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1º de Química, gr. D
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Cuestiones de Bioquímica
Tema 4
1) Una reacción enzimática puede escribirse como dos reacciones sucesivas, donde el complejo ES
es el intermediario en la conversión del sustrato en producto. En determinadas condiciones, la
primera de las reacciones anteriores alcanza virtualmente el equilibrio, mientras que la segunda
puede considerarse como el paso limitante de la reacción.
a) Teniendo en cuenta las premisas anteriores, escribe un esquema general para la
conversión de un sustrato S en producto P. Señala sobre ese esquema cuáles son las
constantes de velocidad que habrían de considerarse, e indica cuál es la constante cinética
que define la velocidad global de la reacción.
b) ¿En qué consiste el estado estacionario? ¿Cuáles son las condiciones que deben de
cumplirse para que éste se alcance?
c) Deduce la expresión de V en función de [S] propuesta por MICHAELIS­MENTEN . Escribe cada
paso hasta llegar a la ecuación final. Si necesitas establecer asunciones especiales, indica
claramente cuáles son éstas.
d) ¿A qué tipo de función corresponde la ecuación anterior? Represéntala, indicando sobre la
gráfica los parámetros principales.
2) En una determinada enzima, un residuo de Ala se encuentra localizado en la hendidura dónde se
Figura 1
Figura 2
k cat
KM
k cat
KM
6
7
8
pH
9 10 11
6
7
8
9 10 11
pH
une el sustrato. Una mutación, que consiste en la sustitución de este residuo por uno de Gly, no
afecta a la actividad de la enzima. Sin embargo, el cambio de la Ala por Glu conduce a la pérdida
completa de la actividad. Sugiere una explicación para estas observaciones.
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3) La eficiencia
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catalítica ( k cat / K M ) de muchas enzimas depende del pH. La quimotripsina
muestra un valor máximo de k cat / K M a pH 8,0 (Figura 1).
a) ¿Cuál es el significado de esta observación?
b) Un análisis detallado muestra que k cat aumenta rápidamente entre pH 6 y 7,
permaneciendo constante para valores de pH superiores a éste último. Sin embargo, K M
permanece constante hasta pH 8 y aumenta rápidamente entre pH 8 y 10 (Figura 2).
Explica estas observaciones y extrae conclusiones sobre la naturaleza de los residuos de
aminoácido que son importantes para la actividad de la quimotripsina.
4) La figura siguiente muestra esquemáticamente algunos residuos del centro activo de la papaina.
El sustrato N­etilmaleimida (NEM) reacciona rápidamente con el grupo aniónico tiolato de la Cys
25 del centro activo.
a) ¿En cuál de las siguientes condiciones crees que reaccionará mejor la Cys con el sustrato
NEM: a pH 5,0 o a pH 7,5?
b) ¿Cabría esperar que la Cys 25 de la papaina fuese más reactiva frente al NEM que otras
Cys de la proteína? Razona tu respuesta.
His
Cys25
Asp 
HN
N :
HS
5) ¿De qué manera afecta a una enzima que se comporta según la cinética de MICHAELIS un inhibidor
reversible competitivo y uno irreversible? Utiliza representaciones gráficas para comparar la
actividad de la enzima en ausencia y en presencia de cada tipo de inhibidor ¿Podrías utilizar una
diálisis para distinguir ambos tipos de inhibidores?
6) En las enzimas alostéricas, los inhibidores competitivos, cuando se encuentran a bajas
concentraciones, actúan a menudo como activadores ¿Cómo puede explicarse este hecho?
7) Si el número de recambio de una enzima es 100 s­1 ¿cuánto tiempo necesita esta enzima para
transformar 1 mol de sustrato en producto?
8) Para una enzima que responde al modelo cinético de MICHAELIS­MENTEN a) Deduce el valor de la [S] para la cual se obtiene ½Vmax
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b) ¿Cuál es la proporción entre las concentraciones de sustrato necesarias para conseguir un
80 % y un 10 % de la Vmax, respectivamente?
c) Supón que para la enzima anterior K M = 1 . Si V0 = 0,1 mM/min cuando [S] = 10 mM ¿se
duplicaría V0 si la [S] fuese 20 mM?
9) La hidrólisis de pirofosfato a ortofosfato es importante para impulsar las reacciones
biosintéticas, tales como la síntesis de DNA. Esta reacción hidrolítica es catalizada en E. coli por
una pirofosfatasa que tiene una masa molecular de 120 kDa y está constituida por 6 subunidades
idénticas. La enzima purificada tiene una velocidad máxima de 2800 unidades por mgr de enzima.
Para esta enzima, una unidad viene definida como la cantidad de enzima que hidroliza 10 µmoles
de pirofosfato en 15 minutos a 37 ºC bajo condiciones de ensayo estándar.
a) ¿Cuántas moléculas de sustrato son hidrolidadas por segundo y por mgr de enzima?
b) Suponiendo que en cada subunidad existe un solo centro activo ¿Cuántos moles de centro
activo existen en un mgr de enzima?
c) ¿Cuál es el número de recambio de la enzima?
10) La hexoquinasa del cerebro de rata cataliza la siguiente reacción general:
azucar  ATP  Azucar⋅ fosfato  ADP
Esta enzima puede emplear diversos sustratos, entre ellos glucosa, para la cual K M = 2 mM , y
fructosa, cuya K M = 6 mM . Si el número de recambio es el mismo para ambos sustratos ¿por
cuál de ellos mostrará la enzima más especificidad?
11) En la figura adjunta se representa una cinética
típica de MICHAELIS­MENTEN . Indica cuál es la
región, de las representadas en la figura (A, B o
C) que se aplica mejor a cada uno de los
siguientes casos:
V max
V0
C
a) El centro activo está ocupado por
sustrato la mayor parte del tiempo.
B
b) El centro activo se encuentra libre la
mayor parte del tiempo.
A
c) Es el rango de [S] en el que funcionan la
mayor parte de las enzimas in vivo.
[ S]
d) Incluye el valor de K M .
e) La velocidad está limitada principalmente
por el número de centros catalíticos.
f) La velocidad está limitada principalmente por el número de moléculas de sustrato.
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12) La aspartato transcarbamoilasa (ATCasa) es una enzima formada por seis subunidades catalíticas
y seis reguladoras que cataliza el primer paso de la ruta de la síntesis de pirimidinas, según la
siguiente reacción:
Carbamoilfosfato  Asp  P i  N⋅carbamoilaspartato
a) Se supone que un residuo de His del sitio activo es importante para la estabilidad del
estado de transición de los sustratos unidos. Predecid la dependencia de la velocidad
catalítica con el pH, aceptando que la interacción en la que participa la His es esencial, y
domina el perfil de variación de la actividad enzimática de la ATCasa con el pH.
b) La velocidad de reacción de la ATCasa con respecto a la concentración de Asp , a
concentración saturante de carbamoilfosfato varía con arreglo a una curva sigmoidal, y se ve
V 0 ­ CTP
Figura 2
V0
± CTP
+ CTP
[ Asp]
[ Asp]
Figura 3
% Actividad
Figura 1
1
2
3
4
5
6
[ PALA] / [ ATCasa]
afectada por la presencia de citidintrifosfato (CTP) (Figura 1). Sin embargo, si calentamos
suavemente la ATCasa, (4 min a 60 ºC) la curva se convierte en hiperbólica y la enzima se
muestra insensible a la presencia de CTP (Fugura 2).
– ¿Cómo podemos calificar los efectos del Asp y del CTP sobre la actividad de la
ACTasa?
– ¿Cuál es el significado fisiológico del efecto del CTP?
– ¿Cómo explicarías el efecto del calentamiento suave sobre las propiedades catalíticas
de la ATCasa?
c) La N(fosfonacetil)-L-Asp (PALA) es un potente inhibidor de la ATCasa. Se observa que
concentraciones bajas de PALA aumentan la velocidad de reacción. Por ejemplo, cuando
existe hasta un promedio de 3 moléculas de PALA unidas por cada molécula de ATCasa,
la velocidad de reacción es unas 17 veces mayor que en ausencia de inhibidor. Sin
embargo, al añadir más moléculas de PALA a la enzima, hasta una relación molar de 6, la
velocidad disminuye hasta llegar prácticamente a cero (Figura 3) ¿Porqué PALA actúa
como inhibidor de la ATCasa, y sin embargo a bajas concentraciones es capaz de activar a
la enzima?
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13) En la figura se muestra la variación de la velocidad de
reacción de la enzima piruvato quinasa en función de la
concentración de sustrato y en ausencia (curva A) o presencia
(curva B) de fructusa 1,6-difosfato (F-1,6-P2).
V
a) ¿A qué se puede deber la forma sigmoidal de la curva
B
A
b) ¿Cómo influye la F-1,6-P2 sobre la actividad de la
enzima?
c) ¿Qué mecanismo puede explicar el efecto de la F-1,6P2?
[S]
14) El producto de una reacción (A→ B) tiene color y presenta un máximo de absorbancia a 600 nm.
Como la absorbancia es proporcional a la concentración de producto, las medidas obtenidas con
un colorímetro permiten realizar un estudio de la cinética de la enzima que cataliza esta reacción.
En la tabla se muestran los resultados de un estudio en el que la velocidad inicial de la reacción
(Vo) se expresa como la variación de la absorbancia producida por minuto (∆A/min) para cada una
de las concentraciones de sustrato utilizadas.
a) Determinar los parámetros cinéticos del enzima Vmax y
KM.
b) Sabiendo que en estos experimentos se ha utilizado
1 nmol de enzima ¿Se puede calcular el número de
recambio? En caso de que no sea posible ¿Qué dato
o experimento adicional haría falta?
5
[A] (mM)
Vo (∆A/min)
2.5
5.0
10.0
20.0
40.0
0.13
0.21
0.30
0.37
0.43