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COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA
HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU
CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
DANIEL AUGUSTO MARTÍNEZ VARGAS
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología
Bogotá D.C., Colombia
2016
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA
HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU
CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
DANIEL AUGUSTO MARTÍNEZ VARGAS
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Biología
Director:
MD., MSc., Ph.D., Carlos A. Guerrero Fonseca
Codirectora:
Bacterióloga, MSc., Dioselina Peláez Carvajal
Grupo de Investigación:
Grupo de Virología, Instituto Nacional de Salud
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología
Bogotá D.C., Colombia
2016
En memoria de mi madre, siempre presente
Necesitamos
otra
educación
para
otra
sociedad y otra sociedad para otra educación.
Karl Marx
Agradecimientos
A la Dra. Dioselina Peláez por todo el apoyo antes, durante y después de la realización
del proyecto. Gracias por ser un pilar en mi formación académica de posgrado y
profesional, además del cariño y la amistad brindada.
A Mariel Palacios, por TODO.
Al Grupo de Virología del Instituto Nacional de Salud, por permitirme crecer
profesionalmente, y facilitar las instalaciones para la realización del trabajo.
Al Dr. Carlos Guerrero por su dirección y aportes para el desarrollo del trabajo.
A mis profesores de Seminario de Investigación, Luis Fernando García y Nubia Matta,
aportaron valiosos consejos.
A la Universidad Nacional de Colombia y el programa de Biología, por la formación
personal y profesional.
A COLCIENCIAS por el financiamiento del proyecto, a través del contrato de cooperación
INS-ACAC-COLCIENCIAS No. 710-2013, Código No. 2010456935048.
Resumen y Abstract
IX
Resumen
El virus de la hepatitis E (VHE) causa 20 millones de infecciones al año y cerca de 60000
muertes, aunque por lo general causa una infección autolimitada, puede llegar a
provocar una falla hepática aguda con tasas de mortalidad entre 0,5% y 4%.
Algunos estudios realizados en Colombia han demostrado la circulación del VHE en el
país, sin embargo no se ha estudiado a fondo el comportamiento del virus.
El presente trabajo estudió la evidencia de coinfección VHE y virus de la hepatitis A
(VHA), B (VHB) y/o C (VHC), y la caracterización de genotipos del VHE, en 1097
muestras de suero obtenidos de pacientes con diagnóstico de hepatitis viral remitidos al
Instituto Nacional de Salud en el periodo 2004 – 2014 de los 32 departamentos de
Colombia, con marcadores serológicos de infección VHA, VHB y VHC.
Se analizó la presencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE en los 1097 sueros y
posteriormente se detectó el genoma del VHE mediante nRT-PCR y se secuenciaron los
productos. Se detectaron anticuerpos IgM e IgG anti-VHE en muestras de pacientes con
hepatitis A (16,1 y 33,6%, respectivamente), hepatitis B (8,1 y 23,4%) y hepatitis C (5,8 y
35,4%). Este porcentaje resulta alto teniendo en cuenta que el VHE tiene diferente ruta
de transmisión (fecal-oral) respecto al VHB y VHC (parenteral). Por nRT-PCR resultaron
positivas 33,3% de muestras IgM anti-VHE (+) y 40% en las muestras IgG anti-VHE (+).
Mediante esta técnica se logró establecer la presencia del VHE en la mayoría de los
departamentos del país. Con el análisis filogenético de las secuencias se determinó que
el VHE subtipo 3a es el que circula en país. Estos resultados abren la puerta a futuros
estudios sobre el VHE, determinar la prevalencia en el país en población general,
investigar la relevancia epidemiológica del genotipo y plantear la necesidad que se
incluya a la hepatitis E dentro del diagnóstico de las hepatitis virales en el país.
Palabras clave: Coinfección, VHE, VHA, VHB, VHC, genotipos, filogenético.
X
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Abstract
Hepatitis E virus (HEV) causes 20 million infections per year and about 60000 deaths,
although usually causes a self-limited infection can even cause acute liver failure with
mortality rates between 0.5% and 4 %. Previous studies in Colombia have demonstrated
the circulation of HEV in the country, but has not been thoroughly studied the behavior of
the virus.
This paper studied the evidence HEV coinfection with HAV, HBV and HCV viruses, and
characterization of HEV genotypes, in 1097 serum samples obtained from patients
diagnosed with viral hepatitis sent to Instituto Nacional de Salud in the period 2004 - 2014
of the 32 departments of Colombia, with serological markers of HAV, HBV and HCV
infection.
The presence of anti-HEV IgG and IgM antibodies HEV was analyzed in the 1907 sera
and subsequently HEV genome was detected by nRT-PCR and products were
sequenced. Anti-HEV IgM and IgG antibodies were detected in samples from patients
with hepatitis A (16.1 and 33.6%, respectively), hepatitis B (8.1 and 23.4%) and hepatitis
C (5.8 and 35.4%). This percentage is high considering that HEV has different
transmission route (fecal-oral) with respect to HBV and HCV (parenteral). By nRT-PCR
were positive 33.3% anti-HEV IgM (+) samples and 40% in the anti-HEV IgG (+) samples.
It was possible to establish the presence of HEV using this technique, in most
departments from Colombia. Phylogenetic analysis of the sequences showed that HEV
subtype 3a is circulating in the country. These results open the door to future studies on
HEV, to determine the prevalence in the country in general population, investigate the
epidemiological relevance of genotype and raise the need to include hepatitis E in the
diagnosis of viral hepatitis in the country.
Keywords: Coinfection, HEV, HAV, HBV, HCV, genotypes, phylogenetic.
Contenido
XI
Contenido
Pág.
1. Justificación ............................................................................................................... 5 1.1 Hipótesis de trabajo .............................................................................................. 6 1.2 Objetivos ............................................................................................................... 6 1.2.1 General ............................................................................................................. 6 1.2.2 Específicos ........................................................................................................ 6 2. Marco Teórico ............................................................................................................ 7 2.1 Historia del Virus de la Hepatitis E ....................................................................... 7 2.2 Taxonomía ............................................................................................................ 7 2.3 Propiedades físico-químicas y biológicas ............................................................. 8 2.4 Organización del genoma ................................................................................... 10 2.5 Heterogeneidad genética del VHE ..................................................................... 11 2.6 Ciclo de replicación............................................................................................. 13 2.7 Proteínas del VHE .............................................................................................. 14 2.7.1 ORF1............................................................................................................... 14 2.7.2 ORF2............................................................................................................... 15 2.7.3 ORF3............................................................................................................... 16 2.8 Patogénesis ........................................................................................................ 17 2.9 Hepatitis E y embarazo ....................................................................................... 19 2.10 Respuesta Inmunológica .................................................................................... 20 2.11 Epidemiología ..................................................................................................... 20 2.12 Diagnosis de la infección por el VHE .................................................................. 22 2.13 Seroprevalencia de la infección por el VHE ....................................................... 24 3. Materiales y métodos .............................................................................................. 25 3.1 Tipo de estudio ................................................................................................... 25 3.2 Selección de las muestras .................................................................................. 25 3.3 Pruebas serológicas ........................................................................................... 25 3.3.1 Detección de anticuerpos IgG anti-VHE ......................................................... 26 3.3.2 Detección de anticuerpos IgM anti-VHE ......................................................... 26 3.4 Pruebas moleculares .......................................................................................... 27 3.4.1 Extracción del ARN viral ................................................................................. 27 3.4.2 nRT-PCR......................................................................................................... 27 3.4.3 RT-PCR en tiempo real ................................................................................... 29 3.4.4 Secuenciación y análisis filogenético .............................................................. 30 4. Resultados................................................................................................................ 33 4.1 Coinfección y seroprevalencia del VHE en pacientes con diagnóstico de
hepatitis viral.................................................................................................................. 33 XII
4.2 4.3 4.4 COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Detección del genoma del VHE mediante nRT-PCR ......................................... 37 Detección cualitativa del ARN del VHE mediante RT-PCR en tiempo real ........ 40 Caracterización genotípica del VHE ................................................................... 42 5. Discusión................................................................................................................... 47 6. Conclusiones y recomendaciones .......................................................................... 53 6.1 Conclusiones ...................................................................................................... 53 6.2 Recomendaciones .............................................................................................. 54 Contenido
XIII
Lista de figuras
Pág.
Figura 2-1: Micrografía electrónica mostrando partículas del VHE aisladas de heces (39).
............................................................................................................................................ 9 Figura 2-2: Diagrama esquemático de partículas del VHE “envueltas” y “desnudas” (40). 9 Figura 2-3: Organización genómica del VHE. Adaptada de la referencia (1). .................. 10 Figura 2-4: Modelo propuesto de la replicación del VHE (3). ........................................... 13 Figura 2-5: Papel de la proteína ORF3 en la patogénesis del VHE (35). ......................... 17 Figura 2-6: Principales eventos patogénicos (virología, serología, enfermedad) durante la
infección aguda con el VHE (67). ...................................................................................... 18 Figura 4-1: Porcentaje de seroprevalencia a IgM anti-VHE por departamento, según el
número de muestras procesadas por ELISA. ................................................................... 36 Figura 4-2: Porcentaje de seroprevalencia a IgG anti-VHE por departamento, según el
número de muestras procesadas por ELISA. ................................................................... 37 Figura 4-3: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del
ARN del VHE. ................................................................................................................... 38 Figura 4-4: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del
ARN del VHE. ................................................................................................................... 38 Figura 4-5: Amplificación por nRT-PCR de algunas muestras de suero para las regiones
MeT (izquierda) y ORF2 (derecha). .................................................................................. 40 Figura 4-6: Amplificación por triplicado del estándar del VHE. ......................................... 41 Figura 4-7: Sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real para la detección del ARN del VHE.
.......................................................................................................................................... 42 Figura 4-8: Análisis filogenético de las secuencias del VHE obtenidas en este estudio. . 43 Figura 4-9: Región del genoma del VHE utilizada para la genotipificación del virus. ....... 44 Figura 4-10: Árbol filogenético construido mediante inferencia bayesiana basado en la
región ORF2 del VHE. ...................................................................................................... 45 Figura 6-1: Flujo de trabajo del proceso de secuenciación (Tomado de Applied Biosystem
BigDye® XTerminatorTM Purification Kit Protocol) ............................................................. 57 XIV
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Contenido
XV
Lista de tablas
Pág.
Tabla 3-1: Primers utilizados para la detección del ARN del VHE por nRT-PCR, descritos
previamente en (91, 92). ................................................................................................... 28 Tabla 3-2: Secuencias de la región ORF2 del VHE utilizadas para la construcción de los
arboles filogenéticos. ........................................................................................................ 31 Tabla 4-1: Muestras procesadas según el departamento de procedencia y el diagnóstico
de hepatitis viral. ............................................................................................................... 33 Tabla 4-2: Resultados de las pruebas ELISA para la determinación de anticuerpos IgG e
IgM anti-VHE en sueros positivos para la presencia de marcadores serológicos para
VHA, VHB y VHC. ............................................................................................................. 35 Tabla 4-3: Resultados serológicos positivos para anticuerpos anti-VHE según el grupo de
edad. ................................................................................................................................. 35 Tabla 4-4: Amplificación de las regiones ORF1 y ORF2 del VHE mediante nRT-PCR en
sueros positivos para anticuerpos anti-VHE. .................................................................... 39 Tabla 4-5: Amplificación del ARN del VHE en sueros positivos para anticuerpos anti-VHE.
.......................................................................................................................................... 39 Contenido
XVI
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura
ALAT
ARN
ASAT
ELISA
FHA
GTR
HBsAg
Hel
HNANB
IgG
IgM
IME
INS
MeT
min
OMS
ORF
pb
PCP
RdRp
RIBA
rpm
RT-PCR
s
VHA
VHB
VHC
VHE
Término
Alanina-aminotransferasa
Ácido Ribonucleico
Aspartato-aminotransfera
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Falla Hepatica Aguda
General Time Reversible
Antígeno de superficie de la hepatitis B
Helicasa
Hepatitis No A No B
Inmunoglobulina G
Inmunoglobulina M
Inmunomicroscopía Electrónica
Instituto Nacional de Salud
Metiltransferasa
Minutos
Organización Mundial de la Salud
Open Reading Frame
Pares de bases
Papain-like Cysteine Protease
ARN polimerasa dependiente de ARN
Recombinant Immunoblot Assay
Revoluciones por minuto
Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction
Segundos
Virus de la Hepatitis A
Virus de la Hepatitis B
Virus de la Hepatitis C
Virus de la Hepatitis E
Introducción
El virus de la hepatitis E (VHE) es el agente causal de la hepatitis E y la principal causa
de hepatitis transmitida por vía enteral en el mundo, siendo responsable de más del 50%
de los casos de hepatitis aguda en los países endémicos. Se estima que alrededor de
dos mil millones de personas están en riesgo de infección con el VHE por el hecho de
vivir en áreas endémicas. En países en vía de desarrollo el virus es transmitido
principalmente a través del agua causando brotes epidémicos graves, mientras que en
países desarrollados se presentan casos esporádicos en personas que habitan en
regiones con factores de riesgo para la transmisión. Sin embargo, el uso combinado de
técnicas serológicas y moleculares ha permitido confirmar una incidencia y prevalencia
mucho mayor que la esperada en países desarrollados (1).
Aunque el VHE fue descubierto desde 1983, muchas de sus características
epidemiológicas y clínicas hasta ahora se están elucidando. El VHE es transmitido
principalmente por la ruta fecal-oral y a través de alimentos, sin embargo se han
documentado otras rutas de transmisión incluyendo la transmisión persona a persona,
transmisión vertical y la infección a través de transfusiones de sangre (2). En la mayoría
de casos la hepatitis E aguda se presenta como un cuadro asintomático y se resuelve
espontáneamente, pero en algunos pacientes la infección puede progresar a falla
hepática aguda, estimándose unas tasas de mortalidad entre 0,5% y 4%. Es de especial
cuidado si se da una infección durante el embarazo, ya que provoca cuadros de falla
hepática aguda en mujeres embarazadas alcanzando hasta un 20%-25% de letalidad (3).
El VHE pertenece a la familia Heperividae, la cual está dividida dentro de los géneros
Orthohepevirus y Piscihepevirus. Las especies dentro del género Orthohepevirus están
designadas como Orthohepevirus A (aislados de humanos, cerdos, jabalíes, venados,
mangostas, conejos y camellos), Orthohepevirus B (aislados de aves), Orthohepevirus C
2
Introducción
(aislados de ratas, bandicuts, musarañas, hurones y visones) y Orthohepevirus D
(aislados de murciélagos) (4).
El VHE posee un genoma ARN de cadena simple de sentido positivo, con un tamaño de
7,2 kb y cuenta con tres marcos abiertos de lectura (5, 6). Se han reportado cuatro
genotipos que infectan a humanos, todos dentro de la especie Orthohepevirus A: los
genotipos 1 y 2 (VHE-1 y VHE-2) se encuentran exclusivamente en humanos; el genotipo
3 (VHE-3) infecta a humanos, cerdos, conejos, venados y mangostas; el genotipo 4
(VHE-4) hasta el momento solo se ha reportado en humanos y cerdos (4). El VHE-1 es la
principal causa de hepatitis E esporádica y epidémica en regiones en vía de desarrollo de
Asia y África, mientras que en Suramérica se han reportado casos aislados en
Venezuela, Uruguay y Argentina (7). El VHE-2 ha sido identificado en pacientes en
México, Chad y Nigeria (6, 8, 9). El VHE-3 ha sido encontrado en casos de hepatitis
esporádica en países desarrollados y se ha descrito una alta prevalencia en población
porcícola alrededor del mundo (10). El VHE-4 ha sido identificado en pacientes y cerdos
en Japón, China, Taiwán e India (11), y en Europa central (12-14). Aunque se han
definido varios subgenotipos dentro de estos cuatro genotipos, análisis recientes
sugieren que no es posible establecer límites concretos que los distinga con consistencia
(15, 16), sin embargo tales categorías pueden llegar a ser útiles para estudios
epidemiológicos (17).
La infección por el VHE puede ser diagnosticada indirectamente mediante la detección
en suero de anticuerpos anti-VHE o directamente por la detección del genoma del VHE
en la sangre o en materia fecal. Después de un periodo de incubación de 2-6 semanas,
una respuesta de anticuerpos IgM de corta vida es seguida por una respuesta de
anticuerpos IgG de larga duración. La presencia de IgM anti-VHE es un marcador de
infección aguda, mientras que la presencia de IgG anti-VHE es un marcador de infección
pasada (18). El ARN del VHE llega a ser indetectable en sangre después de tres
semanas del comienzo de los síntomas, pero puede ser detectado en heces durante las
dos semanas siguientes.
La coinfección del VHE con múltiples virus hepatotropos ocurre en varias combinaciones
de casos de hepatitis viral (hepatitis A, B y C), donde hay evidencia en torno a que la
infección simultánea con múltiples virus hepatotropos puede causar un curso clínico más
Introducción
3
severo (19). Un estudio en India reportó que la coinfección del VHE con el virus de la
hepatitis B (VHB) llega a ser del 18% detectada por ELISA (HBsAg e IgM anti-VHE
positivos) y un 6,25% detectando el genoma del VHB y el VHE por PCR en tiempo real,
indicando que la coinfección del VHE+VHB puede ocurrir (20). Por otro lado, algunos
estudios han reportado que la tasa de coinfección del VHE con el virus de la hepatitis A
(VHA) llega al 11,5% (21), haciendo necesaria la detección del VHE para la planeación
de estrategias de vacunación y mejores programas sanitarios. La coinfección entre el
VHC y el VHE ha sido documentada desde hace varios años, mostrando desde entonces
una asociación llamativa entre los dos virus (22), debido a sus características
epidemiológicas tan diferentes.
En Colombia hasta el momento es poca la información que se tiene sobre la presencia
del VHE, solo algunos estudios regionalizados (23-25) y otro en algunos departamentos
del país (26), además no existen datos sobre la coinfección con otros virus hepatotropos
a nivel nacional. Por esta razón se planteó detectar serológica y molecularmente la
coinfección del VHE y otros virus hepatotropos (VHA, VHB, VHC), en sueros
provenientes de pacientes con diagnóstico de hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C, y
caracterizar el genotipo del VHE que circula en Colombia.
1. Justificación
El virus de la hepatitis E ha sido identificado desde 1997 como el principal agente
etiológico de hepatitis entérica en seres humanos, este hallazgo se logró en la epidemia
del valle de Cachemira (India), la cual fue importante para demostrar que el causante de
dicha infección no era el virus de la hepatitis A sino un agente de tipo no A, no B
(HNANB), indicando finalmente la existencia de otro virus de la hepatitis humana (27). De
otro lado se considera que los cerdos son un importante reservorio, siendo el primer
animal donde se encontraron cepas del VHE pertenecientes al genotipo 3. La incidencia
de la enfermedad en países desarrollados de América como Estados unidos es
desconocida; sin embargo varios estudios realizados en muestras de suero reportadas
negativas para virus de la hepatitis A, B, C revelaron la presencia de anticuerpos antiVHE considerándose como un indicador de exposición al virus (28).
Debido a que la coinfección del VHE con otros virus hepatotropos ha sido poco
documentada y en la mayoría de los casos está relacionada con falla hepática Aguda
(FHA) y un aumento de ALAT (alanina-aminotransferasa) y ASAT (aspartatoaminotransfera) (29), al alto porcentaje reportado de anticuerpos IgG anti-VHE (56.7%)
encontrados en pacientes con hepatitis B (HBsAg), 52.0% en pacientes con hepatitis C y
34.1% en pacientes con hepatitis A (30); y que hay evidencias de infección dual y
coinfección en algunas regiones de Colombia (25, 26), se hace indispensable realizar un
estudio para determinar un porcentaje de seroprevalencia y coinfección que incluya todo
el territorio colombiano.
Con la determinación de la presencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE y la búsqueda
de ARN del VHE por RT-PCR en muestras de suero obtenidos de pacientes procedentes
de diferentes departamentos de Colombia se detecta la circulación, se establece el
genotipo del virus, y la incidencia de infecciones mixtas virales por virus hepatotropos en
nuestro país. Los resultados obtenidos permitirán aportar datos importantes sobre la
6
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
coinfección de virus hepatotropos clásicos con el VHE. A nivel de Salud Pública esta
información es relevante para lo toma de decisiones y la actualización del protocolo de
vigilancia epidemiológica.
1.1 Hipótesis de trabajo
Con la evidencia de circulación del VHE en Colombia, y teniendo en cuenta que el país
presenta incidencias intermedias del VHA y en algunas regiones de VHB, es posible
establecer casos de coinfección del VHE con otros virus hepatotropos.
1.2 Objetivos
1.2.1 General
Determinar los casos de coinfección del Virus de la Hepatitis E en sueros provenientes
de pacientes con diagnóstico de hepatitis A, B o C, atendidos en el periodo 2004-2014 en
los 32 departamentos de Colombia.
1.2.2 Específicos

Establecer el porcentaje de seroprevalencia y coinfección entre VHE y otros virus
hepatotropos mediante ELISA de tercera generación, en sueros de pacientes con
diagnóstico de hepatitis virales causadas por VHA, VHB y/o VHC.

Establecer el genotipo y subtipo del VHE que circula en Colombia mediante RT- PCR
convencional en la población de estudio.

Estandarizar la técnica de RT-PCR en tiempo real para detectar el genoma del VHE
en sueros.
2. Marco Teórico
2.1 Historia del Virus de la Hepatitis E
Estudios realizados en India de grandes epidemias de hepatitis transmitidas por agua en
los años 50 del siglo XX, atribuidas inicialmente a hepatitis A, sugirieron la existencia de
otro agente etiológico de hepatitis viral de transmisión entérica NANB, la cual fue
nombrada tiempo después hepatitis E (27, 31). El VHE fue descubierto en 1983 cuando
se estaba investigando un brote de HNANB en soldados soviéticos en Afganistán,
identificando las partículas virales en las heces de un investigador que ingirió una mezcla
de extractos fecales del personal militar afectado, mediante inmunomicroscopía
electrónica (IME) (32). Hasta 1990 la IME y la infección a primates eran la única forma de
estudiar el virus de la hepatitis E, posteriormente el genoma viral fue clonado y
secuenciado
usando
muestras
de
bilis
obtenidas
de
macacos
infectados
experimentalmente (6, 33). La primera cepa animal del VHE, designada como VHE
porcino, fue identificada y caracterizada en 1997 en cerdos de Estados Unidos,
estableciendo por análisis filogenéticos que la cepa del VHE porcina estaba
estrechamente relacionada con las cepas del VHE humanas, reconociendo por primera
vez un problema potencial de salud pública por zoonosis (34).
2.2 Taxonomía
Basados en los estudios de IME y del genoma del VHE, al principio se clasificó dentro de
la familia Picornaviridae (32). Años más tarde se demostró que el VHE no compartía
características físicas ni antigénicas con los Picornavirus, pero compartía características
morfológicas con el virus Norwalk, siendo de esta manera clasificado provisionalmente en
la familia Caliciviridae en el género Hepevirus. De acuerdo a esta clasificación el VHE
compartía características similares con los Calicivirus tales como: no poseían envoltura,
presentaban semejanza en la organización del genoma en donde las proteínas no
8
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
estructurales se encuentran codificadas en el extremo 5’ y las proteínas estructurales en
el extremo 3’. Sin embargo el orden de los genes del VHE difería de los Calicivirus, y
apoyados en análisis filogenéticos comparativos, se excluyó al VHE de esta familia (35).
Como la secuencia del VHE no tenía una relación cercana con ninguno de los virus
identificados, se realizó la clasificación filogenética mediante el análisis de genes no
estructurales del VHE. Después de muchos estudios basados en la biología molecular
del VHE, el Comité Internacional de Taxonomía de Virus en mayo de 2005 clasificó el
VHE como único miembro del género Hepevirus en la familia Hepeviridae (36). Sin
embargo, las descripciones publicadas sobre divisiones taxonómicas dentro de la familia
Hepeviridae continuaban siendo contradictorias en relación a la definición de especies y
genotipos. Siguiendo la información existente de secuencias del VHE, a través de
análisis filogenéticos más rigurosos, la familia se dividió dentro de los géneros
Orthohepevirus y Piscihepevirus, ubicando al VHE humano y al VHE porcino en la
especie Orthohepevirus A dentro del género Orthohepevirus (4), clasificación aceptada
por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus.
2.3 Propiedades físico-químicas y biológicas
Con los estudios de IME se observó que el VHE presenta una simetría icosaédrica, con
forma esférica y un diámetro de 27-32 nm, presencia de picos en la superficie en forma
de copa y muescas similares a los Calicivirus (37). A pesar de que las micrografías
electrónicas muestran que los viriones encontrados en materia fecal son no envueltos
(Figura 2-1), algunos análisis filogenéticos indican que el VHE está estrechamente
relacionado con la familia Togaviridae, una gran familia de virus envueltos (38). Aunque
aún no han sido visualizados por microscopia electrónica, los virus circulantes en la
sangre durante la hepatitis E aguda tienen una densidad de flotación aproximada de 1,15
g/cm3 en gradientes de sucrosa y están asociados con lípidos (39), diferentes de los
viriones excretados en heces que presentan una densidad aproximada de 1,27 g/cm3. La
proteína ORF3 se encuentra en los virus derivados de suero pero no en los viriones
desnudos aislados de heces. Estos datos indican que las partículas del VHE que circulan
en la sangre muy probablemente son virus envueltos, por lo cual se ha propuesto
nombrar a estas partículas virales como VHE envuelto (VHEe) (40).
Marco Teórico
9
Figura 2-1: Micrografía electrónica mostrando partículas del VHE aisladas de heces (40).
Las partículas del VHE son liberadas del hepatocito como viriones asociados a lípidos de
la membrana celular acompañados por la proteína ORF3 sobre su superficie. Los lípidos
y la proteína ORF3 son disociados del virión una vez este entra en el ducto biliar, el cual
contiene detergente (ácido deoxicolico), y en el duodeno que contiene proteasas
(tripsina) secretadas desde el páncreas (41). Así, las partículas del VHE se encuentran
como virus envueltos en la sangre y como virus no envueltos o desnudos en heces
(Figura 2-2), clasificando al VHE no como un virus desnudo, si no como un virus “cuasienvuelto”, similar al VHA (40).
Figura 2-2: Diagrama esquemático de partículas del VHE “envueltas” y “desnudas” (41).
10
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
2.4 Organización del genoma
El VHE posee un genoma de ARN de sentido positivo, cadena sencilla y un tamaño de
7,2 kb, el cual tiene una 7-metil guanina en el extremo 5’ y una cola poli-A en el extremo
3’ (6, 33). En los extremos 5’ y 3’ tiene regiones no traducidas (UTR), una región
conservada de 58 nucleótidos después de la región 5’ UTR y una secuencia que es
homologa a los alfavirus. El genoma contiene tres marcos abiertos de lectura (ORF) que
codifican para proteínas estructurales y no estructurales (Figura 2-3).
Figura 2-3: Organización genómica del VHE. Adaptada de la referencia (1).
El ORF1 se encuentra entre los nucleótidos 28-5107, donde se presenta una gran
heterogeneidad entre las secuencias de diferentes aislados del VHE (42). Codifica una
poliproteína no estructural de 1693 aminoácidos, que sufre modificaciones posttraduccionales para producir cuatro proteínas funcionales: una metiltransferasa (MeT),
una cisteína proteasa similar a la papaína (PCP), una helicasa (Hel), y una ARN
polimerasa dependiente de ARN (RdRp). También contiene dos dominios (X, Y) y una
región rica en prolina hipervariable (V), con una alta variación nucleotídica entre
Marco Teórico
11
diferentes aislados del VHE. Estos dominios podrían estar involucrados en la replicación
del ARN viral y/o la transcripción, mediante el reclutamiento de factores celulares del
complejo de replicación (43).
El ORF2 se extiende desde el nucleótido 5147 hasta el 7127, separado por 38 pb
después del ORF1 en la dirección 3’. Codifica una proteína estructural proORF2, de 660
aminoácidos, que después de la escisión del péptido señal pasa a su forma madura que
es capaz de auto-ensamblarse y glicosilarse para convertirse en la cápside viral (1). La
proteína ORF2 presenta tres dominios lineales: el dominio S, y los dominios M y P que
están involucrados en la interacción del virus con la célula huésped (44). El dominio P
está expuesto hacia el exterior, siendo el sitio de unión de anticuerpos neutralizantes así
como el blanco para algunas de las vacunas que están siendo desarrolladas actualmente
(1).
El ORF3 está comprendido entre los nucleótidos 5128-5497, se solapa con ORF1 y
ORF2, comenzando un nucleótido antes de la finalización de ORF1 y totalmente
solapado con ORF2. La proteína ORF3 tiene una longitud de 114 aminoácidos y es
traducida de un ARN subgenómico bicistrónico (45). ORF3 es una fosfoproteína
estructural que interactúa con el citoesqueleto del hepatocito, contiene dos dominios
hidrofóbicos (D1 y D2), y dos ricos en prolina (P1 y P2). Esta proteína está relacionada
con la patogenicidad del VHE afectando tres procesos biológicos del hepatocito:
promueve la supervivencia celular y la proliferación, modula la respuesta inmunológica en
la fase aguda, y actúa como inmunosupresora (46).
2.5 Heterogeneidad genética del VHE
Un solo serotipo se ha descrito para el VHE, pero existe una gran diversidad genética
entre las diferentes cepas del virus (47). Las variantes del VHE han sido detectadas en
diferentes poblaciones humanas y en animales domésticos y salvajes tales como cerdos,
jabalíes, venados, conejos y mangostas. Las variantes que infectan humanos han sido
clasificadas dentro de cuatro genotipos: los genotipos 1 (VHE-1) y 2 (VHE-2) son
transmitidos fecal-oralmente entre humanos, los genotipos 3 (VHE-3) y 4 (VHE-4) pueden
ser transmitidos a humanos de una manera zoonótica desde cerdos, venados y jabalíes
12
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
infectados. Estos genotipos han sido subdivididos dentro de numerosos subtipos, aunque
los criterios para realizar dicha clasificación aún son controversiales (15).
A pesar de contar con una estructura genómica conservada, los análisis filogenéticos
dentro de la familia Hepeviridae son complicados por la dificultad en la alineación de las
secuencias genómicas de muchas variantes divergentes. Las identidades en las
secuencias de aminoácidos entre el virus de la trucha (género Piscihepevirus) y otros
miembros de la familia son solo del 26-27% (ORF1), 18-21% (ORF2) y 13-16% (ORF3).
En contraste, las identidades entre el VHE aislado de aves, ratas y del humano están en
42-49%, 42-55% y 20-29%, respectivamente (4). Comparaciones de secuencias
genómicas completas del VHE revelan una diferencia inter-genotípica de 23,6-27,7%,
entre los cuatro genotipos del VHE que afecta a humanos el VHE-1 tiene hasta un 11,8%
de diversidad intra-genotípica, mientras que el VHE-3 y VHE-4 muestran un amplio rango
de diversidad intra-genotípica (0-19,3% y 0,1-17%, respectivamente) (15). Para el VHE-2
solo se ha determinado la secuencia del genoma completo para la cepa mexicana, las
cepas de África se han secuenciado parcialmente (regiones del ORF2), mostrando que el
VHE-2 puede ser menos heterogéneo que el VHE-3 y VHE-4, pero puede ser más
heterogéneo que el VHE-1 (15).
La comparación de 75 secuencias del genoma completo del VHE evidencia que la
diferencia inter-genotípica de la secuencia deducida de aminoácidos para ORF2
(cápside) está entre el 6,5-11,7%, mostrando un alto grado de conservación entre los
distintos genotipos, correlacionándose con la poca diversidad antigénica; por lo que se
explica que solo exista un solo serotipo del VHE. Sin embargo, a pesar de la limitada
heterogeneidad en aminoácidos, existe un grado significativo de variabilidad en las
secuencias nucleotídicas entre diferentes cepas aisladas de diferentes partes del mundo
(15). Basados en diferentes análisis filogenéticos de varias cepas del VHE, los cuatro
genotipos se han dividido dentro de diferentes subtipos (11): de tal manera el VHE-1 ha
sido dividido en cinco subtipos (a-e), el VHE-2 en dos subtipos (a-b), el VHE-3 en diez
subtipos (a-j), y el VHE-4 en siete subtipos (a-g).
Marco Teórico
13
2.6 Ciclo de replicación
El VHE es muy difícil de replicar en sistemas de cultivo celular in vitro, sin embargo ha
habido infecciones y replicaciones exitosas en células derivadas de carcinoma
hepatocelular humano (PLC/PRF/5) y células derivadas de cáncer de pulmón humano
(A549) (41). Debido a esto, el modelo propuesto para la replicación del VHE está basado
en las similitudes y homología de la secuencia con otros virus ARN de sentido positivo
bien caracterizados de la súper-familia de los alfavirus, traducción mediada por la 7-metil
guanina en el extremo 5’ del genoma, traducción parcial del genoma (ORF1) (48),
síntesis de un ARN subgenómico para la traducción del ORF2 y ORF3 (49) (Figura 2-4).
Figura 2-4: Modelo propuesto de la replicación del VHE (3).
Las principales células blanco para la replicación del VHE son los hepatocitos, aunque
otros sitios de replicación se han sugerido en cerdos y monos Rhesus (50). Las
partículas virales se concentran en la superficie de las células blanco a través de
proteoglicanos heparin-sulfato (HSPG, HSC70, y otros), que actúan como factores de
unión (1). Los receptores específicos de la célula para el VHE aún son desconocidos, sin
embargo caracterizaciones recientes evidencian que las proteínas HSP90 y Grp78
14
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
podrían estar involucradas como receptores (51). De tal manera el VHE se une a las
células susceptibles del hospedero mediante receptores específicos de alta afinidad y
entra al citoplasma mediante endocitosis mediada por clatrina (52). Una vez en el
citoplasma, el virión libera el ARN genómico que es traducido en las proteínas no
estructurales del ORF1. La RdRp sintetiza un ARN intermediario de sentido negativo a
partir del ARN genómico del VHE, que sirve como molde para la síntesis del ARN
subgenómico de 2,2 kb y para los transcritos del ARN genómico de sentido positivo (53).
El ARN subgenómico es traducido en las proteínas estructurales ORF2 (cápside) y ORF3
(54), una vez traducida ORF2 es transportada del retículo endoplasmático al aparato de
Golgi donde sufre modificaciones post-traduccionales, principalmente glicosilaciones
(55), y posteriormente empaca el ARN genómico en el citoplasma para ensamblar
nuevos viriones. Estos viriones son transportados a la membrana celular, donde la
proteína
ORF3
asociada
con
endomembranas,
recubre
las
partículas
virales
ensambladas y participa en el egreso del virus de la célula (41).
2.7 Proteínas del VHE
La cinética de la expresión de las proteínas del VHE (ORF1, ORF2, ORF3) durante el
ciclo de replicación viral aún no está completamente dilucidada, pero su expresión
durante la infección es confirmada por la presencia de anticuerpos específicos para cada
proteína en muestras obtenidas de pacientes y en modelos animales experimentales
(56).
2.7.1 ORF1
No es del todo claro si la poliproteína ORF1 es procesada en unidades bioquímicas
distintas. Se han detectado anticuerpos anti-MeT, anti-Hel y anti-RdRp (57), aunque otros
estudios de expresión en E. coli y líneas celulares HepG2 no evidencian el
procesamiento (58). En general se habla que la poliproteína contiene cuatro dominios
funcionales, que también están presentes en las proteínas no estructurales de otros virus
ARN de cadena positiva (59):
Marco Teórico

15
Metiltransferasa: los alineamientos de ORF1 sugieren que los residuos amino
terminal 60-240 pueden actuar como la MeT viral (59), que cataliza la formación de la
modificación 5’ del ARN viral al mostrar actividad guanina-7-metiltransferasa y
guaniltransferasa (60).

Proteasa: los alineamientos predicen la presencia de una PCP con una similitud
moderada a la proteasa del virus de la rubeola (59), en la región de aminoácidos 433592 de ORF1. Sin embargo, no se ha descrito ninguna actividad funcional para este
dominio.

Helicasa: este dominio contiene siete motivos conservados encontrados en las
helicasas SF-1, además tiene dominios NTPasa y de unión-ARN (59). Evidencia
experimental muestra una actividad helicasa de desenvoltura en la dirección 5’→3’,
como también una actividad ARN 5’-trifosfatasa que ayuda a la MeT en la
catalización del primer paso de la formación de la caperuza 5’ (61, 62).

RdRp: la región del VHE que comprende la RdRp está entre los nucleótidos 35465106. Es usada para replicar el ARN genómico a través de un ARN intermediario antigenómico. La RdRp se une al extremo 3’ del ARN genómico para comenzar la
síntesis de la banda complementaria de ARN. Se ha sugerido que la RdRp estaría
localizada en las membranas intracelulares del retículo endoplasmático, donde
también se llevaría a cabo la replicación del ARN (63).
2.7.2 ORF2
La proteína ORF2 es subunidad estructural de la cápside viral. Contiene un péptido señal
N-terminal que transloca la proteína dentro del retículo endoplasmático donde sufre Nglicosilación, que puede ser una ventaja para que el virus utilice las membranas celulares
de la célula huésped en su proceso de replicación y la maduración de la partícula viral.
La estructura de una partícula viral fue resuelta mediante microscopia electrónica,
mostrando que la cápside está compuesta principalmente por dímeros. ORF2 posee tres
dominios: S (Shell), M (Middle) y P (Protruding) (64), donde los epítopes neutralizantes
del VHE se ubican en el dominio P, de tal manera que los estudios inmunológicos sobre
ORF2 dan bases para el desarrollo de una vacuna contra el VHE (65). La caracterización
bioquímica y estructural de ORF2 también permite estudiar las interacciones del VHE con
las células blanco, con lo cual se ha evidenciado la interacción de ORF2 con proteínas
tales como Grp78/BiP, alfa-tubulina, HSPGs y HSP90 (66), aunque no se ha logrado
16
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
identificar el receptor celular del VHE y caracterizar completamente la toma del virus y las
vías de liberación del ARN viral en las células infectadas.
2.7.3 ORF3
ORF3 funciona como una proteína accesoria para el VHE, y existe evidencia que afecta
la respuesta del hospedero a la infección (Figura 2-5). Está fosforilada en un residuo de
serina y se asocia con el citoesqueleto de la célula huésped (67), donde se ha
evidenciado que su distribución intracelular se localiza en los endosomas de reciclaje
interactuando con los microtúbulos de la célula. Varios estudios de los distintos dominios
de ORF3 sugieren que esta proteína cumple un papel fundamental en la optimización del
ambiente celular para la infección viral y la replicación. ORF3 activa la quinasa Erk, cuya
activación prolongada genera una señal de supervivencia y proliferación celular. Las
células que expresan la proteína ORF3 también muestran altos niveles de hexoquinasa y
formas oligoméricas de un canal aniónico dependiente de voltaje, que conduce a la
atenuación de la señalización de muerte mitocondrial (45). Mediante su interacción con
los endosomas de reciclaje retrasa la internalización del receptor del factor de
crecimiento epidermal (EGFR), reduciendo los niveles del factor de transcripción
fosforilado pSTAT3 que activa la transcripción de los genes involucrados en la respuesta
inflamatoria del hospedero en la fase aguda (36).
La proteína ORF3, a través de su dominio P2, se une a la proteína celular Tsg101 (gen
de susceptibilidad tumoral 101) lo que incrementa la secreción de la alfa-1-microglobulina
por la célula huésped. Ya que la alfa-1-microglobulina es una proteína inmunosopresora,
se ha propuesto que el VHE utiliza a ORF3 para proteger a las células infectadas en el
hígado de la respuesta inmune del hospedero.
Marco Teórico
17
Figura 2-5: Papel de la proteína ORF3 en la patogénesis del VHE (36).
2.8 Patogénesis
La infección experimental en humanos y primates ha provisto datos con respecto a los
eventos patogénicos de la infección por el VHE, resultantes de la administración intragastrica o intravenosa del virus. Se conoce que la principal ruta de entrada del virus al
hospedero es oral, pero no existen suficientes datos clínicos o experimentales que
documenten que el VHE alcanza el hígado desde el tracto gastrointestinal a través de la
circulación portal hepática (68). El VHE es detectado en heces aproximadamente una
semana antes del comienzo de los síntomas y hasta por dos semanas después, mientras
que el ARN viral se ha encontrado en suero en casi todos los pacientes dentro de las dos
semanas siguientes al comienzo de los síntomas y continua siendo detectado en heces
por cerca de dos semanas (69), aunque ha habido reportes de periodos prolongados de
positividad para el ARN del VHE en suero desde 4 hasta 16 semanas (Figura 2-6).
18
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Figura 2-6: Principales eventos patogénicos (virología, serología, enfermedad) durante la
infección aguda con el VHE (68).
La respuesta de anticuerpos anti-VHE es detectada generalmente al tiempo del comienzo
de los síntomas. La IgM anti-VHE aparece en la fase temprana de los síntomas clínicos y
hasta por 4-5 meses, y la respuesta por la IgG comienza a desarrollarse poco después
de la respuesta por IgM, continuando con títulos altos desde 1 hasta 4 años después de
la fase aguda de la enfermedad (Figura 2-6). La aparición de anticuerpos anti-VHE en
suero es concordante con el comienzo de la elevación de la ALAT en suero y con
cambios histopatológicos en el hígado (68).
El periodo de incubación del VHE es aproximadamente de 21 días, la síntesis de
proteínas virales en los hepatocitos comienza 7 días después de la infección y alcanza su
máximo nivel coincidiendo con el pico de ALAT, detectando el virus en 70-90% de los
hepatocitos. Entre los factores que determinan la severidad de la enfermedad causada
por el VHE están: embarazo, uso de anticonceptivos, edad, pre-existencia de alguna
enfermedad hepática, la respuesta inmune del hospedero, genotipo del VHE, la dosis
infecciosa, entre otros (1). De acuerdo a los estudios patológicos, virológicos y
serológicos, el mecanismo patogénico de la enfermedad puede ser mediado por la
respuesta inmune del hospedero en vez de estar relacionado con los efectos citopáticos
causados por el VHE (68). La patología del hígado en la hepatitis E aguda es similar a la
observada en otras hepatitis virales agudas, presentando un desorden lobular con
Marco Teórico
19
distorsión reticular y la expansión del tracto portal con infiltración de linfocitos
inflamatorios y polimorfo-nucleares (70).
2.9 Hepatitis E y embarazo
El VHE tiene un comportamiento especial en mujeres embarazadas en ciertos países.
Estudios en India, Etiopía y Angola han mostrado que la incidencia de la infección por el
VHE en embarazadas es alto y una proporción significativa puede progresar a hepatitis
fulminante, con una tasa de mortalidad variando del 30–100% (71). La hepatitis E tiene
una alta incidencia y un curso severo en mujeres embarazadas en algunas regiones
geográficas de países endémicos para el VHE, tal como en el norte de India (72), sin
embargo en otros países endémicos la enfermedad presenta un curso benigno con poca
o ninguna morbilidad (73). Las diferencias en el desarrollo de la enfermedad en mujeres
embarazadas en distintas regiones puede ser el resultado de la exposición temprana al
virus durante la niñez, produciendo una inmunidad duradera y/o modificando las
respuestas posteriores a la exposición al virus, o debido a los genotipos predominantes
en cada área geográfica que pueden presentar diferencias en la virulencia (71). El daño
hepático severo por el VHE durante el embarazo puede estar relacionado con los
cambios inmunes y hormonales que ocurren durante este, así como también a factores
genéticos y ambientales.
Durante el embarazo el sistema inmune de la madre es alterado para tolerar al feto
genéticamente diferente, también se incrementan los niveles de hormonas esteroides
que pueden promover la replicación viral. Esto también inhibe directamente las células
hepáticas, lo que puede predisponer a falla hepática cuando se exponen a patógenos
infecciosos (74). Las hormonas esteroides también son inmunosupresoras y median la
apoptosis de los linfocitos a través del NF-κB, factor de transcripción que está
involucrado en el desarrollo y regeneración del hígado y sus efectos sobre el sistema
inmune. La ausencia de la proteína p65, componente del complejo NF-κB, produce daño
fulminante en el hígado, esta ausencia en pacientes embarazadas es probablemente la
responsable de una FHF (75). Las mujeres embarazadas infectadas con VHE y con FHF
presentan un conteo menor de células CD4 y un conteo mayor de células CD8, niveles
mayores de estrógeno, progesterona y β-HCG que pacientes VHE-negativos (76). Estos
20
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
resultados dan una explicación probable de la interacción del VHE con el sistema inmune
y sus efectos acentuados durante el embarazo.
2.10 Respuesta Inmunológica
La respuesta inmune celular ante la infección aguda por el VHE aún no está totalmente
caracterizada. Se ha observado una expansión de células CD4 en pacientes con VHE
comparados con controles (77). Un descenso en las células T productoras de IFNγ y
TNFα en pacientes con hepatitis E, seguido por una activación policlonal con ionomicina,
sugieren un defecto inherente en la activación de células T en individuos infectados con
VHE. La limitada reactividad inmune observada en el compartimento periférico puede ser
resultado de la migración y secuestro de células inmunes en el hígado (36).
Se han encontrado mayores títulos de anticuerpos anti-VHE y niveles más altos de
citoquinas pro-inflamatorias en pacientes con falla hepática aguda comparados con
pacientes con una hepatitis E aguda auto-limitada, mostrando que la estimulación de la
respuesta inmune tipo Th1 y Th2 puede jugar un papel en la falla hepática causada por la
infección con el VHE (78). Las células natural killer (NK) pueden estar involucradas en la
mediación de la respuesta inmune a la infección por VHE, ya que el aumento observado
en células CD4 puede reflejar un incremento en la población de células NK, que a su vez
produce la elevación de los niveles de IFNγ visto en pacientes con hepatitis E,
contribuyendo a la muerte de los hepatocitos (79). La actividad de NF-κB parece estar
alterada por el VHE (75), y ya que este factor nuclear está involucrado en la regulación
de la transcripción durante la respuesta a la infección, esta alteración puede sugerir
mecanismos por los cuales el VHE puede alterar y evadir la respuesta inmune del
hospedero (79).
2.11 Epidemiología
El VHE es considerado hiperendémico en países en vía de desarrollo como India,
Bangladesh y China, donde ocurren grandes brotes transmitidos por el agua asociados a
los genotipos VHE-1 y VHE-2. En estas regiones los brotes ocurren con frecuencia
separados por pocos años, con un comportamiento unimodal que puede durar unas
Marco Teórico
21
pocas semanas o epidemias prolongadas con varios picos que permanecen durante un
año, indicativo de una contaminación continua del agua. Los brotes son frecuentemente
posteriores a lluvias intensas e inundaciones lo que facilita la mezcla de excreciones
humanas con fuentes de agua potable, o a meses de verano secos y calientes donde los
contaminantes fecales aumentan su concentración por la reducción de los flujos y
corrientes de agua. Estudios sobre la seroprevalencia de IgG anti-VHE en la mayoría de
niños menores de 10 años en estas regiones muestran que no han sido expuestos al
VHE, incrementando dramáticamente entre los 15 y 30 años, con una meseta alrededor
de los 30 (18). En países con una alta endemicidad las tasas de prevalencia de
anticuerpos anti-VHE son mayores que las de los países de baja endemicidad, pero son
mucho menores que las esperadas de acuerdo a las frecuentes apariciones de brotes.
Además, las diferencias en las tasas de prevalencia de anticuerpos entre los países, a
veces no encajan bien con otros datos disponibles. Por ejemplo, las tasas de
seroprevalencia en la India son más bajas que las de Egipto, a pesar de que los brotes
de hepatitis E son comunes en los primeros y son prácticamente desconocidos en el
segundo, la razón de esto aún no es clara (80).
En regiones de baja endemicidad (Europa, Estados Unidos, Canadá, Australia, Nueva
Zelanda, Japón, Taiwán, Hong Kong, entre otros) son desconocidos grandes brotes y
solo se han reportado unos pocos brotes limitados a la transmisión por alimentos, donde
la enfermedad esporádica debida a la infección por VHE no es frecuente, formando solo
una minoría de todos los casos de hepatitis viral aguda (80). En general, en los países de
baja endemicidad la infección por el VHE se presenta en un rango de edad mayor que en
los de alta, y los pacientes infectados frecuentemente presentan otras enfermedades al
mismo tiempo como diabetes, enfermedades cardiovasculares y problemas hepáticos
previos (81). Varios estudios también han reportado tasas de seroprevalencia altas de
VHE (5 - 20%) en población de países industrializados, lo que sugiere una infección de
amplia difusión, que muy probablemente se produce en un nivel subclínico (82). La gran
mayoría de las infecciones que ocurren en regiones de baja endemicidad parecen ser
asintomáticas, por lo que se observan altas tasas de seroprevalencia en relación con el
bajo número de casos reportados. A diferencia de los genotipos VHE-1 y VHE-2, las
infecciones causadas por los genotipos VHE-3 y VHE-4 parecen causar hepatitis clínica
en sujetos de mediana edad y en adultos mayores, que es un comportamiento atípico ya
que la exposición al VHE es independiente de la edad y el sexo, y sugiere la presencia
22
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
de factores de riesgo del hospedero que pueden ser cruciales para la manifestación
clínica de la enfermedad (80).
Los modos de transmisión del VHE en casos esporádicos aún no son entendidos
completamente, y son de los aspectos más discutidos con respecto al VHE, existiendo
marcadas diferencias entre diferentes áreas geográficas (1). Además de la ingestión de
agua y comida contaminada, y la transmisión persona-persona, la transmisión vertical del
VHE de madre a hijo está documentada, mientras que no hay evidencia de transmisión
sexual (83). El contacto directo con animales infectados con VHE es otra posible ruta de
transmisión, donde estudios de seroprevalencia han mostrado que los veterinarios y
personal que maneja cerdos son más propensos a ser IgG anti-VHE positivos que la
población general (84). La transmisión parenteral también ha sido documentada en varios
países, pero su significancia aún no es clara (85-87).
2.12 Diagnosis de la infección por el VHE
Los síntomas de infección por el VHE en humanos son casi indistinguibles de otras
hepatitis virales, excepto por las características epidemiológicas y los factores de riesgo.
En áreas de alta endemicidad, muchos pacientes presentan un pródromo corto, seguido
por orina oscura e ictericia. Muchos pacientes se recuperan espontáneamente, pero
algunos desarrollan hepatitis aguda sintomática, y puede llegar a progresar en una
hepatitis crónica y falla hepática en pacientes inmunocomprometidos y en mujeres
embarazadas, respectivamente. En áreas con baja endemicidad los síntomas son más
variables, y algunos pacientes no presentan los síntomas típicos de hepatitis y/o valores
anormales en los parámetros del hígado (88).
Las pruebas de laboratorio para detectar la infección por el VHE incluyen pruebas
serológicas para la detección de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE y técnicas moleculares
para la detección del ARN viral. Actualmente la mayoría de laboratorios usan como
diagnóstico de una hepatitis E aguda la presencia de anticuerpos IgM anti-VHE en suero,
detectados mediante pruebas ELISA durante la fase aguda de la enfermedad y hasta por
5 meses. Los anticuerpos IgG anti-VHE son detectables después del aumento de IgM
con un incremento en sus títulos desde la fase aguda hasta la fase de convalecencia
Marco Teórico
23
(Figura 2-6), lográndose detectar hasta después de 5 años del comienzo de la fase
aguda de la enfermedad, por lo que un resultado IgG anti-VHE positivo es indicativo de
una exposición previa al VHE. Los ensayos ELISA usan como blanco proteínas
recombinantes o péptidos sintéticos del VHE correspondientes a epítopes de antígenos
de las proteínas estructurales ORF2 y/o ORF3 de las cepas México y/o Burma, sin
embargo los antígenos recombinantes derivados de ORF2 han mostrado mayor
sensibilidad y especificidad que los de ORF3. Varios kits ELISA comerciales usan
antígenos virales recombinantes unidos a la superficie de la fase sólida, en ensayos
indirectos o tipo sándwich de doble antígeno. Sin embargo, el desempeño de algunos kits
comerciales es considerado sub-optimo ya que varios estudios han demostrado
resultados discordantes, donde la sensibilidad varía en el rango del 17% al 100% y
algunos no detectan anticuerpos IgM en pacientes infectados con VHE-2 a VHE-4 (88).
La detección de anticuerpos IgM puede verse enmascarada por la competencia con los
anticuerpos IgG, que generalmente presentan mayores niveles. De tal manera, las
pruebas serológicas disponibles actualmente varían considerablemente en sensibilidad y
especificidad, complicando la interpretación y comparación de los resultados presentados
en diferentes estudios.
El virus puede ser detectado en heces una semana antes del comienzo de los síntomas y
puede ser excretado por cerca de dos semanas, encontrándose en algunos casos hasta
52 días después del comienzo de los signos clínicos; además, está presente en la sangre
alrededor de tres semanas después del comienzo de los síntomas. Teniendo en cuenta
que los niveles del ARN viral en heces y suero son transitorios, la ventana para detectar
el ARN es muy corta, requiriendo que la técnica aplicada para detectar el ARN viral sea
muy sensible y especifica (18). Las pruebas moleculares se utilizan como métodos
directos de diagnóstico de la infección con el VHE, mediante la detección del ARN del
virus en heces y suero. Aunque existen otros métodos basados en biología molecular, la
RT-PCR es el método más usado para la detección del ARN viral, usando tanto la
convencional como la RT-PCR en tiempo real. Se han desarrollado varios protocolos que
varían en la posición y longitud del genoma del VHE que se amplifica, donde en la
mayoría se utilizan primers que flanquean secuencias conservadas, por lo que la
identificación y caracterización del genotipo del VHE es llevada a cabo generalmente
mediante la secuenciación de los productos amplificados.
24
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
2.13 Seroprevalencia de la infección por el VHE
Las tasas de positividad para IgG en zonas endémicas son las que reflejan la frecuencia
de la infección por VHE en estas regiones. Aunque existen varios estudios sobre la
prevalencia de anticuerpos anti-VHE en diferentes grupos poblacionales, la seroepidemiologia de la hepatitis E en los países en desarrollo no es uniforme y por lo
general no sigue los patrones del curso clínico de la enfermedad. En zonas rurales del
sur de China donde la mayoría de infecciones por VHE producidas por el genotipo 4 son
zoonóticas, los anticuerpos IgG anti–VHE son raramente detectados en niños, pero tiene
un aumento significativo con la edad en jóvenes y adultos mayores (60-80%). La
seroprevalencia en mayores de 30 años ocurre en mayor proporción en hombres que en
mujeres (89).
En los países desarrollados la diferencia entre la seroprevalencia y la incidencia de la
hepatitis E es aún más marcada, a pesar de la alta seroprevalencia en muchos países
europeos y de Estados Unidos, la ocurrencia de la enfermedad generalmente es baja
(81). La prevalencia de los anticuerpos IgG anti-VHE es relativamente baja (3%) en la
población de países desarrollados (Tokio, Japón), en Francia (3.2%), en Cataluña,
España (7.3%), en el suroeste de Francia (16.6%), en el suroeste de Inglaterra (16%), y
un 21.3% en donantes de sangre en EE.UU. Estos datos en poblaciones donde se
diagnostica la infección aguda, hacen pensar en un curso de la infección de forma
subclínica. Así mismo la hepatitis E aguda no es diagnosticada en la mayoría de los
casos, bien sea porque no se realiza la serología o es diagnosticada como otras causas
de hepatitis (90).
3. Materiales y métodos
3.1 Tipo de estudio
Se llevó a cabo un estudio descriptivo retrospectivo donde se analizaron sueros
recolectados durante el periodo 2004 – 2014, almacenados en la seroteca del Grupo de
Virología del Instituto Nacional de Salud (INS) a -25 °C y con diagnóstico positivo para
hepatitis viral.
3.2 Selección de las muestras
Después de la revisión de los libros de registro y las bases de datos del laboratorio de
hepatitis del Grupo de Virología, se recolectaron 1097 muestras de suero que cumplían
los siguientes criterios de inclusión: sueros con diagnóstico clínico de hepatitis
confirmado por laboratorio positivo para hepatitis A, B y/o C; pacientes con un rango de
edad de 2 – 70 años; presencia de ictericia; cantidad suficiente para realizar las pruebas
serológicas y la extracción de ARN viral; y ausencia de características lipémicas y
hemólisis en las muestras. La infección por un virus de la hepatitis se evaluó por la
presencia de marcadores serológicos: IgM anti-VHA (hepatitis A), HBsAg (hepatitis B) y
RIBA para VHC (hepatitis C). Los sueros seleccionados se remitieron al INS para el
diagnóstico de hepatitis virales procedentes de los 32 departamentos de Colombia.
3.3 Pruebas serológicas
Los 1097 sueros fueron analizados para detectar anticuerpos IgG e IgM anti-VHE
mediante ELISA de tercera generación usando los kits comerciales DIA.PRO (Diagnostic
BioProbes s.r.l, Milán – Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante.
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COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
3.3.1 Detección de anticuerpos IgG anti-VHE
Se utilizó el kit ELISA de tercera generación HEV IgG de DIA.PRO para la determinación
cualitativa de anticuerpos IgG anti-VHE en los sueros. Las microplacas estaban
recubiertas con antígenos codificados recombinantes específicos del VHE derivados de
las
cepas
de
México
y
Burma,
que
permiten
identificar
los
determinantes
inmunodominantes y conservados de todos los genotipos del VHE (VHE-1, VHE-2, VHE3, VHE-4). La fase sólida se trató con la muestra diluida para la captura de los
anticuerpos IgG anti-VHE por el antígeno. Después de lavar para eliminar otros
componentes de la muestra, en la segunda incubación los anticuerpos IgG anti-VHE
unidos a la fase sólida se detectaron por la adición de anticuerpos policlonales
específicos anti-IgG humanos (anti-hIgG), marcados con peroxidasa de rábano (HRP). La
enzima capturada sobre la fase sólida, actúa sobre la mezcla sustrato/cromógeno,
generando una señal óptica que es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgG antiVHE presentes en la muestra. Un valor de corte permite que las densidades ópticas sean
interpretadas como resultados anti-VHE IgG positivos o negativos.
3.3.2 Detección de anticuerpos IgM anti-VHE
Para la detección de estos anticuerpos se utilizó el kit ELISA HEV IgM de DIA.PRO. Las
microplacas estaban recubiertas con antígenos sintéticos específicos del VHE
codificados para identificar determinantes conservados e inmunodominantes derivados
de las regiones ORF2 y ORF3 de los cuatro genotipos. Si los anticuerpos estaban
presentes en el suero, al agregarse la muestra diluida sobre la fase sólida los anticuerpos
IgM anti-VHE eran capturados por los antígenos adsorbidos en los pozos. Después de
los lavados, el resto de componentes presentes en la muestra que no se hayan unido a la
fase sólida son eliminados. En la segunda incubación los anticuerpos IgG anti-VHE
unidos a la fase sólida se detectaron por la adición de anticuerpos policlonales
específicos anti-hIgM, marcados con HRP. La enzima peroxidasa unida ahora a la fase
sólida de la placa, reacciona con el sustrato/cromógeno, generando una señal óptica que
es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgM anti-VHE presentes en la muestra.
Posteriormente, mediante un valor de corte calculado, las densidades ópticas pueden
interpretarse como resultados anti-VHE IgM positivos o negativos. La neutralización de
Materiales y métodos
27
IgG anti-VHE y el factor reumatoide se llevó a cabo directamente en el pozo, esto se
realizó para bloquear este tipo de interferencias.
3.4 Pruebas moleculares
Los sueros positivos para los marcadores serológicos IgM anti-VHE e IgG anti-VHE se
seleccionaron para la detección del ARN viral en suero mediante una RT-PCR anidada
(nRT-PCR) estandarizada en el laboratorio, y la genotipificación del virus.
3.4.1 Extracción del ARN viral
La extracción del ARN del VHE se realizó usando el kit comercial QIAamp® Viral RNA
Mini Kit (QIAGEN®, Brazil) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se adicionaron
140 µL de suero a 560 µL de buffer de lisis AVL que contenía ARN carrier (poli A),
mezclándolos mediante vortex durante 15 s e incubando la mezcla a temperatura
ambiente durante 10 min, tiempo suficiente para completar la lisis de la muestra. Una vez
completada la lisis, se adicionaron 560 µL de etanol (96-100%) y se homogenizó la
mezcla mediante vortex por 15 s. Se tomaron 630 µL de esta solución y se colocaron en
la columna QIAamp Mini que contenía la membrana de sílica donde se adsorbe el ARN
viral, y se procedió a centrifugar a 8000 rpm durante 1 min. Después de la centrifugación
se descartó el filtrado y se repitió el procedimiento anterior. Posteriormente, se
adicionaron 500 µL del buffer de lavado AW1 a la columna y se centrifugo nuevamente a
8000 rpm durante 1 min, y para asegurar una extracción eficiente y con un ARN de alta
pureza se volvió a lavar la columna con el buffer de lavado AW2 y se centrifugo a 14000
rpm durante 3 min. Para eluir el ARN unido a la membrana se colocó la columna en un
tubo para microcentrifuga de 1,5 mL, se le adiciono 60 µL de buffer AVE (agua libre de
RNasa con 0,04% de azida de sodio) incubando a temperatura ambiente por 1 min y se
centrifugo a 8000 rpm durante 1 min. El ARN extraído se almaceno a -30 °C hasta su uso
posterior en la amplificación por nRT-PCR.
3.4.2 nRT-PCR
La estandarización para la detección del ARN del VHE se realizó mediante nRT-PCR
usando dos sets de primers que amplificaban fragmentos de las regiones del ORF1 y
28
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
ORF2 (91), y adicionalmente un set de primers que amplificaba una región del ORF1
(92). Los primers externos para ORF1 (91) flanquean las posiciones 56-79 y 451-473 del
genoma según la cepa prototipo Burma (Código de acceso Gen Bank M73218) y
corresponden a la región que codifica para la MeT amplificando un fragmento de 418 pb,
mientras que los primers internos amplifican un fragmento de 287 pb. Los primers para
ORF1 (92) amplifican la región correspondiente a la RdRp de una longitud de 307 pb. Los
primers para ORF2 (91) amplifican un segmento de la cápside del VHE, los primers
externos amplifican un producto de 197 pb en la primera PCR, y los primers internos
amplifican un producto de 145 pb en la segunda PCR. El resumen de los primers usados
se presenta en la Tabla 3-1.
Tabla 3-1: Primers utilizados para la detección del ARN del VHE por nRT-PCR, descritos
previamente en (91, 92).
Primer
Sentido
Secuencia (5’ – 3’)
Posición en el
genoma1
ConsORF1-s1
Sentido (Externo)
CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC
56 – 79
ConsORF1-a1
Anti-sentido (Externo)
CCATCRARRCAGTAAGTGCGGTC
451 – 473
ConsORF1-s2
Sentido (Interno)
CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG
104 – 124
ConsORF1-a2
Anti-sentido (Interno)
GGCAGWRTACCARCGCTGAACATC
367 – 389
ConsORF2-s1
Sentido (Externo)
GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG
6289 – 6321
ConsORF2-a1
Anti-sentido (Externo)
CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC
6470 – 6494
ConsORF2-s2
Sentido (Interno)
GTYGTCTCRGCCAATGGCGAGC
6347 – 6368
ConsORF2-a2
Anti-sentido (Interno)
GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG
6466 – 6490
MJC1 RdRp
Sentido (Externo)
CATGGTAAAGTGGGTCAGGGTAT
4213 – 4235
MJC2 RdRp
Anti-sentido (Externo)
AGGGTGCCGGGCTCGCCGGA
4576 – 4595
MJC3 RdRp
Sentido (Interno)
GTATTTCGGCCTGGAGTAAGAC
4232 – 4253
MJC4 RdRp
Anti-sentido (Interno)
TCACCGGAGTGYTTCTTCCAGAA
4561 – 4583
1
La posición de los nucleótidos está asignada de acuerdo a la cepa Burma (M73218).
En la primera ronda de PCR se utilizó el kit QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN,
Brazil) con un volumen final de reacción de 25 μL: 5 μL de Buffer 5x RT-PCR, 1 μL de
dNTPs 10 mM, 1 μL de cada primer externo 10 μM, 1 μL del mix de enzimas y 3 μL del
ARN extraído. La segunda PCR tenía un volumen final de 25 μL y contenía los siguientes
reactivos: 2,5 μL de Buffer 10x PCR (Invitrogen); 0,5 μL de dNTPs 10 mM (Invitrogen); 1
Materiales y métodos
29
U de Platinum Taq polymerase (Invitrogen); 1 μL de cada primer interno 10 μM; 0,75 μL
de MgCl2 50 mM (Invitrogen) y 2 μL del producto de la primera amplificación.
Las condiciones para la primera PCR fueron las siguientes: un ciclo de transcripción
reversa a 50 °C por 30 min seguido por un paso de inactivación/activación a 95 °C por 15
min; 35 ciclos de desnaturalización (94 °C por 30 s), anillamiento (50 °C por 30 s),
extensión (72 °C por 30 s) y una extensión final a 72 °C por 6 min. La segunda PCR tuvo
las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 94 °C por 2 min, 35 ciclos de
desnaturalización (94 °C por 30 s), anillamiento (50 °C por 30 s), extensión (72 °C por 30
s) y una extensión final a 72 °C por 6 min.
Para detectar los productos de la nRT-PCR, 8 μL del amplificado se adicionaron a 1 μL
de buffer de carga BlueJuiceTM (Invitrogen) y se separaron por electroforesis en gel de
agarosa UltraPureTM (Invitrogen) al 2% teñido con SYBR® Safe (Invitrogen). El corrido
electroforético se realizó a 100 V durante 60 min. Se utilizó como marcador de peso
molecular escaleras de ADN de 100 pb y 123 pb (Invitrogen) y las bandas se visualizaron
en un fotodocumentador (Bio-Rad, Gel DocTM XR+ System) mediante el programa
Quantity One® 4.6.7 (Bio-Rad).
3.4.3 RT-PCR en tiempo real
Esta técnica se estandarizo siguiendo el protocolo desarrollado por Jothikumar y
colaboradores (93), con algunas modificaciones adaptadas a las condiciones del
laboratorio. Se utilizó el kit SuperScipt® III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR
System (Invitrogen) para realizar las mezclas de reacción (25 µL): 0,5 µL de SuperScipt®
III RT/Platinum® Taq Mix, 12,5 µL de mix de reacción 2X, y primers y la sonda a una
concentración de 250 y 100 nM respectivamente. El primer delantero (JVHEVF; 5’GGTGGTTTCTGGGGTGAC-3’)
y
el
primer
reverso
(JVHEVR;
5’-
AGGGGTTGGTTGGATGAA-3’) amplifican la región correspondiente a la posición 52615330 del genoma de la cepa Burma, detectada por la sonda TaqMan® JVHEVP: 5’ FAMTGATTCTCAGCCCTTCGC-BHQ1 3’, todos sintetizados por BioSearch Technologies.
El perfil térmico de la RT-PCR consistió en un ciclo de transcripción reversa y
desnaturalización a 50 °C por 30 min y 95 °C por 15 min, respectivamente; seguido por la
30
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
amplificación con 40 ciclos a 95 °C por 10 s, 55 °C por 20 s y 72 °C por 15 s, en un
termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems).
3.4.4 Secuenciación y análisis filogenético
Los productos de la RT-PCR positivos para ARN-VHE fueron purificados mediante
QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN, Brazil) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante: se añadió 85 µL de buffer PB a 17 μL de amplificado, la mezcla se colocó en
la columna QIAquick y se centrifugo a 13000 rpm por 60 s. Para lavar el ADN unido a la
columna, se agregó 750 μL de Buffer PE y se centrifugo a la misma velocidad y tiempo
que el paso anterior. El ADN se eluyó adicionando 30 μL de buffer EB (10 mMTris·Cl, pH
8.5) a la columna, incubando durante 1 min y centrifugando con las mismas condiciones
anteriores. El ADN purificado se cuantifico utilizando el espectrofotómetro NanoDrop®
(Thermo Scientific) y fue almacenado a -25 °C hasta su secuenciación.
Los productos purificados se secuenciaron usando BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. Se preparó la mezcla de reacción adicionando 2 µL de Ready Reaction
Premix 2,5X, 1 µL de buffer BigDye Sequencing 5X, 3,2 pmol de primer específico (Tabla
3-1), 1-3 ng de producto purificado y agua hasta un volumen final de 10 µL. Las
condiciones de la reacción de secuenciación fueron: 96 °C por 1 min; 25 ciclos de 96 °C
por 10 s, 50 °C por 5 s y 60 °C por 4 min. La reacción se purifico mediante el kit BigDye®
XTerminator (Applied Biosystems, CA, USA) y la secuenciación se llevó a cabo en un
secuenciador ABI 3130 (Applied Biosystem).
Cada electroferograma fue analizado y editado usando el programa BioEdit (v. 7.2.5)
para obtener la secuencia consenso a partir de las secuencias delantera y reversa. De la
base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se seleccionaron 63
secuencias de 141 pb correspondientes a la región ORF2 del VHE de distintos genotipos
y diferentes partes del mundo (Tabla 3-2) y se alinearon junto con las secuencias
obtenidas utilizando el programa Clustal Omega disponible en la página web del EMBLEBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). No se encontraron secuencias de VHE-3
Materiales y métodos
31
de la región ORF2 amplificada con los primers utilizados en este estudio de ninguno de
los países de Suramérica.
El análisis filogenético fue realizado mediante el método estadístico Neighbor-joining en
el programa MEGA6 (v. 6.06) utilizando un modelo de distancias-p con un bootstrap de
1000. Un análisis filogenético Bayesiano adicional fue llevado a cabo, usando el
programa MrBayes (v. 3.2.5) muestreando a lo largo de todo el espacio GTR (General
Time Reversible) en un total de diez millones de generaciones.
Tabla 3-2: Secuencias de la región ORF2 del VHE utilizadas para la construcción de los
arboles filogenéticos.
Número de
Acceso
AB073912
AB074915
AB074917
AB074918
AB074920
AB080575
AB089824
AB091394
AB091395
AB097811
AB097812
AB099347
AB108537
AB161717
AB189070
AB189071
AB189072
AB193176
AB193178
AB197673
AB197674
AB220971
AB220972
AB220974
AB220976
AB222182
AB222183
AB222184
AB236320
AB246676
AB248520
País
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
China
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
China
China
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Japón
Fecha de
Presentación
2001
2001
2001
2001
2001
2002
2002
2002
2002
2002
2002
2003
2003
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2005
2005
2005
2005
2005
2005
2005
2005
2006
2006
Número de
Acceso
AB248521
AB248522
AB253420
AF051830
AF060668
AF060669
AF076239
AF082843
AF185822
AF444003
AF455784
AF459438
AJ272108
AP003430
AY115488
AY204877
AY230202
AY575857
AY594199
AY723745
D10330
D11092
D11093
DQ279091
DQ450072
L08816
L25547
M73218
M74506
M80581
X98292
X99441
País
Japón
Japón
Japón
Nepal
EE.UU
EE.UU
India
EE.UU
Paquistán
EE.UU
Kirguistán
India
China
Japón
Canadá
Chad
Marruecos
EE.UU
China
India
Japón
Japón
Japón
China
China
China
China
EE.UU
México
Paquistán
India
India
Fecha de
Presentación
2006
2006
2006
1998
1998
1998
2001
1998
1999
2001
2004
2001
2000
2001
2002
2003
2003
2004
2004
2004
1992
1992
1992
2007
2006
1993
2005
1991
1992
1992
1996
1996
32
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
4. Resultados
4.1 Coinfección y seroprevalencia del VHE en pacientes
con diagnóstico de hepatitis viral
El total de sueros procesados mediante ELISA para la búsqueda de anticuerpos IgG e
IgM anti-VHE se muestra en la Tabla 4-1.
Tabla 4-1: Muestras procesadas según el departamento de procedencia y el diagnóstico
de hepatitis viral.
Departamento
VHA
VHB
VHC
Amazonas
Antioquia
Arauca
Atlántico
Bogotá
Bolívar
Boyacá
Caldas
Caquetá
Casanare
Cauca
Cesar
Choco
Córdoba
Cundinamarca
Guainía
Guajira
Guaviare
Huila
Magdalena
5
15
1
18
4
0
32
3
13
10
43
52
0
15
41
0
13
7
60
9
14
1
1
2
1
3
16
35
27
2
13
1
1
25
1
4
8
75
1
5
0
12
0
14
50
5
8
0
8
6
21
5
0
8
25
0
3
0
4
8
Muestras
Totales
19
28
2
34
55
8
56
38
48
18
77
58
1
48
67
4
24
82
65
22
34
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Tabla 4-1: (Continuación)
Departamento
VHA
VHB
VHC
Meta
Nariño
Norte de
Santander
Putumayo
Quindío
Risaralda
San Andrés
Santander
Sucre
Tolima
Valle del Cauca
Vaupés
Vichada
Muestras
totales
0
3
6
0
23
6
Muestras
Totales
29
9
9
8
7
24
68
5
7
2
16
53
0
11
5
13
8
0
10
0
8
17
8
0
1
5
1
3
4
11
12
7
6
0
0
77
8
21
2
35
82
15
17
6
18
533
307
257
1097
0
Se determinó que 278 sueros fueron positivos para IgG anti-VHE, 62 para IgM anti-VHE y
64 para ambos marcadores. El análisis de resultados serológicos mostró que el marcador
IgM anti-VHE se encontró en mayor frecuencia en el grupo de sueros con diagnóstico de
VHA (8,2%) mientras que el más bajo se presentó en grupo de sueros con diagnóstico de
VHC (1,2%). Los anticuerpos tipo IgG anti-VHE se encontraron en mayor frecuencia en el
grupo de sueros con diagnóstico de VHC (30,7%) y el de menor frecuencia en el grupo
de sueros con diagnóstico de VHB (20,2%). La presencia simultánea de anticuerpos IgG
e IgM anti-VHE se demostró en todos los grupos de sueros con diagnóstico de hepatitis
viral. En la Tabla 4-2 se muestran los resultados serológicos discriminados según el
grupo de sueros estudiados.
Considerando que 342 sueros fueron positivos para IgG anti-VHE y 126 para IgM antiVHE, la seropositividad general para IgG anti-VHE fue 31,2% y 11,5% para los
anticuerpos IgM anti-VHE. La infección dual VHE + VHA determinada por IgG anti-VHE
fue 33,6% (179/533) y 16,1% (86/533) por IgM anti-VHE; para VHB fue 23,4% (72/307) y
8,1% (25/307) y para VHC de 35,4% (91/257) y 5,8% (15/257) respectivamente (Tabla 42).
Discusión
35
Tabla 4-2: Resultados de las pruebas ELISA para la determinación de anticuerpos IgG e
IgM anti-VHE en sueros positivos para la presencia de marcadores serológicos para
VHA, VHB y VHC.
Marcador serológico
otras hepatitis virales
Total anticuerpos
Marcador serológico VHE positivo
anti-VHE
IgG anti-VHE
IgM anti-VHE
IgG+IgM anti-VHE
IgG
IgM
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
VHA (n=533)
137 (25,7)
44 (8,2)
42 (7,9)
179 (33,6)
86 (16,1)
VHB (n=307)
62 (20,2)
15 (4,9)
10 (3,2)
72 (23,4)
25 (8,1)
VHC (n=257)
79 (30,7)
3 (1,2)
12 (4,7)
91 (35,4)
15 (5,8)
Total (n=1097)
278 (25,3)
62 (5,6)
64 (5,8)
342 (31,2)
126 (11,5)
El análisis de la variable edad, mostró que 48,8% de la coinfección VHA + VHE,
determinada por la presencia de IgM anti-VHA e IgM anti-VHE se produjo antes de 16
años de edad, 9,3% entre 16 a 30 años de edad y 41,9% de casos no registró
información de edad. La coinfección VHB + VHE, determinado por la presencia del
HBsAg e IgM anti-VHE, mostró que 28% de los casos se produjo en el grupo de 2-15
años de edad, 32% de 16-30 años, 8% de 46 a 70 años y 32% de los casos no tenía
información con respecto a la edad (Tabla 4-3).
Tabla 4-3: Resultados serológicos positivos para anticuerpos anti-VHE según el grupo de
edad.
IgG anti-VHE positivo
Grupos
Total
IgM anti-VHE positivo
Total
VHA
VHB
VHC
Positivo
VHA
VHB
VHC
Positivo
n (%)
n (%)
n (%)
IgG n (%)
n (%)
n (%)
n (%)
IgM n (%)
2 – 15
81 (45,2)
2 (2,8)
1 (1,1)
84 (24,6)
42 (48,8)
0 (0,0)
0 (0,0)
42 (33,3)
16 – 30
15 (8,4)
21 (29,2)
6 (6,6)
42 (12,3)
8 (9,3)
8 (32,0)
4 (2,7)
20 (15,9)
31 – 45
1 (0,6)
19 (26,4)
5 (5,5)
25 (7,3)
0 (0,0)
7 (28,0)
1 (6,7)
8 (6,3)
46 – 70
0 (0,0)
13 (18,0)
4 (4,4)
17 (5,0)
0 (0,0)
2 (8,0)
2 (13,3)
4 (3,2)
Sin Dato
82 (45,8)
17 (23,6)
75 (82,4)
174 (50,9)
36 (41,9)
8 (32,0)
8 (53,3)
52 (41,3)
179
72
91
342
86
25
15
126
de Edad
(años)
Total
general
La coinfección con el VHA solo se presentó en el grupo de edad de 2-15 años y hasta los
30 años, en edades mayores no se presenta la coinfección VHE+VHA. En el grupo de
edad de 16-45 la principal coinfección se da con el VHB, mientras que la coinfección con
36
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
el VHC solo llega a ser importante en adultos mayores. Una dinámica diferente se
observa con las muestras de pacientes que han presentado una doble infección
(presencia de IgG anti-VHE), aunque la infección VHA+VHE sigue un comportamiento
similar, en el grupo de 2-15 años también se presentan infecciones duales con los otros
dos virus, aunque en una pequeña proporción.
La población con mayor frecuencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE corresponde a
pacientes provenientes de los departamentos de Putumayo, Guaviare, Boyacá y
Cundinamarca, aunque corresponde a los departamentos que más muestras de suero
aportaron al estudio. En general el porcentaje de positividad es similar para los dos
marcadores, pero puede estar asociado al número de muestras procesadas por
departamento. En las Figuras 4-1 y 4-2 se muestra el porcentaje de positividad según el
marcador serológico discriminado por departamento.
Figura 4-1: Porcentaje de seroprevalencia a IgM anti-VHE por departamento, según el
número de muestras procesadas por ELISA.
Discusión
37
Figura 4-2: Porcentaje de seroprevalencia a IgG anti-VHE por departamento, según el
número de muestras procesadas por ELISA.
4.2 Detección del genoma del VHE mediante nRT-PCR
Siguiendo el protocolo de la nRT-PCR descrito en la sección de materiales y métodos, se
logró estandarizar esta prueba para la detección del ARN del VHE, utilizando como
control positivo una muestra de materia fecal de cerdo genotipo 3, donada al grupo de
virología del INS por el Dr. Robert H. Purcell del NHI (National Institutes of Health),
Estados Unidos. Los resultados de la amplificación de estas extracciones para las
regiones MeT y ORF2 se muestran en el gel de electroforesis de la Figura 4-3, donde se
observa la amplificación de la región MeT en los carriles 1 y 3 correspondiente a un
tamaño de 287 pb y de la región ORF2 en los carriles 6-9 con un tamaño de 145 pb.
De igual manera se estandarizo la nRT-PCR para amplificar la región RdRp (ORF1) del
genoma del VHE de un tamaño de 307 pb. En la Figura 4-4 se observa el gel de
electroforesis con la amplificación de esta región a partir del control positivo de materia
fecal (carriles 2-4), con el control negativo en el carril 1.
38
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Figura 4-3: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del
ARN del VHE: En los carriles 1-3 (amplificación de la región MeT) y 6-8 (amplificación de
la región ORF2) se colocaron los productos de la amplificación del ARN extraído del
control positivo, carriles 4 y 9 controles de reacción, y en los carriles 5 y 10 controles
negativos.
Figura 4-4: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del
ARN del VHE: Visualización de la amplificación de la región RdRp (307 pb) en la
extracción de ARN del control positivo (carriles 2-4), en el carril 1 control negativo.
Discusión
39
Para la detección del ARN del VHE se procesaron todos los sueros positivos para IgM
anti-VHE (62 IgM anti-VHE y 64 IgG + IgM anti-VHE) y 129 sueros positivos para IgG
anti-VHE, para un total de 255 sueros procesados mediante nRT-PCR. En total se logró
la amplificación en 94 (37%) de estos sueros de las regiones MeT, RdRp y ORF2: 51
muestras la región MeT, en 49 muestras la región ORF2 y en 25 muestras la región
RdRp. Solo en 12 sueros se logró la detección de las tres regiones del genoma del VHE,
y en ninguna muestra en la que se haya amplificado la región RdRp se logró amplificar
alguna de las otras dos regiones. El genoma viral se detectó en el 33,3% (42/126) de
muestras positivas para el anticuerpo IgM anti-VHE y en el 40% (77/193) de sueros
positivos para IgG anti-VHE (Tabla 4-4).
Tabla 4-4: Amplificación de las regiones ORF1 y ORF2 del VHE mediante nRT-PCR en
sueros positivos para anticuerpos anti-VHE.
Región
Amplificada
IgM anti-VHE (+)
IgM+IgG
anti-VHE (+)
IgG anti-VHE (+)
Total
General
MeT
9
7
16
32
MeT/ORF2
1
3
3
7
MeT/ORF2/RdRp
2
6
4
12
ORF2
4
4
22
30
RdRp
1
5
7
13
Total general
17
25
52
94
La positividad de la amplificación para MeT fue del 22,2% (28/126) para los sueros
positivos IgM anti-VHE y del 20,2% (39/193) para los IgG anti-VHE positivos; para ORF2
del 15,9% (20/126) para IgM anti-VHE positivos y del 21,8% (42/193) para los IgG antiVHE positivos; y para RdRp del 7,2% (14/193) para las muestras IgM anti-VHE positivas
y del 11,4% (22/193) en las positivas IgG anti-VHE (Tabla 4-5).
Tabla 4-5: Amplificación del ARN del VHE en sueros positivos para anticuerpos anti-VHE.
Región amplificada IgM anti-VHE (+) (n=126) IgG anti-VHE (+) (n=193) Total
MeT
28
39
67
RdRp
14
22
36
ORF2
20
42
62
40
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
En la Figura 4-5 se muestra la aplicación de la técnica nRT-PCR estandarizada, a las
extracciones de ARN de los sueros seleccionados, para las regiones MeT y ORF2. Se
muestra este gel en específico, ya que el producto de amplificación de la región ORF2 de
la muestra 67284 (Vichada 2007) fue el primero en ser secuenciado.
145 pb
Figura 4-5: Amplificación por nRT-PCR de algunas muestras de suero para las regiones
MeT (izquierda) y ORF2 (derecha): Electroforesis de los productos amplificados en las
extracciones de ARN de sueros IgM anti-VHE (+) (identificados en cada carril mediante el
código interno del INS), para las regiones MeT y ORF2. Muestra 67284 positiva para
ORF2 (145 pb).
4.3 Detección cualitativa del ARN del VHE mediante RTPCR en tiempo real
En la estandarización se utilizó el Primer Estándar Internacional de la Organización
Mundial de la Salud (OMS) para el VHE: “1st World Health Organization International
Standard for Hepatitis E Virus RNA Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT)-Based
Assays”. Este estándar fue desarrollado específicamente para ser usado en la
Discusión
41
estandarización de la técnica de amplificación de ácidos nucleicos del VHE, y fue
adquirido para este estudio a través del Paul-Ehrlich-Institut bajo el código PEI 6329/10.
La efectividad del protocolo en la detección del ARN viral se evaluó mediante la
comparación de la amplificación del estándar por triplicado. La detección de la sonda
TaqMan® en las tres replicas fue reproducible, como se observa en la Figura 4-6, donde
las tres amplificaciones presentan el mismo valor de CT y se logra una amplificación
eficiente de las tres muestras, en este caso el CT para las tres replicas fue de 27.
Negativo
Figura 4-6: Amplificación por triplicado del estándar del VHE: Detección cualitativa del
genoma del VHE por RT-PCR en tiempo real. Amplificación del estándar de la OMS por
triplicado, detectándose el ARN del VHE en el ciclo 27 en todas las réplicas.
Teniendo en cuenta que el estándar de la OMS presenta una concentración de 125.000
UI/mL, se determinó que el límite de detección del genoma del VHE mediante la RT-PCR
en tiempo real estandarizada es de 1.250 UI/mL (1,25 UI/µL) (Figura 4-7). Ya que el
objetivo de la estandarización era la detección cualitativa del genoma, no se realizaron
las diluciones seriadas suficientes para establecer la eficiencia del protocolo, teniendo
solo tres puntos para la elaboración de la curva estándar.
42
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Figura 4-7: Sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real para la detección del ARN del VHE:
Amplificación de diluciones seriadas del estándar del VHE para estimar la sensibilidad del
método. El estándar sin diluir (1) se detecta a partir del ciclo 27, mientras que la dilución
1:1000 no presenta amplificación.
4.4 Caracterización genotípica del VHE
De las 129 muestras positivas para IgG anti-VHE, 62 para IgM anti-VHE y 64 con ambos
marcadores, analizadas por nRT-PCR para la detección del ARN viral, 94 mostraron
resultados positivos, de los cuales nueve fueron secuenciados y se encontró que
correspondían al genotipo VHE-3 subgenotipo 3a agrupados con cepas norteamericanas
de origen porcino (Figuras 4-8 y 4-9). Estos nueve virus caracterizados fueron detectados
en sueros de pacientes procedentes de los departamentos de Boyacá, Cauca,
Cundinamarca, Putumayo y Vichada recolectados en los años 2006, 2007 y 2009.
Discusión
43
Figura 4-8: Análisis filogenético de las secuencias del VHE obtenidas en este estudio:
Relación filogenética de las secuencias de la región ORF2 obtenidas en este estudio,
deducida usando el método Neighbor-Joining. Se muestran los porcentajes mayores al
60% mediante la prueba bootstrap (1000 réplicas). Las longitudes de las ramas están en
las mismas unidades que las de las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol
filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de distancias-p
expresadas como el número de diferencias de bases por sitio. El análisis incluyó 71
secuencias de nucleótidos, de un total de 141 posiciones en el alineamiento final.
44
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
El árbol filogenético de la Figura 4-8 ilustra como las nueve secuencias correspondientes
a la región ORF2 (Figura 4-9) identificadas en este estudio pertenecen al VHE-3 y están
más relacionados filogenéticamente con la cepa Meng (AF082843), el primer aislado del
VHE porcino. Los triángulos representan cepas de origen porcino y los cuadrados cepas
de origen humano, mientras que no se especifican en los genotipos 1 y 2 ya que estos
virus solo infectan humanos. También es de notar que existe variabilidad en las
secuencias entre departamentos e incluso entre años dentro del mismo departamento,
para los aislados de Colombia.
El análisis bayesiano (Figura 4-10) de las mismas secuencias confirma que el VHE
circulante en Colombia pertenece al VHE-3, estrechamente relacionado con cepas de
origen porcino subgenotipo 3a, pero no es tan clara la relación del subgenotipo como en
el análisis por neighbor-joining (Figura 4-8).
Figura 4-9: Región del genoma del VHE utilizada para la genotipificación del virus: Mapeo
de las secuencias de la región ORF2 del VHE utilizadas para los análisis filogenéticos.
Se encuentran entre las posiciones 6347-6490 del genoma del VHE.
Discusión
45
Figura 4-10: Árbol filogenético construido mediante inferencia bayesiana basado en la
región ORF2 del VHE: Árbol filogenético consenso para el análisis por inferencia
bayesiana. Los valores en los nodos representan la probabilidad posterior de cada clado.
Las secuencias de la región ORF2 del VHE de Colombia están identificadas mediante el
código interno del INS, el departamento de procedencia de los sueros y el año de
recolección. Las demás secuencias están identificadas por el código de acceso al
GenBank (Tabla 3.2).
5. Discusión
En estudios previos ya se había detectado la circulación del VHE en el departamento de
Antioquia (94) y en otros departamentos de Colombia (26), sin embargo no existían
estudios sobre la coinfección del VHE con otros virus hepatotropos en el país. En nuestro
estudio se logró detectar la coinfección del VHE con los virus hepatotropos VHA, VHB y
VHC mediante detección de IgM anti-VHE, así como una infección dual con dichos virus
determinada por la presencia de IgG anti-VHE.
Ya que la IgM es un marcador serológico que indica una infección aguda, y generalmente
su periodo de detección coincide con el periodo de detección del genoma viral, se puede
hablar de una coinfección cuando se detecta este anticuerpo. Por otro lado la presencia
de anticuerpos IgG es un marcador de infección pasada y su detección nos muestra una
infección dual o co-circulación de los dos virus.
Los resultados muestran que uno de los mayores porcentajes de coinfección (16,1%) y
de infección dual (33,6%) se da entre el VHE y el VHA, explicado por las características
epidemiológicas similares de ambos virus y que comparten la misma vía de transmisión,
de tal manera los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de un posible origen común
de transmisión a través de aguas o alimentos contaminados (95). Esta tasa de
coinfección resulta un poco más alta que la detectada en un estudio en India, donde se
analizaron 958 sueros y obtuvieron un porcentaje de coinfección del 11,5% (96), algo
para tener en cuenta ya que India está catalogado como un país hiperendémico para el
VHE. A pesar de que en Latinoamérica los estudios sobre coinfección también son
escasos, en Cuba investigaron sueros de brotes de hepatitis viral y encontraron un
porcentaje
de
coinfección
VHA+VHE
del
13%
(33/258)
comportamientos similares a los obtenidos en este estudio.
(95),
evidenciando
48
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
En países en vía de desarrollo endémicos para VHA y VHE, muchas complicaciones
asociadas con la coinfección pueden contribuir a tasas de mortalidad asociadas con
estos virus (97). También se ha demostrado que en población pediátrica la mezcla de
infecciones VHA+VHE está asociada con FHF (98); así al establecer que en Colombia se
presenta la coinfección entre el VHE y el VHA se hace necesario investigar las
implicaciones clínicas que podrían tener en nuestro medio este tipo de coinfecciones.
Resulta sorpresivo el alto porcentaje de infección dual entre el VHE y los virus VHB
(23,5%) y VHC (35,4%) (Tabla 4-1), teniendo en cuenta que las principales vías de
transmisión de estos virus son diferentes: entérica para el VHE, contacto con sangre o
fluidos corporales para el VHB y parenteral para el VHC. Sin embargo algunos estudios
en India han reportado que la coinfección con múltiples virus hepatotropos ocurre en
varias combinaciones, entre 7 – 24%, de todos los pacientes con una hepatitis viral
aguda (99), en Egipto del 52% (30), y en Italia del 27% (22). A partir de estos resultados
pueden plantearse varias hipótesis: la infección por el VHE puede ocurrir en un paciente
en recuperación de una infección previa por el VHB; una infección por el VHE puede
activar una infección por el VHB; una infección previa con el VHE, puede favorecer una
nueva infección con el VHC; o una transmisión simultánea de ambos virus por transfusión
sanguínea. La transmisión del VHE a través de transfusiones sanguíneas ha sido
documentada en varios continentes (85, 100-104), por lo que es posible una transmisión
parenteral simultanea VHB+VHE y VHC+VHE, apuntando a rutas similares o
coincidentes de transmisión de estos virus.
El porcentaje de coinfección VHB+VHE (8,1%) determinado en el estudio se debe
analizar con precaución, teniendo en cuenta la características epidemiológicas y
moleculares tan distintas de los dos virus. Considerando que la infección aguda
simultánea con dos virus con vías de transmisión diferentes es muy rara, no existe un
consenso en los diferentes estudios sobre cómo explicar los resultados de esta
coinfección. La detección simultanea de los virus VHB y VHE en pacientes con
diagnóstico de hepatitis aguda en el Reino Unido lleva a plantear a los autores que puede
ocurrir una superinfección con el VHE en pacientes con una infección crónica previa con
el VHB (105). En un estudio que se llevó a cabo en India donde se encontró un
Discusión
49
porcentaje de coinfección VHB+VHE del 2,8% (26/927) (106), también plantean la
anterior hipótesis. Por otra parte, existe bastante evidencia sobre la infección del VHE a
través de transfusiones sanguíneas (84-86, 98-102), haciendo posible que la coinfección
VHB+VHE se presente simultáneamente de forma parenteral. A pesar de haberse
detectado la coinfección VHB+VHE en Colombia, los resultados obtenidos no llegan a ser
concluyentes acerca del modo en que se llegó a dar la coinfección, haciendo
indispensable una investigación más profunda para llegar a establecer la verdadera
dinámica de la coinfección.
Hasta el momento los datos de seroprevalencia del VHE en la población general en
Colombia son inexistentes, y solo se ha determinado en algunas poblaciones con
factores de riesgo, de tal manera que se cuenta con una serie de reportes con datos de
seropositividad variando desde el 7,5 – 11,25% para IgG anti-VHE y el 1,74 – 46% para
IgM anti-VHE entre los diferentes estudios (23, 26, 94). Los resultados de este estudio
muestran una seropositividad del 31,2% para IgG anti-VHE y 11,5% para IgM anti-VHE,
indicando que la exposición al VHE es alta en la población de estudio y que la infección
subclínica por el VHE en Colombia puede llegar a ser común. Con el porcentaje de
hepatitis E aguda detectada se puede afirmar que esta enfermedad no es reconocida en
nuestro país, probablemente porque la infección del VHE no es considerada una
posibilidad de diagnóstico en pacientes con hepatitis no-A, no-B, no-C.
Según el rango de edad, 48% de la coinfección VHA + VHE se produjo antes de 16 años
de edad y 9% entre 16 a 30 años de edad; la gran mayoría de estas infecciones fueron
detectadas en regiones con mala calidad del agua y pobres prácticas de higiene,
convirtiéndose en un riesgo potencial de infección a una edad temprana. En varias partes
del mundo se ha documentado la exposición temprana al VHE (30, 95, 99), esto sumado
a que en zonas de saneamiento y prácticas de higiene deficientes la mayoría de los niños
(90%) han sufrido la infección por el VHA antes de los 10 años (107), dan validez a que
se haya encontrado la mayor parte de coinfección VHA+VHE en el rango de edad de 215 años.
La coinfección VHB + VHE mostró que 60% de los casos se produjo en el grupo de 16-45
y el 8% de 46 a 70 años. La hepatitis B afecta a la población general, sin embargo es
más frecuente en los jóvenes, adultos y grupos poblacionales con factores de riesgo para
50
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
la enfermedad y según los estudios más recientes, en Colombia se han encontrado
prevalencias de HBsAg de 5,66% (108), lo que concuerda con los grupos de edades que
presentan mayor porcentaje de coinfección VHB + VHE en este estudio, y mostrando que
debido a esta endemicidad del VHB de moderada a alta es muy probable que una
persona que presente el VHB se pueda infectar también con el VHE (30, 105).
La estandarización de la nRT-PCR tenía como fin dos objetivos, la detección del ARN del
VHE y lograr la genotipificación del virus. Los sets de primers utilizados para la
estandarización fueron diseñados en estudios previos (90, 91), con base en
alineamientos de regiones conservadas identificadas en varias secuencias del genoma
completo del VHE, permitiendo la amplificación de estas regiones en todos los genotipos.
Debido a que los niveles de ARN del VHE pueden a llegar a ser bajos en algunos casos y
su ventana de detección es muy corta, la no detección de ácidos nucleicos en las
muestras no descarta una infección reciente por el VHE (18). La detección del ARN del
VHE en el 37% de los sueros positivos para anticuerpos anti-VHE muestra que la sola
detección del genoma no asegura la positividad o negatividad de una infección por el
VHE, sin embargo se debe tener en cuenta que en este caso las muestras remitidas al
INS no venían para diagnóstico de hepatitis E, por lo que la toma oportuna de la muestra
no estaba asegurada.
En el caso de la infección aguda por el VHE, encontrar que el 33,3% de todas las
muestras positivas para IgM anti-VHE fueron positivas por nRT-PCR indica que el
protocolo estandarizado presenta una efectividad aceptable si se compara con otros
resultados; en Venezuela detectaron el ARN del virus en el 14% de los pacientes
positivos para IgM anti-VHE (109), y en India se detectó en el 9,4% de los positivos por
serología (110). En Latinoamérica otros estudios muestran la detección del ARN en
pacientes con resultados IgM positivos: 1/1 en Brasil, 3/3 y 9/6 en Argentina, y 9/9 en
Uruguay (7); pero la cantidad de muestras IgM positivas no es significativa para
establecer una comparación con el presente estudio. De los tres protocolos
estandarizados y aplicados a las muestras, el que mostro mayor porcentaje de
positividad fue el que amplifica la región MeT (22,2%) y el de menor la amplificación de la
región RdRd (7,2%). Si bien la detección del ARN viral en muestras biológicas es el “gold
standar" para la confirmación de una hepatitis E aguda (2), factores como los ya
Discusión
51
mencionados de carga viral baja y una ventana de detección corta, sumados a los
problemas inherentes del manejo, recolección y almacenamiento de muestras, afectan la
sensibilidad de las pruebas de detección de ácidos nucleicos. Aunque se trató de
conservar de la mejor manera los sueros estudiados, se debe tener en cuenta que para
el procesamiento serológico y molecular fue necesario someterlos a procesos de
congelación-descongelación, además de tener algunos ya un tiempo considerable de
recolección (sueros desde 2004), el ARN del VHE presente pudo haber sufrido alguna
degradación, lo que no permitió una mayor detección del genoma viral de la obtenida en
el trabajo, especialmente con la región RdRp.
Con respecto a la amplificación del ARN del VHE en las muestras positivas para IgG antiVHE, llama la atención que se haya podido detectar. El ARN del VHE puede llegar a
detectarse en suero en los comienzos de la respuesta inmune con IgG anti-VHE, pero los
niveles pueden a llegar a ser muy bajos para su detección (67). Sin embargo en heces la
excreción del virus y su detección es más prolongada, llegando hasta el pico de IgG antiVHE (Figura 2-6). La positividad general (40%) de amplificación del ARN viral en estos
sueros podría ser un indicador de que la sensibilidad de la nRT-PCR es buena, ya que es
capaz de detectar el ARN del virus incluso en las etapas finales de la viremia. No
obstante, evaluando la efectividad de los protocolos individualmente, la positividad es
similar a la obtenida para las muestras positivas para IgM anti-VHE, solo que en este
caso el mayor porcentaje de positividad se da para la amplificación de la región ORF2
(21,8%).
La caracterización genotípica del VHE es de gran importancia ya que la severidad de la
hepatitis E está relacionada directamente con el genotipo del VHE (15): la falla hepática
aguda en mujeres embarazadas y las manifestaciones extra-hepáticas de la enfermedad
como la pancreatitis, están asociadas con el genotipo 1; la hepatitis crónica en pacientes
inmunodeficientes se ha observado principalmente en infecciones con el VHE genotipo 3
(18). Además, todos los casos de transfusión relacionados con la hepatitis E han sido
causados por cepas del VHE de los genotipos 3 y 4, sugiriendo un potencial de
transmisión parenteral de estos genotipos (111). Por otra parte, estudios en Colombia
han demostrado la presencia del VHE genotipo 3 en agua para consumo humano (112),
lo que restaría argumentos para pensar en una posible coinfección por vía parenteral del
VHE con los virus VHB y VHC. Sin embargo, es necesaria una mayor investigación en
52
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
nuestro país enfocada hacia otras rutas de transmisión del VHE, además de la entérica,
como lo han reportado estudios previos (86, 87).
En Latinoamérica el genotipo predominante es el VHE-3: Venezuela, Bolivia, y Uruguay;
además algunos reportes han llegado hasta caracterizar el subgenotipo: 3a en Cuba, 3a
y 3b en Brasil; 3a, 3b y 3i en Argentina (7). Otros genotipos están presentes en la región:
genotipo 2a en México, y VHE-1 en Venezuela y Cuba. Con la caracterización del VHE-3
subgenotipo 3a en Colombia, se va completando el mapa de distribución del VHE en
Latinoamérica, faltando establecer los genotipos en los demás países del área. La
información disponible hasta el momento, deja entrever un patrón sobre la distribución
geográfica del VHE en Sur América, observándose como desde el norte del continente
empieza la aparición del genotipo 3a y a medida que se avanza hacia el sur aparecen los
genotipos 3b y 3i, advirtiendo que aún es escasa la información sobre el VHE en nuestro
continente y donde sería interesante llevar a cabo esta investigación.
El análisis filogenético de la región ORF2 (141 pb) muestra como las secuencias del VHE
obtenidas en Colombia se agrupan dentro del genotipo VHE-3, subgenotipo 3a, junto con
la cepa Meng (código de acceso GenBank AF082843). La cepa Meng fue el primer VHE
porcino caracterizado, identificado en cerdos de granjas de Estados Unidos (34). Esto
indica que el VHE-3 en Colombia puede ser mantenido dentro de la población porcina del
país, y de hecho ya se ha comprobado la circulación del VHE en cerdos en Antioquía
(24).
Por último, los departamentos con mayor presencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE
fueron Putumayo, Guaviare, Boyacá y Cundinamarca (Figuras 4-1 y 4-2). Estas regiones
han tenido históricamente pobre suministro de agua potable (113, 114) lo que explicaría
la alta seroprevalencia no solo para anticuerpos anti-VHE sino también las altas tasas de
infección de hepatitis A (115). Son también departamentos que tradicionalmente
presentan
producción
porcícola
(http://www.dane.gov.co/index.php/agropecuario-
alias/estadisticas-de-sacrificio-de-ganado-esag), lo que estaría favoreciendo el ciclo
zoonótico de la enfermedad.
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Se logró determinar la infección dual y la coinfección del VHE con otros virus
hepatotropos (VHA, VHB y VHC), con porcentajes de infección dual VHB+VHE y
VHC+VHE sorpresivamente altos, si se tiene en cuenta que las principales rutas de
transmisión de estos virus son muy diferentes (entérica para VHE y parenteral para VHB
y VHC).
Los casos de coinfección entre los virus VHA y VHE pueden llegar a ser más comunes
debido a que ambos virus comparten una ruta de transmisión entérica, además del déficit
que existe en el tratamiento del agua para consumo humano en algunos departamentos
del país, donde se ha detectado la presencia de ambos virus en agua para consumo
humano.
El alto porcentaje de seropositividad de IgG anti-VHE hace pensar que el VHE es
endémico en Colombia, además de indicar que la infección subclínica por el VHE puede
ser muy común en Colombia. La hepatitis E aguda generalmente no es reconocida en
nuestro país, probablemente porque la infección por el VHE no es considerada una
posibilidad de diagnóstico en pacientes con hepatitis no-A, no-B, no-C.
Se estandarizó un protocolo para la detección del ARN del VHE mediante RT-PCR en
tiempo real y mediante nRT-PCR, esta última apuntando a la amplificación de tres
regiones del genoma: MeT y RdRp (ORF1) y ORF2. Donde la mayor tasa de positividad
se alcanza con la amplificación de las regiones MeT y ORF2.
54
COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS
VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA
Con la detección del VHE-3 en varios departamentos del país sumado a los hallazgos de
otros estudios realizados en Colombia, se puede confirmar que este es el genotipo que
está circulando, concordante con el genotipo que predomina en Suramérica. La
identificación del subgenotipo 3a por primera vez en Colombia, abre la puerta para
futuras investigaciones sobre las posibles implicaciones epidemiológicas asociadas a
este subgenotipo en nuestro país.
6.2 Recomendaciones
Una vez establecida la circulación del VHE en Colombia, se hace necesario profundizar
el estudio del virus en el país, donde se logre establecer: su incidencia en la población,
las rutas de transmisión y los efectos de la infección dual con otros virus causantes de
hepatitis, con el fin de crear estrategias de control y prevención de la infección.
La hepatitis E debería ser incluida en el diagnóstico diferencial de las hepatitis virales en
Colombia. Este diagnóstico se debe basar tanto en pruebas serológicas como su
confirmación por alguna prueba de detección de ácidos nucleicos.
Anexo 1: Publicaciones y eventos científicos
donde se han expuesto los resultados del
estudio

VI Simposio Colombiano de Virología: Infección concomitante con el virus de la
hepatitis E y otros agentes de hepatitis virales en Colombia. 27 – 29 de Mayo de
2015. Universidad de la Salle. Bogotá.

Memorias VI Simposio Colombiano de Virología: Martínez-Vargas DA, Usme-Ciro
J, Escalante MP, Palacios-Vivero M, Contreras Gómez L, Peláez-Carvajal D.
Infección concomitante con el virus de la hepatitis E y otros agentes de hepatitis
virales en Colombia. Biómedica. 2015;35(Supl.1):41-2.

Peláez-Carvajal D, Martínez-Vargas D, Escalante-Mora M, Palacios-Vivero M,
Contreras-Gómez L. Coinfección del virus de la hepatitis E con otras hepatitis
virales en Colombia y su caracterización genotípica. Biomédica. 2016;36(Supl.1).
Anexo 2: Uso del kit BigDye® XTerminatorTM
Purification dentro del proceso de
secuenciación
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