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LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Los requerimientos nutritivos de los microorganismos
2. Medios de cultivo: composición y preparación
3. Aislamiento de cultivos puros de microorganismos
4. Mantenimiento y conservación de microorganismos
5. Cultivos tipo y colecciones de cultivo
6. Definición del crecimiento
7. Curva de crecimiento
8. Métodos para medir el crecimiento microbiano
9. Crecimiento continuo
10. Factores que influyen en el crecimiento microbiano
LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE
MICROORGANISMOS
1. Los requerimientos nutritivos de los microorganismos
1.1 Macronutrientes
1.2 Oligoelementos
1.3 Factores de crecimiento
La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes
químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes
de las macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares.
Monómeros
Macromoléculas Estructuras
celulares
Monosacáridos
Polisacáridos
Pared celular
Glicocàlix
Aminoácidos
Proteínas
Membrana
Ribosomas
Flagelo
Pelos y fimbrias
Enzimas
Ácidos grasos
Lípidos
Membranas
Bases nitrogenadas
Ácidos nucleicos
Cromosoma
Ribosomas
Plásmidos
Nutrición microbiana
macronutrientes
C
Elemento más abundante en las macromoléculas.
Constituye el 50%
del peso seco de las células.
Muchos procariotas son heterótrofos. Necesitan algún tipo de
compuesto orgánico como fuente de carbono para hacer nuevo
material celular.
Los aminoácidos, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los
azúcares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromáticos y
un sinfín de compuestos orgánicos de otro tipo pueden ser
utilizados por las bacterias.
Algunos procariotas son autótrofos, capaces de construir
todas sus estructuras orgánicas a partir del CO2 con la energía
obtenida de la luz o de compuestos inorgánicos.
Nutrición microbiana
macronutrientes
N
En una bacteria típica, alrededor del
es N.
12% de su peso seco
Forma parte de las proteínas,
constituyentes celulares.
ácidos
nucleicos
y otros
En la naturaleza, se encuentra en forma orgánica e inorgánica.
Pero la mayor parte del N natural se encuentra en forma
inorgánica ( NH3,
NO3- o N2 ).
La mayoría de las bacterias son capaces de utilizar
NH3
como
única fuente de N, y otras muchas pueden utilizar NO3- .
El N2 puede ser usado como fuente de nitrógeno por algunas
bacterias, las bacterias
fijadoras de nitrógeno.
Nutrición microbiana
macronutrientes
P
El P se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos e
inorgánicos.
La célula necesita P para la síntesis de ácidos nucleicos y
fosfolípidos.
S
El S es un componente de los aminoácidos cis y met y se
encuentra en algunas vitaminas, como tiamina, biotina, ácido
lipoico y Coenzima A.
La mayoría del S celular procede de fuentes inorgánicas, ya sean
sulfatos o sulfuros.
K
El K es necesario para todos los organismos. Es cofactor de
muchas enzimas.
Mg
El Mg funciona como estabilizador de los ribosomas, las
membranas celulares y los ácidos nucleicos. También se necesita
para la actividad de muchas enzimas.
Ca
El Ca ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y tiene una
función importante en la termorresistencia de las endoesporas.
Na
El Na es requerido por algunos microorganismos (halófilos),
Nutrición microbiana
Fe
El Fe es fundamental en la respiración
celular.
Forma parte de los citocromos y de proteínas
en el transporte
que contienen Fe y S implicados
de electrones.
En condiciones anaeróbicas, el Fe se encuentra en el estado de oxidación +2 (Fe+2) y es
soluble.
En condiciones aeróbicas suele estar en el estado de oxidación +3 ( Fe+3) y forma varios
minerales insolubles.
Para obtener el Fe de tales minerales, las células producen agentes quelantes llamados
sideróforos que solubilizan el Fe y lo introducen en la célula.
Es necesario en mayores cantidades que otros metales y no se considera un elemento traza.
Nutrición microbiana
Micronutrientes (elementos traza)
Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn
Se requieren en muy pequeñas cantidades.
Son tan importantes para el funcionamiento celular como los macronutrientes.
Muchos son metales que actúan como cofactores de enzimas.
A menudo no es necesario añadirlos a los medios de cultivo.
Si el agua utilizada para elaborar el medio es ultrapura se añade al medio una
pequeña cantidad de una solución de metales traza.
Nutrición microbiana
Factores de crecimiento
Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que se necesitan en
muy pequeñas cantidades y sólo por algunas células.
Los factores de crecimiento son
vitaminas, aminoácidos, purinas y
pirimidinas.
La mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos,
pero en algunos casos es necesario añadirlos al medio.
Las vitaminas son los factores de crecimiento que se necesitan con mayor
frecuencia, funcionan formando parte de coenzimas.
Las principales vitaminas requeridas por los microorganismos son:
tiamina (vitamina B1)
biotina,
piridoxina (vitamina B6) y
covalamina (vitamina B12)
LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS
2. Medios de cultivo: composición y preparación
2. 1. Medios de cultivo químicamente definidos
2. 2. Medios complejos (no definidos)
2.3. Tipos de medios de cultivo
El medio de cultivo químicamente definido se prepara añadiendo cantidades precisas
de compuestos orgánicos e inorgánicos puros a un volumen conocido de agua destilada.
Se conoce su composición exacta.
Medio definido para Escherichia coli
K2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgSO4
CaCl2
Glucosa
Elementos traza
(Fe, Co, Mn, Zn,
Cu, Ni, Mo)
Agua destilada
pH7
7g
2g
1g
0,1 g
0,02 g
4-10 g
2-10 g
1000 ml
Medio definido para Leuconostoc mesenteroides
- K2HPO4
- KH2PO4
- NH4Cl
- MgSO4
- CaCl2
- Glucosa
- Acetáto sódico
0,6 g
0,6 g
3g
0,1 g
0,02 g
25 g
20 g
- Aminoácidos (ala, arg, asn asp,cis, glu, gln, gly, his, iso,
leu, lis, met, phe, pro, ser, thr, trp, tyr, val).
100-200 g de cada uno
- Purinas y pirimidinas (adenina, guanina, uracilo, xantina).
10 mg de cada una
-Vitaminas (biotina, folato, ácido nicotínico, piridoxal,
piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina, pantotenato,
ácido p-aminobenzoico)
0,01-1 mg de cada una
Elementos traza
2-10 g
(Fe, Co, Mn, Zn,
Cu, Ni, Mo)
Agua destilada
pH7
1000 ml
Para elaborar el medio complejo se utilizan hidrolizados de proteínas y otras
sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente que se pesan y se añaden a un
volumen conocido de agua.
No se conoce la composición exacta del medio complejo.
Medio complejo
para Escherichia coli
y Leuconostoc mesenteroides
Glucosa
15 g
Extracto de levadura 5 g
Peptona
5g
KH2PO4
2g
Agua destilada
1000 ml
pH7
Tipos de medios de cultivo
Medios sólidos y líquidos
Los medios sólidos se preparan como los medios líquidos y se les añade agar (1.5%) como agente gelificante.
El agar es un polímero sulfatado compuesto por D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y ácido glucurónico.
El agar se funde a 80-90ºC y se puede enfriar hasta una temperatura de 40 a 42 ºC sin endurecerse.
La mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo.
El agar se funde durante el proceso de esterilización, el medio fundido se vierte sobre placas Petri y se deja solidificar
antes de su uso.
Los medios sólidos inmovilizan a las células, permitiéndolas crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias.
Medios generales
Los medios generales mantienen el crecimiento de muchos microorganismos. Ej., el caldo y agar nutritivo
Medios enriquecidos
Medios generales a los que se añaden nutrientes especiales para mantener el crecimiento de microorganismos
heterótrofos exigentes. Ej., el agar sangre
Medios selectivos
Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares. Ej.,agar Levine (eosina-azul de metileno) y Agar
MacConkey se emplean para detectar enterobacterias. Contienen colorantes y sales biliares que inhiben el
crecimiento de las bacterias Gram positivas.
Otros medios selectivos contienen nutrientes que pueden utilizar algunas bacterias de forma específica. Ej., el agar
celulosa se usa para aislar bacterias que digieren la celulosa.
Medios diferenciales
Medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa de los
microorganismos según sus características biológicas.
El agar MacConkey es tanto selectivo como diferencial. Como contiene lactosa y colorante rojo neutro, las colonias
fermentadoras de lactosa (Escherichia coli) aparecen de color rosa o rojo y se distinguen fácilmente de las colonias no
fermentadoras.
LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE
MICROORGANISMOS
3. Aislamiento de cultivos puros de microorganismos
3.1 Transferencia aséptica
3.2 Siembra en placa por extensión; en estrías; y en
profundidad
3.3 Morfología y crecimiento de las colonias
Transferencia aséptica
Consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la
manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles.
Es uno de los primeros métodos que tiene que dominar un microbiólogo.
a.Se calienta el asa de siembra hasta incandescencia y se deja enfriar
b. El tubo se destapa
c. Se pasa el extremo del tubo por la llama
d. Se extrae la muestra con el asa esterilizada
e. Se vuelve a flamear la boca del tubo y la muestra se deposita en un medio estéril
f. Se vuelve a tapar el tubo y se calienta el asa de nuevo al final
Obtención de cultivos puros
2. Siembra en estrías
Se esteriliza el asa y
luego se toma una
muestra del tubo
Crecimiento de colonias confluentes
al comienzo de la siembra por estría
Colonias aisladas
al final
de la siembra por
estría
1. Dilución y siembra por
extensión en superficie
Se realiza una siembra
por estría en una placa de
agar con medio estéril.
Después de una estría inicail
Se hacen estrías en ángulo
3. Dilución y siembra
en profundidad
Morfología y crecimiento de las colonias
Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una o varias células.
El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias porque las
especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico.
El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo.
La morfología de la colonia de una bacteria puede variar según el medio en que crezca la bacteria.
Colonias de bacterias
Serratia marcescens
Cultivada en Agar
MaConkey
Pseudomonas aeruginosa
Cultivada en
Agar Tripticasa-soja
Shigella flexneri
Cultivada en
Agar MacConkey
Colonias de Bacillus subtilis que han crecido en
medios con pocos nutrientes