DENTRO DE LAS SIGUIENTES 3 HORAS
(COMPLETOS Ó 10 CM POR LADO)
A SU COLECCIÓN Y EN
REFRIGERACIÓN.
- 88 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
_____________________________________
- 89 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
PRACTICA No. 13.
SEGUIMIENTO BACTERIOLÓGICO PARA EL DIAGNÓSTICO EN UNA
MUESTRA PROBLEMA.
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA
No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS:
•
El alumno investigará el procedimiento que le permitirá hacer
el aislamiento e
identificación de las
bacterias presentes en su muestra.
•
El alumno aplicará los conocimientos adquiridos durante las
diferentes sesiones de laboratorio y pondrá en práctica desde
la toma de muestra hasta la identificación de bacterias
presentes
en
su
muestra problema
y poder
emitir
el
diagnóstico confirmativo de su muestra problema
MATERIAL :El necesario, en función a la muestra que se va a trabajar y
será
solicitado
por el equipo de trabajo al profesor de
laboratorio.
PROCEDIMIENTO:
1. Habrás notado que no existe una introducción en lo que respecta a esta
práctica, por lo que realizarás una investigación sobre el
procedimiento a seguir y poder identificar las bacterias que estén
presentes en tu muestra problema.
2. Elabora un cronograma del procedimiento que seguirás, que incluya
desde la toma de muestra hasta la susceptibilidad a quimioterapéuticos.
- 90 -Pag -
Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
3. Presenta al profesor de la materia este cronograma, antes de empezar
tu trabajo en el laboratorio.
CRITERIOS DE EVALUACION:
ACTITUD
Participación
en
la
practica
Puntualidad
Presentación
(Bata
blanca manga larga)
Responsabilidad
Buen manejo del equipo y
material
Buen lenguaje
SI
NO
OBSERVACIONES:_______________________________________________
_______________________________________________________________
__________________________________________
RECOMENDACIONES:____________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
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Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas
BIBLIOGRAFÍA.
1. Difco: Manual de medios de cultivo y reactivos para microbiología 10ª. Ed.
Laboratorio Difco, Michigan, USA.
2. García, T. R., Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y
Micología Veterinaria. Instituto Interamericano de Cooperación para la
Agricultura. México D. F. 1988.
3. López, A. J. Barajas, R. J. A.: Manual de Laboratorio para Bacteriología y
Micología Veterinaria. Departamento de Bacteriología. FMVZ-UNAM. 1982.
4. Mac Faddin, J. F.: Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias
de Importancia Clínica. Médica Panamericana. México, D. F. 1984.
5. Miranda, M. R. E.: Material didáctico para Laboratorio de Bacteriología Y
Micología. Departamento de Bacteriología. FMVZ_ UNAM. 1994.
6. Pérez; M, J. A.: procedimientos de Laboratorio para bacteriología y
Micología Veterinarias. Departamento de Bacteriología. FMVZ_ UNAM.
1994.
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