Download 2. REPRODUCCION BACTERIANA

POLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
MICROBIOLOGÍA GENERAL (CAG00030)
UNIDAD 2. BACTERIAS
CULTIVO DE LAS BACTERIAS
Necesidades Nutricionales
Desde los hombres hasta los microorganismos, todas las formas de vida, tienen en común
determinadas necesidades nutricionales en términos de necesidades químicas para llevar a
cabo su crecimiento y sus funcionales normales.
1. Todo organismo vivo necesita una fuente de energía. Algunas formas de vida, como plantas
verdes, pueden consumir la energía radiante y se les denomina fototrofas. Las formas de vida
incapaces de asimilar la energía radiante, por ejemplo, la vida animal, se valen de la oxidación
de compuestos químicos para obtener su energía. A éstas se les denomina quimiotrofas. Entre
las bacterias se encuentran los dos tipos de nutrición2. Todo organismo vivo necesita obtener carbono de alguna manera; todos requieren al menos
pequeñas cantidades de Dióxido de Carbono, pero la mayoría de ellos necesitan de algún
compuesto que tenga Carbono orgánico, como azúcar u otros carbohidratos. Mediante la
fotosíntesis, las plantas absorben en Dióxido Carbónico atmosférico y lo transforman en
carbohidratos.
Numerosas bacterias también necesitan el CO2 como su fuente de Carbono; desde el punto de
vista de la nutrición, todos estos organismos son autótrofos. Si obtienen su energía de la luz ,
son fotoautótrofos; pero si la obtienen oxidando compuestos químicos, son quimioautótrofos.
Otras bacterias son muy similares a los animales en cuanto a sus necesidades nutricionales ya
que son incapaces de absorber el CO2 como su única fuente de Carbono y tienen que valerse
de los autotrofos y su producción de carbohidratos y otros compuestos orgánicos para
tomarlos como alimento. Los organismos que necesitan de compuestos orgánicos de carbono
se denominan heterótrofos.
3. Todo organismo vivo necesita obtener Nitrógeno de alguna manera. Las plantas lo asimilan
en forma de sales inorgánicas como el Nitrato de Potasio, KNO3, mientras que los animales
necesitan compuestos de Nitrógeno orgánico, las proteínas y productos de su degradación,
como péptidos y aminoácidos. Las bacterias son muy versátiles a este respecto; algunos tipos
de ellas absorben Nitrógeno atmosférico, otras lo obtienen en compuestos de Nitrógeno
inorgánico, y otras más lo toman de las proteínas o de prácticamente cualquier compuesto
orgánico que lo contenga.
4. Todo organismo vivo necesita de Azufre y Fósforo, las necesidades que los animales tienen
de Azufre se satisfacen mediante los compuestos orgánicos de azufre; las necesidades típicas
de las plantas por el azufre se satisfacen mediante los compuestos orgánicos de azufre.
Algunas bacterias necesitan compuestos orgánicos de azufre, otras son capaces de utilizar
compuestos inorgánicos de azufre, y otras más inclusive, son capaces de asimilar el azufre
elemental. El fósforo lo obtienen generalmente de los fosfatos.
5. Todos los organismos vivos necesitan de varios metales como Sodio, Potasio, Calcio,
Magnesio, Manganeso, Hierro, Zinc, Cobre, Fósforo y Cobalto, para que puedan crecer
normalmente. Las bacterias no son una excepción, las cantidades de metales que requieren en
algunas ocasiones son trazas.
6. Todo organismo vivo requiere de vitaminas y compuestos vitamínicos, en los animales, y
también en el hombre, estos compuestos les deben ser suministrados con la dieta. También,
las bacterias presentan aspectos muy variables en esta parte de la nutrición, aunque todas las
bacterias necesitan de vitaminas en su proceso metabólico normal, algunas son capaces de
sintetizar todas las vitaminas que necesitan a partir de otros compuestos presentes en el
medio. Otras no proliferan salvo que en el medio en que se les cultiva se encuentren ya una o
más vitaminas. En la tabla 6.1 se hace referencia a las vitaminas de uso más común para el
crecimiento o estímulo del crecimiento bacteriano.
Tabla 6.1. Necesidades vitamínicas de algunas bacterias
VITAMINA
CRECIMIENTO DE BACTERIAS
Tiamina B1
Bacillus anthracis
Riboflavina
Clostridium tetani
Niacina
Brucella abortus
Piridoxina B6
Lactobacillus spp.
Biotina
Leuconostoc mesenteroides
Ácido pantoténico
Proteus morganii
Ácido fólico
Leuconostae dextranicum
Cobalamina
Lactobacillus spp.
Vitamina K
Bacteroides melaninogenicus
Tipos de nutrición
De acuerdo con las características generales ya mencionadas, es posible dividir las bacterias en
grupos, tomando como base sus requerimientos nutricionales. Los dos grupos mencionados
previamente y llamados fototrofos y quimiotrofos, son los que tienen una separación mayor.
Cada uno de esos grupos se subdivide a su vez con base a la fuente principal de energía que
consumen para su crecimiento, por ejemplo, la luz o la oxidación de compuestos químicos
(Tabla 6.2).
Tabla 6.2. Principales tipos de nutrición de las bacterias
TIPO
FUENTE DE ENERGÍA
FUENTE DE
CARBONO
Fototróficas
Fotolitotróficas
Luz
CO2
(autotróficas)
Fotoorganotróficas
Compuestos
Luz
(heterotróficas)
orgánicos
Quimiotróficas
Oxidación compuestos
Quimiolitotróficas
CO2
inorgánicos
(Autotróficas)
Quimioorganotróficas Oxidación compuestos
Compuestos
(Heterotróficas)
orgánicos
orgánicos
EJEMPLO DE
GENERO
Chromatium
Rhodopseudomona
s
Thiobacillus
Escherichia
Fototrofos: En relación a las bacterias fototróficas existen especies que consumen CO2 como
fuente principal de carbono. Éstas son denominadas fotolitotróficas. Otras necesitan un
compuesto orgánico, y se denominan por lo tanto fotoorganotróficas, pueden asimilar
alcoholes, ácidos grasos y aminoácidos así como otros compuestos orgánicos, del carbono.
Quimiotrofos: Algunas bacterias son capaces de oxidar nitritos a nitratos y finar CO2 para
satisfacer sus necesidades de carbono y energía. Otras obtienen energía de la oxidación de
azufre elemental y compuestos inorgánicos de azufre, llamadas quimiolitotróficas. Muchos
otros, necesitan compuestos orgánicos de carbono a partir de los cuales obtienen energía
mediante oxidación, a estas especies se les llama quimioorganotróficas. A las bacterias
fotolitotróficas y quimiolitotróficas se les denomina frecuentemente autótrofas.
Autótrofas y heterótrofas: Los autótrofos tienen las necesidades más simples, por ejemplo, el
medio de cultivo que se ilustra en la tabla 6, permite el crecimiento de bacterias autotróficas
que oxidan azufre.
Tabla 6.3. Medio de cultivo de tipo autotrófico
Azufre en polvo
(NH4)2SO4
KH2PO4
CaCl2
MgSO4.7H2O
FeSO4
Agua
CO2
10 g
0.4g
4.0 g
0.25g
0.5g
0.01g
1000 ml
Los medios de cultivo para otras bacterias autotróficas se parecen a la fórmula, pero se
diferencian en que ciertos compuestos químicos específicos deben ser sustituidos o agregados
para reconocer las necesidades específicas de las especies.
Las bacterias heterótrofas están más relacionadas con el hombre, animales y plantas;
constituyen uno de los grupos más importantes, varían considerablemente en cuanto a sus
necesidades de nutrientes específicos para el desarrollo (Tabla 6.4). Todas necesitan de
Carbono orgánico ; sin embargo, hay una gran diversidad manifiesta en lo que respecta a las
necesidades de Nitrógeno, algunas se satisfacen con el Nitrógeno atmosférico, otras lo hacen
con compuestos nitrogenados inorgánicos y otras más necesitan de uno o más compuestos
orgánicos nitrogenados.
Tabla 6.4. Necesidades nutricionales mínimas de algunas bacterias heterotróficas.
BACTERIA
SALES
C ORG.
N2 INORG.
AA
DOS
O UNA
INORG.
MAS AAS VIT.
Escherichia coli
Salmonella
typhi
Proteus
vulgaricus
Staphylococcus
aureus
Lactobacillus
acidophilus
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
DOS O
MÁS
VITA.
X
X
X
MEDIOS BACTERIOLOGICOS
Los medios de cultivo pueden ser de composición química conocida (medios sintéticos o
definidos químicamente), los cuales se han diseñado para el cultivo de tipos específicos de
bacterias conocidas. Se necesita un gran número de sustancias químicamente puras para
cultivar bacterias que tengan necesidades nutricionales como los Lactobacillus. Aunque para el
cultivo de bacterias heterótrofas en laboratorios de rutina, generalmente se basan en medios
de cultivo sintéticos. En lugar de esto, se utilizan ciertos materiales crudos como peptonas,
extracto de carne y extracto de levadura (Tabla 6.6) y así el medio de cultivo que se obtiene
hace posible el desarrollo de gran variedad de bacterias y otros microorganismos.
Tabla 6.6. Composición del caldo y el agar nutritivo.
Caldo nutritivo
Extracto de carne
3g
Peptona
5g
Agua
1000 ml
Agar nutritivo
Extracto de carne
3g
Peptona
5g
Agar
15 g
Agua
1000 ml
Cuando se desea un medio de cultivo sólido se toma el agar como agente solificante. A
continuación se hace una descripción de estos materiales crudos, a partir de estos ingredientes
es posible preparar un medio capaz de permitir el crecimiento de muchas bacterias
heterótrofas:
Extracto de carne: Extracto acuoso de carne magra de res concentrado en pasta, contiene las
sustancias solubles en agua de tejidos animales, entre ellas carbohidratos, compuestos
orgánicos nitrogenados, vitaminas solubles en agua y sales.
Peptona: Es el producto que resulta de la digestión de materiales proteínicos, por ejemplo,
carne, caseína y gelatina, la digestión del material proteínico se efectúa con ácidos o enzimas;
sirven para hacer medios de cultivo bacteriológicos, diferentes tipos de peptonas. Es la fuente
principal de Nitrógeno orgánico, puede contener también algunas vitaminas y algunas veces
carbohidratos, esto en relación a la clase de material proteínico digerido.
Agar: Son carbohidratos complejos obtenidos de ciertas algas marinas, procesadas para
eliminar sustancias extrañas. Se usa como agente solidificante de los medios de cultivo, se
disuelve en solución acuosa, gelifica cuando la temperatura baja de 45ºC, no se considera agar
como nutriente para las bacterias.
Extracto de levadura: Es un extracto en solución acuosa de levaduras, se obtiene
comercialmente en polvo, es una fuente muy rica en vitaminas B, también contiene Nitrógeno
orgánico y compuestos de carbono.
Tipos de medios de cultivo
Aunque muchos heterótrofos se desarrollan bien en agar nutritivo o caldo nutritivo, otros no
crecen bien, y otros más, simplemente no se desarrollan.
Medios enriquecidos: La adición de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos
de animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les proporciona sustancias nutritivas
complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los heterótrofos
exigentes.
Medios selectivos: La adición al agar nutritivo de ciertas sustancias químicas específicas, no
permitirá el desarrollo de un grupo de bacterias, sin inhibir al mismo tiempo el crecimiento de
otros grupos. Por ejemplo, el cristal violeta en concentraciones especificas previene el
crecimiento de bacterias gram positivas sin afectar el desarrollo de bacterias gram negativas.
De manera similar, un medio en el cual la única fuente de carbono sea la maltosa, permite
seleccionar las bacterias que pueden asimilarla. En principio, se puede seleccionar las bacterias
que solo se desarrollen en presencia de compuestos orgánicos poco comunes agregando
dichos compuestos al medio de cultivo y omitiendo todos los demás compuestos de carbono.
Medios diferenciales: La adición de ciertos compuestos reactivos o sustancias químicas a los
medios de cultivo trae como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o de
cambios, después de la siembra e incubación del medio, lo cual permite al observador
diferenciar distintos tipos de bacterias. Por ejemplo, si se siembra una mezcla de bacterias en
un medio agar-sangre, algunas de las bacterias pueden destruir los glóbulos rojos, mientras
que otras no lo hacen. Cuando aparece una zona clara alrededor de la colonia bacteriana es
indicativo de que ocurre la hemolisis. Así es posible distinguir entre bacterias hemolíticas y no
hemolíticas que proliferan en el mismo medio. De hecho, el medio agar-sangre sirve
simultáneamente como medio de enriquecimiento y diferencial.
Medios de prueba: Para el ensayo de vitaminas, aminoácidos y antibióticos, se utilizan medios
de cultivo de composición conocida. Así mismo, se recurre a medios de composición especial
para probar desinfectantes.
Medios para cuenta bacterias: Para determinar el contenido bacteriano de sustancias tales
como leche y agua, se emplean ciertos tipos específicos de medios de cultivo. Se debe señalar
su fórmula, así como las especificaciones prescritas.
Medios de mantenimiento: Para preservar satisfactoriamente las características fisiológicas la
viabilidad de un cultivo, quizás se requiera de un medio diferente de aquellos que son óptimos
para el crecimiento. El crecimiento rápido y prolítico suele ocasionar la muerte rápida de las
células. Por ejemplo, la adición de glucosa a un medio de cultivo, con frecuencia exacerba el
crecimiento, y probablemente se produce ácido. En un medio de mantenimiento, es preferible
suprimir la glucosa.
En relación con su estado físico se pueden establecer diferencias más amplias entre los
medios. Se emplean ocasionalmente,
Medios sólidos: Como las rebanadas de papas, para cultivos especiales de bacterias.
Medios sólidos reversibles a líquidos: se ejemplifican con el agar nutritivo.
Medios semisólidos: Contienen pequeñas cantidades de agar, el cual le imparte una
consistencia de “natilla”, por ejemplo, caldo nutritivo y leche desnatada.
Preparación de los medios de cultivo
Para el cultivo de las bacterias se recurre a algunas sustancias comunes. En relación con esto,
se usa la leche desnatada y no entera. Los materiales, en su forma natural, no presentan
ningún problema para tomarlos como medio de cultivo ya que simplemente se depositan
dentro de los envases adecuados, los cuales deben ser previamente esterilizados.
Los medios de cultivo que se preparan del tipo agar o caldo nutritivos, se hacen mezclando los
ingredientes individuales necesarios, o de manera más práctica agregando agua a productos
deshidratados que contienen todos los ingredientes. En la preparación de medios de cultivo se
deben seguir los siguientes pasos:
1. Cada ingrediente, o el medio deshidratado completo, se debe disolver en un volumen
de agua destilada adecuado.
2. Se determinará el pH del medio y si es necesario se ajustará. El pH se determina por
medio de indicadores o potenciómetros.
3. El medio se pondrá en recipientes adecuados, cuyas bocas se cierran con tapones de
algodón, plástico o cubiertas de metal.
4. Los medios se esterilizan generalmente en autoclaves.
Condiciones físicas necesarias para el desarrollo
Además de conocer los nutrientes apropiados necesarios para el cultivo de bacterias, también
conviene conocer las condiciones físicas del medio en donde el microorganismo puede
desarrollarse mejor. Así como las bacterias varían ampliamente en relación a sus necesidades
nutricionales, también muestran respuestas diversas a las condiciones físicas del medio. Dicho
de otra manera, para un buen cultivo de las bacterias se necesita combinar apropiadamente
los nutrientes necesarios y las condiciones físicas adecuadas.
1. Temperatura
El proceso de desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas y la velocidad con
que se efectúan estas reacciones es influida por la temperatura, el patrón de desarrollo
bacteriano puede ser influido profundamente por esta condición. La temperatura, puede en
parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo total de los
microorganismos. Las variaciones de temperatura también pueden influir en los procesos
metabólicos y en la morfología celular. De acuerdo con esto las bacterias se pueden dividir en:
Psicrófilas: Capaces de desarrollarse a 0°C o menos, aunque crecen mejor a temperaturas
superiores, cercanas a 15 o 20°C. Muchas de las especies aisladas en la Antártida se
encontraron en proliferación a -7°C, pero se desarrollan en forma óptima entre 20 y 30°C.
Mesófilas: Crecen mejoren límites de temperatura que están entre 25 y 40°C.
Termófilas: Crecen mejor entre 45 y 60°C, los límites de desarrollo de algunas bacterias
termófilas se extienden a la región mesofílica. A esas especies se les conoce como termófilas
facultativas. Otras que pertenecen a las termófilas crecen mejor a temperaturas superiores a
60°C, se les conoce como termófilas verdaderas.
La temperatura óptima de crecimiento es la temperatura de incubación que permite el
desarrollo bacteriano en un periodo corto.
2. Condiciones de Oxigeno y CO2
Son los principales gases que afectan el desarrollo bacterias, éstas presentan una respuesta
amplia y variable al oxígeno libre, y sobre esta base se dividen en 4 grupos:
Aerobias: Bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.
Anaerobias: Bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
Anaerobias facultativas: Bacterias que se desarrollan tanto en presencia o ausencia de
oxígeno libre.
Microaerófilas: Bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre.
3. Acidez o Alcalinidad (pH)
En la mayor parte de las bacterias el pH óptimo de crecimiento está entre 6.5 y 7.5, aunque
algunas bacterias pueden desarrollarse a pH extremos, en la mayor parte de las especies los
límites mínimos y máximos corresponden a cualquier punto entre pH 4 y pH 9.