Download Enzimas Transaminasas

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Laboratorio Nº 2
Tema: CATABOLISMO DE LOS AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIONES.
Contenidos conceptuales: Digestión de proteínas y absorción de aminoácidos.
Catabolismo
aminoacídico:
Desaminaciones
oxidativa
y
no
oxidativa.
Transaminaciones.
Contenidos procedimentales: Desarrollo del método colorimétrico para el dosaje de
la enzima glutámico-oxalacético-transaminasa (GOT, AST, ASAT) humana.
Determinación de la actividad de la glutámico-oxalacético-transaminasa en sueros
humanos normales controles, sueros de pacientes con hepatopatías y cardiopatías.
Contenidos actitudinales: Integración en trabajo grupal. Predisposición para la
resolución de problemas con espíritu crítico y rigor científico. Bioseguridad en el
laboratorio.
Autoconfianza.
Precisión, sistematización y coherencia en los
planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas.
Objetivos:
Comprobar la actividad biológica de la enzima glutámico-oxalacético-transaminasa en
sueros humanos normales controles, y en sueros de pacientes con hepatopatías y
cardiopatías.
Química Biológica II
FACENA, UNNE
Laboratorio Nº 2
2013
Fundamentos Teóricos
Los aminoácidos tienen un rol fundamental en los seres vivientes, ya que
constituyen las proteínas y son precursores de algunas hormonas y otros compuestos
de interés biológico (neurotransmisores, histamina, anillos porfirínicos, nucleótidos,
etc.). El organismo puede sintetizar una parte de los -aminoácidos necesarios para
el suplemento proteico y otra parte proviene de la dieta (aminoácidos esenciales).
Las transaminaciones son reacciones de intercambio de un radical NH2 entre
dos grupos carbonados, siendo reemplazado el radical amino por una función cetona.
El papel de las reacciones de transaminación es doble:
1. Permiten realizar la interconversión de los aminoácidos.
2. Posibilitan la separación de la parte nitrogenada de los aminoácidos aportados en
exceso, constituyendo el primer paso del catabolismo de muchos aminoácidos.
Las dos transaminasas más activas son la glutámico-oxalacético-transaminasa
(GOT) (aspartato-aminotransferasa (ASAT, AST)) y la glutámico-pirúvico-transaminasa
(GPT) (alanín-aminotransferasa (ALAT, ALT)).
Se presentan en muchos órganos, principalmente en hígado y músculo
cardíaco. Existen isoenzimas en citosol y mitocondria con K Michaelis= 1. Son de
gran interés clínico, ya que aumentan anormalmente sus niveles plasmáticos en
patologías hepáticas (GOT y GPT), como también en cardiopatías (GOT).
Método colorimétrico de determinación cuantitativa de la actividad biológica
(dosaje) de la GOT
Fundamento Químico del Método
Las transaminasas o aminotransferasas implican la interconversión de un par de
aminoácidos y un par de cetoácidos. Las reacciones son de carácter reversible y poseen como
cofactor el fosfato de piridoxal (derivado activo de la vitamina B6).
La reacción íntima implica la formación de aldiminas y cetiminas (bases de Schiff) con
los grupos amino transportados desde el aminoácido reaccionante al cetoácido aceptor.
La transaminasa glutamato-oxalacética cataliza la siguiente reacción:
COONa
COONa
CO
CH2
+
CH2
HCNH2
HCNH2
CH2
CH2
COONa
CH2
COONa
-cetoglutarato de sodio
COONa
COONa
CO
+
CH2
COONa
COONa
L-aspartato de sodio
L-glutamato de sodio
oxalacetato de sodio
El oxalacetato formado se determina fotocolorimétricamente mediante la formación de
la 2,4-dinitrofenilhidrazona, que en medio alcalino posee color rojo, y se mide entre 500 y 550
nm.
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El oxalacetato se descarboxila en parte a piruvato, y cuando se trata la mezcla de
reactantes y productos con 2,4-dinitrofenilhidrazina se forman, además de la 2,4dinitrofenilhidrazona del oxalacetato, las correspondientes al -cetoglutarato y piruvato, que en
solución alcalina también poseen color rojo.
Para reducir la contribución de la 2,4-dinitrofenilhidrazona del -cetoglutarato al color
total de la mezcla, la cantidad del mismo en el sustrato es subóptima (L-aspartato/cetoglutarato = 50/1) y se mide a una longitud de onda comprendida entre 500 y 550 nm, donde
las absortividades molares de las 2,4-dinitrofenilhidrazonas del oxalacetato o del piruvato son
mayores que las del -cetoglutarato.
Debido a esa inestabilidad del oxalacetato, que se descarboxila en parte a piruvato, es
la 2,4-dinitrofenilhidrazona de este último (que en solución alcalina posee el mismo color que la
del oxalacetato) la que se utilizará para la realización de la curva de calibración.
Materiales y Reactivos
Equipamiento necesario:
 Espectrofotómetro
 Baño termostatizado
 Muestras de sueros humanos normales y con patologías hepáticas y cardíacas
Cada alumno debe traer papel milimetrado.
Bibliografía:
- Bioquímica de Harper. Murray R. B. 12da. Edición. Editorial El Manual Moderno. 2001.
- Bioquímica. Lehninger A. L. 2da.edición. Editorial Omega. 1995.
- Bioquímica. Rawn J. D. Tomos I y II. 1ra. Edición. Ed. Interamericana - McGraw-Hill. 1989.
- Química Biológica. Blanco A. 7ma. Edición. Editorial El Ateneo. 2000.
- Clinical Chemistry. Richterich R. Academic Press, 1969
- Actas de Bioquímica Clínica Argentina. Vol. VI Nº 1, 1972
- American Journal of Clinical Pathology. Reitman S., Frankel F. 28:56, 1957
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Técnica:
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Informe:
Absorbancia blanco: ..............................
Absorbancia desconocido: .....................
Valor obtenido de la curva: ....................
Valor obtenido de la tabla de conversión:
Alumno: ............................................................ Comisión Nº: ...... Grupo: ...... Fecha: ...........
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