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Enzima AST (R2). Composición:
Stanbio AST / GOT Liqui-UV®
Para la determinación cuantitativa cinética de AST/GOT
en suero humano para procedimientos manuales
y/o automatizados
PRINCIPIO Y RESUMEN
La Aspartato Aminotransferasa (AST) es una de varias
enzimas que catalizan el intercambio de grupos amino y oxo
entre alfa-aminoácidos y alfa-oxoácidos. Está ampliamente
distribuida en los tejidos corporales con una cantidad
significativa en corazón e higado1. En pequeñas cantidades
se encuentra en músculo esquelético, riñones, páncreas,
bazo, pulmones y cerebro. El daño a estos tejidos da por
resultado una liberación de la enzima AST a la circulación
general. En el infarto del miocardio la AST sérica puede
empezar a incrementarse dentro de las 6-8 horas después
del ataque, con un pico a los 2 días y vuelve a la normalidad
para el cuarto o quinto día después del infarto2. En enfermedades como hepatitis, necrosis hepática, cirrosis y metástasis en hígado, se ha encontrado también aumento en las
concentraciones séricas de AST.3
Karmen4 es el primero en reportar un método cinético para
la medición de la actividad de AST en suero. Subsecuentemente, el método se ha ido modificando y optimizando
por Bergmeyer et al5.
Los procedimientos de ensayo para la medición de AST
es similar al método recomendado por la Federación
Internacional de Química Clínica (IFCC)6. La secuencia de
la reacción enzimática empleada en el presente ensayo es
como sigue:
AST
L-Aspartato + 2-Oxo-glutarato
Oxalacetato + L-Glutamato
MDH
Oxalacetato + NADH + H +
L-Malato + NAD+ + H2O
La AST cataliza la transferencia del grupo amino aspartato
a 2-oxoglutarato para producir oxalacetato y glutamato. El
oxalacetato formado en la primera reacción va a reaccionar
con el NADH en presencia de malato deshidrogenasa (MDH)
para formar NAD. La actividad de AST se determina midiendo
el valor total de oxidación del NADH a 340 nm. La lactato
deshidrogenasa se incluye en el reactivo para convertir el
piruvato endógeno de la muestra a lactato durante la fase
lag anterior a la medición.
REACTIVOS
AST Buffer (R1). Composición:
L-Aspartato
240 mmol/L.
MDH (músculo de porcino)
600 U/L.
LDH (músculo de conejo)
600 U/L.
Tris Buffer, pH 7.5
80 mmol/L.
2-Oxoglutarato
12 mmol/L.
NADH (sal disódica)
0.18 mmol/L.
Presentación: Equipo para 50 - 100 pruebas.
Precauciones: Para uso diagnóstico in vitro. Tome las
precauciones normales para el manejo de reactivos de
laboratorio. Los reactivos contienen azida de sodio que puede
ser tóxico si se ingiere. Se ha reportado que la azida de
sodio puede reaccionar con el plomo y cobre de tuberías,
pudiendo formar metales de azidas explosivas. Consulte
su hoja de seguridad para más información.
Preparación del reactivo: El Buffer y los reactivos enzimáticos líquidos están listos para su uso. Prepare el reactivo
de trabajo en una proporción de 5 partes de Buffer (R1) y
1 parte de enzima (R2); por ejemplo, 50 mL de Buffer y 10
mL de enzima.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO
Los reactivos son estables hasta su fecha de caducidad
marcada en la etiqueta cuando se almacena a 2-8 °C y están
protegidos de la luz. Los reactivos deben verse claros y sin
color. Descartar si se ven turbios o si contienen partículas.
El reactivo de trabajo es estable por 4 semanas a 2-8°C
o 5 días a temperatura ambiente (15 - 25°C). El reactivo de
trabajo deberá desecharse si la absorbancia inicial leída contra
agua a 340 nm es menor de 1.100
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO INCLUIDOS
-
Espectrofotómetro capaz de realizar lecturas de absorbancia a 340 nm con 1 cm de paso de luz.
-
Baño de temperatura constante a 37ºC o portacubeta de
temperatura controlada.
-
Pipetas serológicas o automáticas
-
Tubos de ensayo
-
Cronómetro.
RECOLECCIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA
Suero no hemolizado es la muestra de elección. Debe
utilizarse plasma tratado con EDTA o plasma con heparina.
Siempre que sea posible, las muestras deben separarse y
analizarse el mismo día que se recolectan. Guarde el suero
en tubos bien tapados. La enzima en suero se reporta
estable por un mínimo de 7 días a 2-8°C).
SUBSTANCIAS INTERFERENTES
La hemólisis debe ser evitada ya que la concentración de
AST en los glóbulos rojos excede 10 veces la del suero7.
Si tenemos niveles de bilirrubina de hasta 40 mg/dL y de
triglicéridos hasta 2000 mg/dL, no habrá interferencia en
esta prueba11. Es conocido que ciertas drogas y substancias afectan los valores de AST9.
PROCEDIMIENTO MANUAL
por este método.
1. Prepare el reactivo de trabajo de AST de acuerdo a las
instrucciones.
Muestras ictéricas y con turbiedad marcada requerirán un
blanco de muestra.
2. Calibre a cero el espectrofotómetro a 340 nm con agua
destilada.
VALORES ESPERADOS
3. Por cada Muestra y Control, agregar 1.0 mL de reactivo
de trabajo a la cubeta o tubo de ensayo y llevar a 37°C
por 3 minutos.
4. Adicionar 100 µL (0.10 mL) de suero a cada tubo respectivamente y agitar levemente.
5. Leer y anotar la absorbancia al minuto 1. Continúe
incubando a 37°C y anotar el cambio de absorbancia
a los 2 y 3 minutos. El cambio debe ser constante.
6. Determine el cambio de absorbancia por minuto (DA/
min) y multiplicar por el factor 1746 para obtener los
resultados en U/L.
NOTA: Si la cubeta no está a temperatura controlada, incube
las muestras a 37ºC entre lectura y lectura.
CONTROL DE CALIDAD
Se recomiendan los sueros control Ser-T- Fy I Normal y
Ser- T- Fy II Anormal de Stanbio en cada ensayo. Otros
controles comerciales disponibles con valores de AST
probados por este método también pueden ser utilizados.
La actividad de AST determinada en estos materiales y por
este método deberá caer dentro de los rangos establecidos
para los controles. Dos niveles de controles deben ser
analizados en cada ensayo.
CALIBRACIÓN
La actividad de AST se basa en el Coeficiente de Extinción
Micromolar del NADH a 340 nm (véase RESULTADOS).
La guía de calibración del fabricante, deberá ser seguida
para calibrar su analizador. Probando el contenido de ALT
de un suero control con valores de AST conocidos, éste
puede ser utilizado para asegurar que la calibración del
instrumento ha sido realizada correctamente.
RESULTADOS
Los valores se derivan en base al “coeficiente de extinción de
absortividad micromolar” de NADH a 340 nm (0.0063). Una
unidad por litro (U/L) de actividad de AST/GOT, es la cantidad
de enzima que oxida un µmol/L de NADH por minuto.
U/L =
∆A/min
x
Absortividad
U/L =
∆A/min
0.0063
x
Rango normal: 8 - 33 U/L (37ºC)
El rango deberá servir solamente como guía. Se recomienda
que cada laboratorio establezca su propio rango de valores
normales ya que existen diferencias entre instrumentos,
laboratorio y población local.
CARACTERÍSTICAS
Comparación: Se analizó un grupo de 62 muestras dentro
de un rango de actividad de AST de 12 - 463 U/L por el
método AST descrito y también por el de un reactivo comercial similar disponible. La comparación de los resultados
obtenidos proporcionó un coeficiente de correlación de
0.993 y con una ecuación de regresión de y = 0.988 x +
0.43. ( La comparación de estudios se llevó a cabo de
acuerdo a la guía tentativa NCCLS EP9-T).
Precisión: Se estableció un intraensayo de 20 ensayos con
tres diferentes niveles de sueros controles comerciales. La
precisión de valores totales fue obtenida probando estos
3 controles comerciales por cinco días consecutivos.
ENTRE ENSAYO
Suero 1
Suero 2
Suero 3
Media ALT (U/L)
25
51
116
Desviación Std. (U/L)
0.8
1.6
0.9
C.V. (%)
3.3
3.1
0.8
PRECISION TOTAL
Suero 1
Suero 2
Suero 3
Media ALT (U/L)
26
49
115
Desviación Std. (U/L)
1.1
0.7
0.8
C.V. (%)
4.4
1.4
0.7
Se llevaron a cabo estudios de precisión de acuerdo con
la guía tentativia de la NCCLS, EP5-T.
Linealidad. Es lineal hasta 600 U/L a 37°C de acuerdo a la
guía NCCLS, EP6-P.
Volumen Total
Volumen de Muestra
Sensibilidad. En base a la resolución del instrumento de
A = 0.001, éste método muestra una sensibilidad de 1.75 U/L.
1.10
0.10
U/L = ∆A/min x 1746
REFERENCIAS
1. International Federation of Clinical Chemistry. Provisional
Concentrations of Enzymes. Clin Chem 23:887, 1977.
2. Wroblewski, F. and LaDue, J.S.Proc. Soc. Exper. Biol. And
Med. 91: 569 (1956).
LIMITACIONES
Si el cambio de ∆A/min es mayor de 0.342, diluya una
parte de muestra con 9 partes de solución salina isotónica
y repetir el ensayo. Multiplicar el resultado por 10. Los
valores de AST para recién nacidos no han sido establecidos
3. Karmen A : A note on thr spectrophotometric assay of
glutamic-oxalacetic transaminase in human blood J Clin
Invest 34:131, 1955
4. Bergmeyer H.U. Scheibe P, Wahlefeld AW: Optimization
of methods for aspartate aminotransferase and alanine
aminotransferase. Clin Chem 24: 58, 1978.
5. Bergmeyer, H.U, principles of Enzymatic Analysis Verlag
Chemic 1978
6. Young DS Effects of drugs on clinical laboratory tests.
AACC Press, Washington 1990.D.C.,
7. Henry JB Clinical Diagnosis and Management by laboratory
Methods. 17th W.B. Sanders Co. 1984, p 1437.
8. Stanbio Laboratory Data.
Fabricado en EUA por:
Stanbio Laboratory
1261 North Main Street
Boerne TX; 78006.
Distribuido en México por:
Laboratorios Licon S.A.
Viveros del Rocío No. 33
Col. Viveros de la Loma
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