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ANALISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ftasa Y DE LA ENZIMA FRUCTOSILTRANSFERASA DE Aspergillus oryzae N74 MAURO ALEJANDRO RODRIGUEZ CLAVIJO Trabajo de grado Presentado como requisito parcial Para optar al título de Biólogo DIRECTOR Carlos Javier Alméciga Díaz, QF., PhD. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA Bogotá D.C. Noviembre de 2009 1
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
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alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
AGRADECIMIENTOS A Dios por permitirme alcanzar mis sueños, a mis padres y abuelos por el apoyo incondicional, el amor, y la confianza que han puesto en mí. A mi amigo y director Carlos Javier Alméciga por haberme permitido trabajar a su lado, por haberme acompañado en este proceso, haberme guiado y formado con sus valiosas ideas y por haber entregado su esfuerzo en este trabajo junto a mí. Al Doctor Luis Alejandro Barrera por haberme dado la oportunidad de trabajar en su laboratorio y conocer este bonito mundo de la investigación. A Oscar Sánchez por haber incentivado el desarrollo de este proyecto. A mis compañeros y amigos del Instituto de Errores Innatos del Metabolismo por haber ayudado en mi formación como profesional especialmente a Jenny Granados, Johana Guevara y Alexander Rodríguez por la grandiosa amistad que me brindaron. A mis profesores y amigos de la universidad quienes contribuyeron en mi formación personal y profesional.
TABLA DE CONTENIDO 1. MARCO TEORICO 1 1.1 PREBIÓTICOS. CARACTERÍSTICAS, COMPOSICIÓN Y SÍNTESIS 1.2 PRODUCCIÓN DE FRUCTOOLIGOSACARIDOS 1 1.3 GEN ftasa 3 5 1.4 FORMULACIÓN Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA 7 2.1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 8 2.2 PREGUNTA PROBLEMA 3. OBJETIVOS 8 9 3.1 OBJETIVO GENERAL 9 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 9 4. HIPÓTESIS 9 10 5.1.1 PRODUCCIÓN DE BIOMASA 10 5.1.2. EXTRACCIÓN DE ARN 10 5.1.3 CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE ARN TOTAL 10 5.1.4 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO 11 5.1.5 CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE ADN TOTAL 11 5.1.6 SÍNTESIS DE ADNc 5. MATERIALES Y MÉTODOS 11 5.1.7 DISEÑO DE CEBADORES 12 5.1.8 REACCIONES DE PCR 12 5.1.9 CONSTRUCCIÓN DE LA LIBRERIA DE ADNc 12 5.2.10 Escherichia coli COMPETENTES 13 5.2.11 TRANSFORMACIÓN DE LAS BACTERIAS COMPETENTES 13 5.2.12 EXTRACCIÓN DEL ADN DE LOS PLÁSMIDOS 14 5.2.13 CLONACIÓN GEN ftasa DE Aspergillus oryzae N74 14 5.2.14 ANÁLISIS DE SECUENCIA DEL GEN ftasa 15 5.2.15 ANÁLISIS DE SECUENCIA DE LA PROTEÍNA FTasa 16 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 17 6.1 PRODUCCIÓN DE BIOMASA 17 6.2 DISEÑO DE CEBADORES 17 6.2.1 CEBADORES A PARTIR DE LAS SECUENCIAS DE LOS GENES ftasa 17 6.2.2 CEBADORES A PARTIR DE LAS SECUENCIAS DE PROTEÍNAS 19 6.3 EVALUACIÓN DE LOS CEBADORES 20 6.4 EXTRACCIÓN DE ARN 21 6.5 SÍNTESIS DE ADNc DE PRIMERA Y SEGUNDA CADENA 22 6.6 LIBRERÍA DE ADNc 23 6.7 CLONACIÓN DEL GEN FTasa DE Aspergillus oryzae N74 24 6.8 EVALUACIÓN DE LOS CEBADORES DE CLONACIÓN 27 6.9 ANÁLISIS DEL GEN ftasa DE Aspergillus oryzae N74 29 6.10 ANÁLISIS DE LA PROTEÍNA FTasa DE Aspergillus oryzae N74 30 6.11 RELACIÓN ESTRUCTURA ACTIVIDAD 35 7. CONLUSIONES 42 8. RECOMENDACIONES 43 9. BIBLIOGRAFÍA 44 RESUMEN Los prebióticos son ingredientes de alimentos funcionales que promueven la salud animal y humana debido a su capacidad de favorecer el crecimiento de bacterias probióticas, mejorar la absorción de calcio y magnesio, y disminuir los niveles de fosfolípidos, triglicéridos y colesterol. Entre estos, los fructooligosacáridos (FOS), prebióticos del tipo fructano, representan una fuente importante de compuestos prebióticos ampliamente usados en alimentos funcionales. Los FOS son producidos por diferentes plantas, bacterias y hongos, siendo la 1‐kestosa, nistosa y 1‐β‐fructofuranosilnistosa los principales FOS, por la acción de la enzima fructosiltransferasa (FTasa). Recientemente se reportó la cepa colombiana Aspergillus oryzae N74 como un microorganismo potencial para el escalamiento del proceso industrial de producción de FOS, debido a los altos rendimientos de producción observados con este microorganismo. En el presente trabajo se realizó la clonación del gen ftasa de A. oryzae N74, empleando una estrategia de PCR que permitiera obtener el gen completo directamente desde muestras de ADN genómico y ADNc. El gen ftasa de A. oryzae N74 prestó un tamaño de 1630 pb con un 99% de identidad con genes ftasa de otras cepas de A. oryzae y entre 1 y 68% con otras cepas de Aspergillus. Este gen codifica para una proteína de 525 aminoácidos con péptido señal de 17 aminoácidos y similaridades del 99% con cepas de A. oryzae y entre el 11 y 69% con otras cepas de Aspergillus. Aunque 13 cambios de nucleótidos fueron observados en la secuencia del gen ftasa de A. oryzae N74, con respecto a otras cepas de A. oryzae, tan sólo tres cambios de aminoácidos fueron identificados. Finalmente, se intentó la construcción de una relación estructura‐actividad con base en alineamientos de secuencias, predicciones de propiedades fisicoquímicas y estructuras secundarias, y en reportes de actividades enzimáticas y de rendimientos de producción de FOS de FTasas de cepas de Aspergillus. En conjunto estos resultados muestran el elevado grado de conservación del gen y la proteína FTasa entre cepas de A. oryzae y representan un primer paso hacia al establecimiento de un proceso industrial para la producción de FOS usando microorganismos recombinantes portando el gen ftasa de A. oryzae N74. ABSTRACT Prebiotics are food ingredients that promote host health beneficially due to their effect over the growth and activity of probiotic bacterial species, help gut absorption of calcium and magnesium, and decrease plasma levels of phospholipids, triglycerides and cholesterol. Among them, the fructooligosaccharides (FOS), considered as inulin‐type fructans, represent an important source of prebiotic compounds that are widely used as an ingredient in functional foods. FOS are produced by the action of fructosyltransferase enzyme from different plants, fungi and bacteria, and they are mainly composed of 1‐kestose, nystose, and 1‐β‐
fructofuranosyl nystose. Recently, the Colombian strain Aspergillus oryzae N74 was reported as a potential microorganism for the industrial production of FOS, due to its high yields of FOS production. In this work, we used a PCR‐cloning strategy to clone the ftase gene from genomic DNA and cDNA of A. oryzae N74. Ftase gene showed a 1630 bp size with a 99% identity against other A. oryzae strains and between 1 to 68% identities with other Aspergillus strains. This gene encodes for a 525 amino acids protein with a signal peptide of 17 amino acids. FTase sequence showed 99% similarity with other A. oryzae strains and between 11 to 69% similarities with other Aspergillus strains. Although thirteen nucleotide changes were observed between A. oryzae N74 and other A. oryzae strains, only 3 amino acid changes were observed. Finally, we tried to construct a structure‐activity relationship base on sequences alignments, prediction of physicochemical properties and secondary structures, and reports of enzyme activities and yields of FOS production for FTases of Aspergillus strains. In summary, these results shows the high level of sequence conservation between A. oryzae strains and represent a first step towards the development of a FOS production industrial process using recombinant microorganism carrying the ftase gene from A. oryzae N74. INTRODUCCIÓN La síntesis de Fructooligosacaridos (FOS) a partir de plantas y microorganismos ha mostrado tener bajos rendimientos que constituyen un alto costo en la producción industrial de estos compuestos, y que a su vez ha llevado a un encarecimiento en los precios de los alimentos funcionales. En Colombia recientemente fue reportada la cepa Aspergillus oryzae N74 N74 como una alternativa en la producción de FOS por mostrar un perfil adecuado en la síntesis de estos compuestos. Sin embargo, a la fecha no se han evaluado los mecanismos moleculares involucrados en la actividad de la enzima fructosiltransferasa (FTasa) de Aspergillus oryzae N74, encargada de la síntesis de FOS, que relacione los rendimientos reportados para esta cepa. En este trabajo se propone realizar el análisis de la secuencia del gen ftasa y de la enzima FTasa de Aspergillus oryzae N74, como un primer paso al establecimiento de un proceso industrial para la producción de FOS usando microorganismos recombinantes. 1. Marco Teórico 1.1 Prebióticos. Características, composición y síntesis. Los prebióticos son un amplio grupo de compuestos que se caracterizan por: (1) ser resistentes al ácido y a las enzimas hidrolíticas gastrointestinales, evitando así su absorción, (2) ser fermentados por la microflora intestinal y (3) favorecer el crecimiento selectivo de bacterias intestinales benéficas como Lactobacillus sp. y Bifidobacterium sp., evitando la colonización por parte de microorganismos patógenos (Glenn et al. 2004; Hidaka et al. 1988). De igual manera los compuestos prebióticos no producen aumentos de los valores glicémicos, mejoran la absorción intestinal de calcio y magnesio, refuerzan la respuesta inmune, poseen un efecto anticariogénico y previenen la aparición de desordenes intestinales (Madrigal et al. 2007; Yun, 1996). Por esta razón, el consumo de compuestos prebióticos representa un importante beneficio para la salud humana. Finalmente, estos compuestos son de gran utilidad en la industria farmacéutica donde son utilizados como excipientes. (Biedrzycka et al. 2004; Gibson et al. 1995; Hidaka et al. 1986; Madrigal et al. 2007; Roberfroid et al. 1998; Yun 1996). Dentro de los prebióticos se encuentran los galactoologisacaridos (GOS), el levan y los fructanos (Glenn et al. 2004). Este último grupo está constituido por compuestos como inulinas, oligofructosas y fructoologosacaridos (FOS) (Tabla 1) (Glenn et al. 2004; Madrigal et al. 2007), que se presentan como cadenas lineales de fructosa (F) unidas por enlaces tipo β(2‐
1) con un extremo terminal de glucosa (G) (Madrigal et al. 2007). Las inulinas son una familia de polisacáridos que contienen más de 4 monómeros de fructosa (Madrigal et al. 2007; Yun 1996), sus derivados son los oligofructanos que se obtienen mediante hidrólisis de inulina, y los FOS que son sintetizados por la acción de la enzima fructosiltransferasa (FTasa E.C. 2.4.1.9) (Fig. 1), denominada también como inulosucrasa, sacarosa‐sacarosa fructosiltransferasa, levan fructotransferasa o β‐fructofuranosidasa (E.C. 3.2.1.26), esta última debido a una actividad invertasa observada en altas concentraciones de sacarosa (Kim et al. 2005; Olivares et al. 2003; Yun 1996). 1
Figura 1. Síntesis de fructanos a partir de sacarosa empleando la enzima FTasa Durante los últimos años los FOS se han convertido en uno de los compuestos prebiótico más importantes debido a su facilidad de producción y a las propiedades fisiológicas que presentan (Glenn et al. 2004; Hidaka et al. 1986). Los FOS están constituidos principalmente por 1 kestosa (GF2), nistosa (GF3) y 1‐β‐fructofuranosilnistosa (GF4) (Madrigal et al. 2007; Yun 1996) (FFig. 2). Los FOS son sintetizados por plantas como Beta vulgaris “remolacha”, Helianthus tuberosus “papa de Jerusalén”, Cichorium intybus “achicory”, y microorganismos como Aureobasidium pullulans, Aureobasidium sp., Arthrobacter sp., Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Aspergillus sydowi, Claviceps purpurea, Fusarium oxysporum, Penicillium frequentans, Penicillium spinulosum, Phytophthora parasitica, Scopulariopsis brevicaulis y Saccharomyces cerevisae (Andries 1996; Robert et al. 2002; Yun 1996). 2
Figura 2 Estructura química de los fructooligosacaridos (tomado de Yun 1996) Tabla 1 Propiedades de diferentes fructanos: inulina, oligofructanos y fructoologosacaridos (FOS) (Adaptada de Biedrzycka E. et al 2004). 1.2 Producción de Fructooligosacaridos Tradicionalmente la producción de FOS se ha realizado mediante el uso de raíces de especies vegetales como Cichorium intybus, la cual es la principal fuente para la producción industrial de estos compuestos (Madrigal et al. 2007; Yun 1996). Actualmente se ha implementado la utilización de microorganismos como una alternativa para la producción de FOS, debido a su facilidad de cultivo y mayores rendimientos. Algunos estudios han reportado rendimientos de producción de FOS empleando Aspergillus oryzae CFR (Sangeetha et al. 2005), Aspergillus sp (Fernández et al. 2004), Aureobasidium pullulans CFR (Sangeetha et al. 2004), Aerobasidium sp. ATCC 20524 (Salinas et al. 2009), Zymomonas mobilis (Bekers et al. 2002), Aspergillus japonicus (Chien et al. 2001), Aspergillus niger AS0023 (L’Hocine et al. 2000), Penicillium citrinum (Hayashi et al. 2000), Aureobasidium pullulans sp (Madlová et al. 1999), Aspergillus niger ATCC20611 (Hidaka et al. 1988), Aspergillus sp. N74 (Sánchez et al. 2008a) (Tabla 2) Tabla 2 Rendimientos y composición de FOS a diferentes tiempos de reacción reportados para algunos microorganismos (modificada de Sánchez et al. 2008a) La producción de FOS es dependiente del microorganismo y de condiciones como pH, temperatura, concentración inicial de sustrato, cantidad de biomasa inicial y tipo de proceso 3
de producción (lote, lote alimentado o continuo) (Caicedo et al., 2009; Chien et al. 2001; Iraj et al. 2007; Sánchez et al. 2008). Según Sangeetha et al. 2006, la enzima FTasa aislada de Aspergillus oryzae CFR 202 presenta los máximos rendimientos en la producción de FOS cuando la reacción de síntesis es realizada a pH 5,5, con una concentración de sustrato (sacarosa) del 63% peso/volumen (p/v), obteniendo un rendimiento total de FOS del 56% peso/peso (p/p) al cabo de 36 horas de reacción. Para otras especies del mismo genero como Aspergillus japonicus la producción máxima de FOS se obtiene inmovilizando 0,8g de micelio en una matriz de gluten para un proceso de producción continuo, el cual se realiza con una concentración inicial de sacarosa del 40% p/v a una temperatura de 37 0C, obteniendo rendimientos de FOS totales del 61% p/p (Chien et al. 2001). Para Aspergillus sp 27 H los rendimientos máximos de producción se alcanzan a pH 5,5, temperatura de 400C y concentración inicial de sacarosa del 61% p/v, alcanzando un rendimiento en la producción de FOS del 60% p/p (Fernández et al. 2004). Por otro lado, la cepa Aspergillus níger AS0023 presentó un rendimiento total de FOS del 54% p/p, en una reacción de con una concentración inicial de sacarosa del 50%, pH 5,4 y con temperaturas inferiores a 50 0C (L`Hocine et al. 2000). Algunos microorganismos como Aerobasidium pullulans CFR 77 muestran una máxima producción de FOS en una concentración de sacarosa del 55% p/v obteniendo una conversión total de FOS por encima del 57% p/p en 12 horas. (Sangeetha et al. 2004). De igual manera se han reportado resultados usando la cepa Aerobasidium sp. ATCC 20524 en lote alimentado, con rendimientos totales de FOS entre 55 y 60% p/p cuando se utilizó una concentración inicial de sacarosa entre el 10 y el 70% p/v, respectivamente, a pH 6,5 y temperatura de 30 0C (Salinas et al. 2009). Adicionalmente se ha documentado que otras especies de hongos como Penicillium citrinum pueden sintetizar FOS, con rendimientos máximos del 55% p/p, cuando se usa concentraciones iniciales de sacarosa entre 20 y 70% p/p durante 24 horas (Hayashi et al. 2000). Otros reportes mencionan el uso de bacterias como Zimomonas mobilis la cual mostró que la producción máxima de FOS se alcanza aislando a partir de este microorganismo la enzima levansucrasa y utilizándola como biocatalizador en presencia de levan, incubando la reacción con sacarosa al 60% p/p, 45 0C durante 24 horas. Obteniendo máximos rendimientos en la producción de FOS entre 24 y 32% p/p (Bekers et al. 2002). 4
Recientemente se reportó el aislamiento y caracterización de la cepa Aspergillus oryzae N74 como una alternativa para la producción industrial de FOS, debido a los mayores rendimientos observados con esta cepa (Sánchez et al. 2008 a,b). El microorganismo fue aislado a partir de un cultivo de caña de azúcar en el municipio de La Peña (Cundinamarca‐Colombia). Esta cepa mostró un perfil de producción máximo de FOS del 70% p/p al cabo de 4 horas cuando se utilizó una concentración de sacarosa superior a 55% p/v, pH 5,5 y temperatura de 60 0C (Sánchez et al. 2008 a, b). Adicionalmente se ha evidenciado que la cepa presenta una composición GF2, GF3 y GF4 del 43%, 25% y 2% p/p, respectivamente (Sánchez et al. 2008b), convirtiéndose en una alternativa importante para escalar la producción de FOS a nivel industrial. 1.3 Gen ftasa El gen ftasa ha sido clonado, caracterizado y expresado en diferentes microorganismos por varios autores. Al igual que la enzima, el gen ftasa puede ser encontrado con diferentes nombres como STF, 1‐SST, isIA, IftA, ftf, dependiendo del organismo del cual fue aislado. A pesar que el gen que codifica para enzimas asociadas con la producción de FOS ha sido aislado y caracterizado de diferentes microorganismos, los rendimientos de producción de FOS en estos microorganismos o con microorganismos recombinantes portando el gen ftasa han sido reportados sólo para un número limitado de ellos. Sin embargo, estudios en microorganismos del mismo género ha mostrado que los rendimientos en la síntesis de FOS son muy similares entre ellos (Tabla 2). Arnd et al. (2001) aislaron a partir del hongo Aspergillus sydowi IAM 2544 el gen STF (Fructosiltransferasa dependiente de sacarosa), el cual presentó un tamaño de 2,2 kb que codifica para una proteína de 682 aminoácidos (fructofuranosidasa) con un peso molecular aproximado de 75 kDa. En Aspergillus foetidus se realizo la clonación del gen sacarosa‐sacarosa transferasa (1‐SST) con un tamaño de 1,6 kb que codifica para una proteína de 537 aminoácidos con un peso molecular de 59,1 kDa y un péptido señal de 19 aminoácidos (Rehm et al. 1998). Por otro lado en Aspergillus níger se clonó el gen SucB, el cual posee un tamaño de 1,9 kb y codifica para la enzima fructosiltransferasa con una tamaño de 76 kDa (Coenie et al. 2007) A partir de Leuconostoc citreum se aisló el gen isIA que codifica para la proteína Inulosucrasa, asociada con la síntesis de FOS en este microorganismo (Olivares et al. 2003). A diferencia de 5
lo observado en cepas de Aspergillus, el gen presenta un tamaño de 5,6 kb con un marco de lectura abierto (ORF) de 4,47 kb. El gen posee una secuencia de unión a ribosoma (secuencia Shine‐Dalgarno, AGGGAG) ubicada 8 pb corriente arriba del codón de inicio. El promotor de este gen esta localizado a 34 pb corriente arriba del codón de inicio, junto con las secuencias ‐
35 (TTGTAAC) y ‐10 (TATAGT). La proteína codificada por el gen islA es una enzima de 1490 aminoácidos, compuesta por tres dominios y con un peso molecular de 165 kDa. Adicionalmente, la proteína es una fructosiltransferasa quimérica, resultante de la sustitución del dominio catalítico de alternansucrasa por el de fructosiltransferasa (Olivares et al. 2003). Kim et al. (2005) aislaron a partir de Arthrobacter ureafaciens K2032 el gen lftA el cual codifica para la enzima levan fructotransferasa con un peso 56 kDa. La secuencia del gen mostró tener un tamaño de 1,6 kb. Al igual que en Leuconostoc citreum, el gen es precedido por la secuencia de unión al ribosoma (GAGAGG), 8 pb corriente arriba del codón de inicio. Teruaki et al. (1987) realizaron la caracterización del gen ftf aislado de la bacteria Streptococcus mutans GS‐5, mostrando que el gen posee un tamaño de 2,4 kb y codifica para una enzima con actividad fructotransferasa de 87,6 kDa que presenta una péptido señal de 34 aminoácidos. El gen posee una región invertida‐repetida que lo precede, que puede desempeñar un papel importante en la regulación de la transcripción del gen. El análisis y descripción del uso de codones mostró que en el 78% de los casos la tercera posición estaba ocupada por A o T, aunque la importancia biológica de este análisis no fue determinada. Adicionalmente, en este trabajo se describieron 4 secuencias flanqueantes al gen ftf que corresponde a diferentes ORFs (ORF 1, ORF 2, ORF 3, ORF 4), donde el ORF 1 y el ORF 2 están involucrados en la regulación transcripcional del gen ftf, y ORF 3 y ORF 4 están involucrados en la interacción proteína‐ADN para la regulación de la transcripción. En Lactobacillus reuteri se aisló una secuencia de 4 kb, la cual posee un ORF con un tamaño de 2,4 kb que mostró dos posibles codones de inicio en las posiciones 1432 y 1459, respectivamente. El primer codón de inicio codifica para una enzima con actividad fructosiltransferasa de 798 aminoácidos y un peso molecular de 87 kDa. Por su parte, el segundo codón de inicio codifica para una posible enzima fructosiltransferasa de 789 aminoácidos con peso molécular de 86 kDa (Hijum et al. 2002). 6
Finalmente en la base de datos GenBank se han reportado distintas secuencias para el gen ftasa obtenidas a partir de Aspergillus oryzae (EU181219, EU142022, XM_001823193), como también para otros microorganismos como Actinomyces naeslundi (AF228582), Aspergillus terreus NIH2624, Aspergillus niger (DQ233219.1, AB046383.1, DQ233220.1, AF029359, XM_001396534), Bacillus lincheniformes RN‐01 (FJ171619), Lactobacillus acidophilus (AJ698830), Streptococcus salivarus (L07794), Weissella confusa MBF8‐2 (FJ485940), y Xanthophyllomyces dendrorhous (FJ539193). 2. Formulación y justificación del Problema Los prebióticos son un grupo de compuestos con características metabólicas particulares debido a que no son absorbidos en el tracto gastrointestinal, son fermentados por la microflora intestinal y estimulan el crecimiento selectivo de esta (Glenn et al. 2004). Dentro de los prebióticos se encuentran los GOS, el levan y los fructanos. Este último grupo se encuentra constituido por inulinas, oligofructanos y fructoologasacaridos (FOS) (Glenn et al. 2004; Irma et al. 1999; Madrigal et al. 2007). De los prebióticos aquellos que presentan las mejores características metabólicas y fisiológicas son los FOS, debido a su capacidad para ser metabolizados de manera más eficiente por bacterias de la microflora intestinal (Glenn et al. 2004; Hidaka et al. 1986). Los fructooligosacaridos (FOS) son polímeros de fructosa (F) que contienen residuos de glucosa (G). Estos compuestos son sintetizados por plantas, hongos y algunas bacterias mediante la acción de la enzima fructosiltransferasa (FTase, E.C. 2.4.1.9) (Madrigal et al. 2007; Yun 1996). Los FOS incluyen compuestos como 1‐kestosa (GF2), nistosa (GF3) y 1‐β‐fructofuranosilnistosa (GF4), con uniones de tipo β(2‐1) (Clevenger et al. 1988; Sangeetha et al. 2005; Yun 1996). Estos polímeros son empleados en la industria farmacéutica como edulcorantes y fibra dietaría en alimentos funcionales, además son de importancia por encontrarse asociados a la reducción de los niveles de colesterol y triglicéridos, absorción de calcio y magnesio, y crecimiento selectivo de lactobacilos y bifidobacterias (Gibson et al. 1995; Hidaka et al. 1986; Roberfroid et al. 1998; Yun 1996). La producción industrial de FOS se ha venido realizando mediante la implementación de cultivos vegetales de especies como Beta vulgaris, Helianthus tuberosus y Cichorium intybus, siendo esta última las mas utilizada por presentar altos niveles de inulina, de donde se obtienen los FOS mediante procesos de hidrólisis enzimáticos y/o químicos (Madrigal et al. 2007). Sin embargo, la producción se encuentran limitada por la estación del año en la que 7
este el cultivo y la extracción industrial presenta bajos rendimientos. Además, compuestos como nistosa y 1‐β‐fructofuranosilnistosa no son sintetizados, por lo que el úso de plantas para la producción industrial de FOS presenta bajos rendimientos (Andries 1996; Robert et al. 2002; Yun 1996). Por otro lado, se ha encontrado que hongos del genero Aspergillus, Aureobasidium, Fusarium, Zymomonas, Penicillium y bacterias del genero Arthrobacter, presentan altos valores de actividad de transfructosilación, convirtiéndose en importantes alternativas para la producción industrial de FOS (Maiorano et al. 2008; Yun 1996). Recientemente, se demostró que la cepa Aspergillus oryzae N74 aislada de un cultivo de caña de azúcar en el municipio de La Peña (Colombia), presenta actividad de trasfructosilación y permite la producción de FOS con rendimientos mayores que los observados por otros microorganismos (Tabla 2). Esta misma cepa mostró un perfil de producción de 1‐kestosa, nistosa y 1‐β‐fructofuranosilnistosa similar al reportado por otros microorganismos, sugiriendo que podría ser usada para la producción industrial de estos compuestos (Sanchez et al. 2008a). Algunos autores han reportado la clonación del gen ftasa a partir de en microorganismos como Lactobacillus reuteri 121 (van Hijum E. et al 2002), Artrhobacter ureafaciens K2032 (Kim et al. 2005), Leuconostoc citreum (Olivares et al. 2003), Aspergillus foetidus (Rehm et al. 1998), Aspergillus sydowi IAM 2544 (Arnd et al. 2001), Streptococcus mutans (Teruaki et al. 1988), Aspergillus níger (Coenie et al. 2007), Aspergillus oryzae (Machida et al. 2005; GenBank No. EU181219.1), los cuales poseen un alto grado de homología y codifican para enzimas con tamaños y dominios similares. En la actualidad no se han evaluado los mecanismos moleculares involucrados con la actividad de FTase de Aspergillus oryzae. N74 que permitan ser relacionados con los rendimientos reportados por Sánchez et al. (2008) para esta cepa. En el presente estudio se propone realizar la clonación del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 para estudiar su secuencia y la secuencia de la proteína que codifica, con el fin de compararlas contra otras secuencias e identificar posibles diferencias que estuvieran favoreciendo los altos rendimientos reportados para este microorganismo. Este trabajo representa un primer paso hacia el establecimiento de un proceso industrial para la producción de FOS a través de microorganismos recombinantes (bacterias, levaduras o plantas). 8
2.1 Problema de Investigación En la actualidad no se han evaluado y descrito los mecanismos moleculares relacionados con la actividad de FTase de Aspergillus oryzae. N74 que explique los rendimientos en la producción de FOS reportados para esta cepa. 2.2 Pregunta Problema ¿Son las secuencias del gen ftasa y de la proteína FTasa de Aspergillus oryzae N74 diferentes de las secuencias de Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus foetidus, Aspergillus sydowi , Aspergillus oryzae, y Aspergillus fumigatus? 3. Objetivos 3.1 Objetivo General Comparar la secuencia del gen ftasa y de la enzima FTasa de Aspergillus oryzae N74 contra las reportadas para otros hongos productores de FOS 3.2 Objetivos Específicos: 3.2.1 Describir la secuencia de ADN correspondiente al gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 N74 3.2.2 Comparar la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 con las secuencias de otros hongos productores de FOS 3.2.3 Describir la secuencia de la enzima FTase de Aspergillus oryzae. N74 a partir de la secuencia del gen 3.2.3 Comparar la secuencia de la enzima FTasa de Aspergillus oryzae N74 con las secuencias de otros hongos productores de FOS 4. Hipótesis Las secuencias del gen ftasa y de la enzima FTasa de Aspergillus oryzae N74 son diferentes de las secuencias reportadas para otras cepas de Aspergillus, debido a la variabilidad genética intra e interespecifica presente entre estos microorganismos. 9
5. Materiales y Métodos 5.1.1 Producción de Biomasa El cultivo del microorganismo se realizó en 100 ml de medio de cultivo (11% sacarosa, 0,84% de K2HPO4, 0,102% MgSO4.7H2O, 0,088% KCl, 0,007%, FeSO4∙7H2O, 0,085%, NaNO3∙4H2O, 2,0% extracto de levadura, 0,136% CaCO3, ajustado a pH 5,5±0.1 con HNO3) (Sanchez et.al 2008b), en un Erlenmeyer de 500 ml, el cual se inoculo con 1 ml de una suspensión de 1×107 esporas/ml. El medio de cultivo inoculado se incubó por 48 horas a 30±1 0C a 250 rpm. Al cabo de las 48 horas el micelio se separó mediante filtración y se lavó con buffer fosfato 50 mM, pH 5,5. La biomasa fue almacenada a ‐20oC hasta su posterior procesamiento. 5.1.2 Extracción de ARN. La extracción de ARN se realizó empleando el reactivo Trizol® (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cien miligramos de micelio fueron pulverizados con nitrógeno líquido y mezclados con 1 ml de Trizol® en un tubo de microcentrífuga, incubando la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se adicionaron 0,2 ml de cloroformo y la mezcla se agitó por 15 segundos e incubó por 15 minutos a temperatura ambiente. La separación de las fases se realizó por centrifugación a 10.600 rpm. g por 15 min a 4 oC. La fase acuosa fue trasferida a un tubo nuevo y se agregaron 0,5ml de isopropanol. La mezcla se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a 10.600 rpm. por 10 minutos a 4 oC, descartando el sobrenadante. El precipitado (ARN total) se resuspendió en 1 ml de etanol al 75% y se recuperó por centrifugación a 8.400 rpm por 5 minutos a 4 oC. El ARN se secó durante 10 min a temperatura ambiente y se disolvió en 100 μl de agua tratada con dietilpirocarbamato (DEPC) y se incubó a temperatura ambiente durante 10‐15 min. Todo el material empleado durante el proceso de extracción del ARN (puntas de micropipeta y tubos de microcentrifuga) fue previamente tratado con agua‐DEPC al 2%, para remover las RNasas. 5.1.3 Cuantificación y análisis de ARN total La cuantificación del ARN se realizó espectrofotométricamente a 260 nm y a 280nm (Shimadzu BioSpec‐1601). La presencia y calidad del ARN fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% con y sin formamida, revelado posteriormente con bromuro de etidio. 10
5.1.4 Extracción de ADN genómico La extracción del ADN genómico fue realizada empleando el protocolo descrito por John Weiland (http://www.fgsc.net/fgn44/weiland.html), con modificaciones. Un gramo de micelio fue pulverizado con nitrógeno liquido, el cual fue transferido a un tubo de 50 ml y mezclado con 10 ml de buffer de lisis (100mM Tris HCl pH 8,0, 20mM EDTA disódico, 0,5M NaCl, 1% SDS) y 5 ml de fenol/cloroformo/isoamilacohol (24:25:1). La mezcla se homogenizó por inversión, se transfirió a tubos de microcentrifuga y se centrifugó a 12.300 rpm por 5 min a temperatura ambiente. La fase acuosa fue transferida a tubos nuevos de microcentrifuga y se adicionaron 0,6 volúmenes de isopropanol, incubando la mezcla por 10 minutos a temperatura ambiente. El precipitado se obtuvo por centrifugación a 16000g por 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue descartado y el precipitado (ADN) se lavó con etanol al 70%, se secó durante 10 min a temperatura ambiente y se reconstituyó en 200 μl de solución de rehidratación (Promega). 5.1.5 Cuantificación y análisis de ADN total La cuantificación del ADN se realizó espectrofotométricamente (Shimadzu BioSpec‐1601) a 260 nm y a 280nm. La presencia y calidad del ADN fue analizada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% revelado posteriormente con bromuro de etidio. 5.1.6 Síntesis de ADNc A partir de 5 µg de ARN total, se realizó la síntesis de la primer cadena de ADNc utilizando el kit Protoscript® First Strand ADNc Synthesis (New England Biolabs, NEB), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de la segunda cadena se tomaron 20 µL de la reacción de la síntesis de la primera cadena y se adicionaron 72 μl de agua‐DEPC, 8 μl de buffer segunda cadena 10X (100 mM Tris‐HCl, pH 6,9, 450 mM KCl, 23 mM MgCl2, 0,75 mM β‐NAD, 50 mM (NH4)2SO4), 3 μl de ADN polimerasa E. coli (10 U/μl, Fermentas) y 1 μl de RNasa E. coli H (2 U/μl, Fermentas), para un volumen final de 100 µL. La muestra se mezcló suavemente y se incubó 2 horas a 16 0C. Posteriormente a la mezcla se le agregaron 12,5 U de T4 ADN polimerasa (Fermentas) y se incubó a 160C durante 5 minutos. La reacción se detuvo con 5 μl de EDTA 0,5M, pH 8,0. Para la precipitación de la segunda cadena se adicionaron 500 µl de isopropanol y la mezcal se incubó en hielo por 10 minutos. Al cabo de este tiempo, la mezcla se centrifugó a 16000 g temperatura ambiente por 5 min. El sobrenadante se descartó y el precipitado (ADNc) se lavó con etanol al 70%. El precipitado se secó por 10 minutos a 11
temperatura ambiente y fue reconstituido en 50 μl de solución de rehidratación de ADN (Promega). 5.1.7 Diseño de cebadores. Para la evaluación de las etapas de síntesis de la primera y segunda cadena se diseñaron 3 cebadores (uno delantero y dos reversos) a partir de las secuencias reportadas en la base de datos GenBank para los genes (GenBank No. EU181219, EU142022 y XM_001823193) y proteínas (GenBank No. ABX55999.1, ABY49829.1 y XP_001823245.1) fructosiltransferasa para cepas de Aspergillus oryzae. Estas secuencias fueron alineadas empleando la herramienta CLUSTALW del programa Bioedit 7.0.0. (Ibis Biosciences). Para el diseño de los cebadores obtenidos a partir de las secuencias de genes ftasa se seleccionaron 2 regiones de mínimo 18 nucleótidos conservadas entre las secuencias de genes. Para el diseño de las pareja de cebadores que se diseñaron a partir de proteínas se seleccionaron regiones de 5 o mas aminoácidos conservados, la cuales fueron sometidas a traducción reversa mediante la herramienta Reverse Translation disponible en Sequence Manipulation Suite (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html) implementando la tabla de uso preferencial de codones para Aspergillus oryzae (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi‐
bin/showcodon.cgi?species=5062). La especificidad de estas regiones se evaluó mediante alineamientos empleando la herramienta Primer‐BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). 5.1.8 Reacciones de PCR La funcionalidad de los cebadores y los resultados de la síntesis de primera y segunda cadena fueron evaluados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para este fin, 2 µl de ADN genómico o de ADNc (primera o segunda cadena) se mezclaron con 2 μl de buffer 10X PCR (Invitrogen), 4 μl dNTPs (1mM), 0,6 μl MgCl (50mM) (Invitrogen), 0,2 μl Taq polimerasa (5U/ μl, Invitrogen), 0,8 μl de cebadores (100mM) y agua desionizada para volumen final de 20 μl. La reacción se realizó en un termociclador Eppendorf AG 22331 con 35 ciclos de 1 min a 95 0
C, 1 min 59 0C y 45 seg a 72 0C. 5.1.9 Construcción de la libreria de ADNc El producto de síntesis de la segunda cadena de ADNc se introdujo en el plásmido pUC13 (Fig. 3). Para este fin, 20 μg de plásmido pUC13 fueron digeridos con la enzima de SmaI, siguiendo las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, NEB). El plásmido digerido fue 12
desfosforilado con 20 U de fosfatasa alcalina (Invitrogen), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. La digestión del plásmido fue confirmada mediante electroforesis en agarosa 1%, de allí se extrajo la banda y el plásmido fue posteriormente recuperado del gel utilizando el kit DNA and Gel Band Purification (Amersham Biosciences®), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la ligación se tomaron 0,2 μg del producto de síntesis de ADNc segunda cadena y 0,2 μg del plásmido pUC13 digerido y defosforilado, que fueron ligados con 1 U de la enzima T4 DNA ligasa (NEB). La reacción de ligación se realizó en un volumen de 10μl y se incubó durante toda la noche a 16oC. La enzima fue inactivada a 65oC durante 10 minutos. Con el producto de ligación se transformaron las cepas E. coli JM109, DH5α y XL‐gold competentes, empleando el método de choque térmico. Figura 3. Vector plasmídico pUC13 empleado para la clonación 5.2.10 Escherichia coli competentes Para todos los ensayos de transformación se emplearon las cepas E. coli JM109, DH5α, y XL‐
gold. El plásmido pUC13‐IDS, previamente construido en el IEIM, y agua estéril fueron empleados como controles positivo y negativo de transformación, respectivamente. Los cultivos bacterianos se realizaron en medio Luria Bertani (LB: 0,5% extracto de levadura, 1% triptona y 0.5% NaCl, pH 7,2‐7,3). Las células de E. coli competentes se obtuvieron por el método de CaCl2 (Sambrook et al. 1989). Cuarenta mililitros de medio LB se inocularon con una colonia de E. coli y se incubó a 37 ºC y 250 rpm durante toda la noche. Con 1 mL de este 13
cultivo se inocularon 100 ml de medio LB fresco, que se incubó a 37 ºC y 250 rpm hasta alcanzar una densidad óptica (DO600 nm) entre 0,4 y 0,5 El cultivo se incubó en hielo durante 10 min, se centrifugó a 3000 rpm, por 5 min a 4°C, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 20 ml de una solución fría de CaCl2 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 7,0. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 4ºC y se centrifugó 3000 rpm, por 5 min a 4°C. El sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 4 ml de CaCl2 50 mM frío. Las bacterias resuspendidas se incubaron 24 horas a 4°C. Para su conservación, se adicionaron 0,66 μl de glicerol al 60% y se realizaron alicuotas de 150 µl que fueron almecenadas ‐80°C hasta su posterior uso. 5.2.11 Transformación de las bacterias competentes Cinco microlitros de los productos de ligación se mezclaron con 100 μl de células E. coli competentes. La mezcla se incubó en hielo por 20 minutos, a 42oc por dos minutos y finalmente a 4 oC por dos minutos. Posteriormente se adicionó a la mezcla 1 ml de medio LB sin ampicilina. La mezcla se incubó a 37 oC y 250 rpm durante 1 hora. Finalmente, se sembraron 100 μl de las bacterias transformadas en agar LB suplementado con ampicilina 100 μg/ml, como antibiótico de selección. Los cultivos se incubaron entre 12 y 16 horas a 37°C (Sambrook et al., 1989). Como control positivo de transformación se empleó el plásmido pU13 sin digerir y como controles negativos se empleó agua destilada estéril y plásmido pU13 digerido y desfosforilado. 5.2.12 Extracción del ADN de los plásmidos La extracción del ADN plasmídico se hizo por el método de mini preparación (Sambrook et al., 1989). Las células E. coli transformadas se cultivaron en 3 ml de LB suplementado con ampicilina a 37 °C y 250 rpm durante toda la noche. El cultivo se centrifugó a 16000 g por tres minutos, el sobrenadante se removió suavemente y al precipitado se resuspendió en 100 μl de solución A (Sacarosa 5mM, EDTA 10mM, Tris‐HCl 25mM, pH 8.0 y RNasa 10 mg/ml). Posteriormente se adicionaron 200 μl de solución B (NaOH 0.2 N, SDS 1%), se mezcló por inversión y se incubó durante tres minutos a temperatura ambiente. A la mezcla se adicionaron 150 μl de acetato de sodio 3 M, pH 4.8, se mezcló por inversión y se incubó en hielo por 30 minutos. Pasado este tiempo, se centrifugó por cinco minutos a 16000 g. Al sobrenadante se le adicionó 500 μl de isopropanol y la mezcla se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. El ADN plasmídico fue recuperado por centrifugación a 13000 rpm durante 15 min a 4 oC. El precipitado se lavó con etanol al 75% y se centrifugó a 13000 rpm por 14
15 min a 4ºC. El ADN precipitado se seco a temperatura ambiente y se disolvió en 100 a 200μl de agua destilada. La concentración del ADN se determinó midiendo la absorbancia a 260 y 280 en un espectrómetro Shimadzu BioSpec‐1601. Los plásmidos obtenidos quedaron listos para ser analizados mediante digestión con enzimas de restricción, clonación o PCR. 5.2.13 Clonación gen ftasa de Aspergillus oryzae N74. Para clonar el gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 se diseño una pareja de cebadores capaces de amplificar la totalidad del gen. Para seleccionar la secuencia para el diseño de estos cebadores, se realizo una PCR in silico con los cebadores diseñados a partir de la secuencia de ADN (F y R) y las secuencias reportadas para las cepas Aspergillus oryzae GX0015 ((GenBank No. EU181219), GX0010 (GenBank No. EU142022) y RIB40 (GenBank No. XM_001823193) usando el programa pDRAW32 versión 1.0 (AcaClone Software). Estos fragmentos fueron sometidos a un análisis de restricción computacional con las enzimas EcoRI, SmaI y HindIII para su posterior comparación con el perfil de restricción usado el DNA genómico de Aspergillus oryzae N74. A continuación se realizó una PCR con los cebadores F‐R utilizando el ADN genómico de Aspergillus oryzae N74. Los productos de PCR fueron purificados desde el gel de agarosa y digeridos con las enzimas de restricción EcoRI, SmaI y HindIII. A partir de estos resultados se seleccionó la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae GX0015 (GenBank No. EU181219), para el diseño de los cebadores para la clonación del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74. Los cebadores se diseñaron con base en las secuencias de los extremos 5’ (FTasa‐F) y 3’ (FTasa‐R) de la secuencia de Aspergillus oryzae GX0015. Con el objetivo de facilitar los pasos siguientes de subclonación se adicionó la secuencia de reconocimiento para la enzima EcoRI. La reacción de PCR para la clonación del gen se realizó usando el kit Expand Long Template PCR System (Roche), siguiendo las condiciones del fabricante, y con 40 ciclos de 1 min a 95 0C, 1 min. a 58 0C y 2 min. a 680C. La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 50μl empleando las muestras de ADN genómico y cDNA de segunda cadena. Para la secuenciación del fragmento, los productos de PCR con el ADN genómico y cDNA de segunda cadena, fueron recuperados desde el gel de agarosa. Los fragmentos fueron secuenciados empleando los cebadores FTasa‐F, FTasa‐R y el cebador delantero diseñado a partir de las secuencias de los genes de A. oryzae. La secuenciación fue realizado por la compañía Retrogen Inc. (San Diego, CA, USA, http://www.retrogen.com/). Los fragmentos secuenciados fueron ensamblados usando el programa Contig Assembly Program CAP3 ( http://mobyle.pasteur.fr/cgi‐bin/portal.py) con el cual se identificaron las regiones que se sobrelapaban entre los fragmentos secuenciados. Las secuencias finales del 15
gen y del cDNA de segunda cadena fueron curadas en los puntos donde se desconocía el nucleótido de manera manualmente comparando los patrones cromatográficos obtenidos contra la secuencias de la cepa A. oryzae GX0015. 5.2.14 Análisis de secuencia del gen ftasa. La secuencia obtenida fue comparada contra las secuencias ftasa Aspergillus terreus NIH2624 (XM001216100.1), Aspergillus foetidus NRR337 (AJ000493.1), Aspergillus sydowi IAM2544 (AJ289046.1), Aspergillus niger B60 (L06844.1,), Aspergillus niger ATCC 20611 (AB046383.1), Aspergillus niger IBT10SB (AF029359), Aspergillus oryzae GX0015 (EU181219), Aspergillus fumigatus Af293 (XM744167), Aspergillus oryzae GX0010 (EU142022), Aspergillus oryzae RIB 40 (XM001823193), Aspergillus niger CBS 51388 (DQ233218, DQ233219.1, DQ233220.1, XM001396534). La secuencias fueron alineadas empleando la herramienta ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) y analizadas con el programa Bioedit 7.0.0. (Ibis Biosciences). 5.2.15 Análisis de secuencia de la proteína FTasa. Para realizar el análisis de la secuencia de la proteína, la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 y de las otras cepas de Aspergillus fueron traducidas con la herramienta Translate Tool disponible en el servidor Expasy (http://www.expasy.ch/tools/dna.html). La secuencia fue comparada contra las proteínas de las cepas Aspergillus terreus NIH2624 (XP001216100), Aspergillus foetidus NRR337 (CAA04131), Aspergillus sydowi IAM2544 (CAB89083.1), Aspergillus niger B60 (L06844.1), Aspergillus niger ATCC 20611 (BAB67771.1), Aspergillus niger IBT10SB (AAC08047.1), Aspergillus oryzae GX0015 (ABY49829.1), Aspergillus fumigatus Af293 (XM744167), Aspergillus oryzae GX0010 (ABX55999.1), Aspergillus oryzae RIB 40 (XP001823245.1), Aspergillus niger CBS 51388 (ABB59679.1, ABB59678.1, ABB59680.1, XP001396571.1) correspondiente a las cepas utilizadas en el análisis del gen. La comparación fue realizada mediante las herramientas ClustalW2 y Bioedit 7.0.0. (Ibis Biosciences). La determinación del punto isoeléctrico, índice de hidropaticidad y número de aminoácidos, de las proteínas fue realizado con la herramienta ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). La identificación del péptido señal para las proteínas, se realizo usando la herramienta SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Los sitios potenciales de glicosilacion fueron 16
determinados para las enzimas a través de la herramienta NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) y NetOGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/). El arbol filogenético fue construido con el programa CLC sequence viewer versión 6.2 (CLC bio), empleando los parámetros estándar, con el fin de establecer posibles relaciones de parentesco entre las proteínas FTasas empleadas en el análisis. La predicción de las estructuras secundarias fueron realizadas usando la herramienta The PSIPRED Protein Structure Prediction Server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 6. Resultados y Discusión 6.1 Producción de Biomasa Se realizaron dos cultivos del hongo, dependiendo de los usos posteriores que la biomasa tendría. El primer cultivo produjo 1350 mg de biomasa total, que se utilizó para las primeras extracciones de ARN y ADN genómico. En el segundo cultivo se obtuvo 420 mg de biomasa y fue utilizado para la extracción de ARN. 6.2 Diseño de cebadores 6.2.1 Cebadores a partir de las secuencias de los genes ftasa El diseño de la primera pareja de cebadores se realizó mediante alineamiento múltiple entre las secuencias de los genes ftasa de Aspergillus oryzae de las cepas GX0015, GX0010 y RIB 40 las cuales mostraron tener entre ellas porcentajes de similaridad del 34%, 96% y 36%, respectivamente (Tabla 3). A partir del alineamiento se encontraron dos regiones que presentaban entre 15 y 20 nucleótidos conservados (Fig. 4), con esas regiones se diseñaron los cebadores degenerados F (delantero) y R (reverso) que amplifican una región de 375 a 381 pb dependiendo de la secuencia empleada (Tabla 4). Tabla 3. Valores porcentuales de símil arridad entre las secuencias de genes y proteínas empleadas para el diseño de las parejas de cebadores F‐R, 1‐3 y 1‐4 17
. Secuencia consenso 1 Secuencia consenso 2 Figura 4. Regiones conservadas y secuencias consenso empleadas para el diseño de los cebadores F‐R Los cebadores F y R estos fueron analizados con la herramienta Blastn para evaluar su especificidad, donde se encontró que reconocían las secuencia de fructosiltranferasas de Aspergillus flavus NRRL3357 y Aspergillus oryzae RIB 40 reportados en Genbank. Adicionalmente se realizó el análisis de porcentaje G‐C y temperatura de fusión (Tm) (Tabla 5), donde se encontró que ambos miembros de la pareja mostraron porcentajes de contenidos de G‐C iguales o por encima del 50%, por lo que los valores de Tm fueron elevados. Sin embargo, la diferencia entre las Tm de los dos cebadores fue inferior a 5oC, facilitando la reacción de PCR con estos cebadores (Ausubel F. et al. 1999) Tabla 4. Secuencias de las parejas de cebadores consenso y degenerados 1‐3, 1,4, F‐R obtenidas mediante alineamiento. K= G ó T, M= A ó C, S= G ó C, Y= C ó T. 18
6.2.2 Cebadores a partir de las secuencias de proteínas. Para el diseño de los cebadores deducidos a partir de proteínas se emplearon las secuencias de proteínas de las cepas de RIB 40, GX0015 y GX0010 de Aspergillus oryzae, las cuales mostraron tener porcentajes de similaridad de 32,4%, 99,4% y 32,6% (Tabla 3). El alineamiento realizado empleando estas secuencias mostró tres regiones conservadas (Fig. 5), las cuales fueron sometidas a traducción reversa empleando la tabla de uso preferencial de codones para Aspergillus oryzae. A partir de estas secuencias se diseñaron dos parejas de cebadores denominadas 1‐3 la cual amplifica un fragmento de 210 pb y 1‐4 que amplifica 249 A 297pb, donde 1 es el cebador delantero y 3 y 4 los reversos (Tabla 4). Secuencia consenso 1 Secuencia consenso 3 19
Secuencia consenso 4 Figura 5. Secuencias consenso de las proteínas FTasa de diferentes cepas de Aspergillus oryzae Para probar la especificidad de las parejas de cebadores 1‐3 y 1‐4, estos fueron analizados mediante la herramienta primer‐Blastn. Se encontró que al igual que la pareja F‐R, los cebadores 1‐3 reconocían secuencias de las cepas de Aspergillus oryzae RIB 40 y GX0010 asociadas a enzimas fructosiltransferasas., Adicionalmente también reconocen una secuencia ftasa presente en Aspergillus nidulans. De la misma manera, la pareja 1‐4 mostró reconocimiento por las secuencias de de Aspergillus oryzae RIB 40 y GX0010.Sin embargo, se encontró que esta pareja de cebadores reconoce secuencias ftasa presentes en Aspergillus clavatus y Aspergillus fumigatus, lo que sugiere que los cebadores son específicos para genes ftasa de especies de Aspergillus. El análisis de contenido G‐C % y Tm para las parejas 1‐3 y 1‐4 mostró que cada uno de los miembros de las parejas 1‐3 y 1‐4 tenían contenidos de G‐C superiores a 50% y que los correspondientes valores de Tm eran igualmente altos con respecto a los valores G‐C (Tabla 5). Al contrario de lo observado para la pareja 1‐4, la pareja 1‐3 mostró una diferencia entre las temperaturas de anillaje superior a 5oC, lo que implicaba que esta pareja podría presentar dificultades durante las reacciones de PCR. Tabla 5. Características generales de los cebadores diseñados a partir de secuencias de gen y proteína 20
6.3 Evaluación de los Cebadores Para evaluar el funcionamiento de las tres parejas de cebadores(1‐3, 1‐4 y F‐R), se realizó una PCR usando el ADN genómico extraído a partir de Aspergillus oryzae N74 (Fig. 6). Se encontró que la pareja F‐R amplificó un fragmento aproximado de de 400 pb y la pareja 1‐4 mostró un amplificado cercano a de 250 pb, como se había predicho previamente. Sin embargo no se evidenció ningún tipo de banda usando la pareja 1‐3; que puedo deberse a problemas de los cebadores durante la reacción de PCR, debido a la diferencia entre las temperaturas de fusión que se estimó por encima de 5oC. Para optimizar la reacción con estos cebadores se sugiere probar diferentes temperaturas de anillamiento, tiempos de elongación y concentraciones de magnesio. (McPherson M. et al. 1991) Figura 6. Electroforesis de los productos de PCR utilizando cebadores F‐R (A), 1‐3 (B) y 1‐4 (C).. D: corresponde a electroforesis del ADN genómico de Aspergillus oryzae N74. M corresponde al marcador de peso molécular de 500 a 1000pb 1Kb NEB. 6.4 Extracción de ARN Las primeras extracciones se realizaron usando el protocolo descrito para el reactivo Trizol (Invitrogen), bajo las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, no se logró extraer ARN de buena calidad ya que no fueron observadas las bandas correspondientes a las subunidades ribosomales 18S y 28S. Esto pudo deberse a que hongos filamentosos como Aspergillus tienen niveles altos de ARNasas endogenas las cuales producen la degradacion del ARN (Mukhtar et al 1998). Se evaluaron protocolos adicionales para la extracción de ARN de hongos como el descrito por Mukhtar et al. 1998, como alternativa para obtener un ARN de mejor calidad. Adicionalmente se evaluó el protocolo de purificación descrito por Cisar y Tebeest 1992, el cual fue usado para las muestras de ARN obtenidas empleando Trizol, pues los autores proponen que este paso de purificación es necesario en extracciones de ARN de hongos, permitiendo 21
aumentar la eficiencia de los procedimientos en los que este ARN vaya a ser utilizado (Cisar y Tebeest 1992) El protocolo de Mukhtar et al 1998 consiste en macerar el micelio en nitrógeno liquido, realizar una lisis con una solución tampón de LiCl 4M, Tris‐HCl 100 mM pH 8.0 y dodecilsulfato de sodio (SDS) 1% y finalmente realizar una purificación por extracción con cloroformo/fenol/isoamilalcohol y precipitación con LiCl 4M, El uso de este protocolo permitió obtener muy bajas concentraciones de ARN, el cual al ser analizado por electroforesis nativa y denaturante no mostró las bandas de las subunidades del ARN ribosomal. Como consecuencia se probó nuevamente el protocolo con reactivo Trizol pero utilizando la purificación descrita por Cisar y Tebeest 1992, la cual consiste en adicionar, a la muestra obtenida por Trizol, acetato de sodio 2M pH 4,9 y fenol/cloroformo/isoamilalcohol (25:24:1) para eliminar el remanente de proteínas y ácidos grasos. Posteriormente la muestra es precipitada dos veces con isopropanol y acetato de sodio 2M, pH 4. Sin embargo, al cabo de varios intentos no fue posible obtener ARN de buena calidad, pues en las electroforesis se observó un producto degradado. Finalmente se utilizó el protocolo de de Trizol pero empleando biomasa fresca con el fin de evitar que el ARN estuviera expuesto durante mucho tiempo a ARNasas, a partir de este procedimiento fue posible obtener un ARN en la cantidad y calidad necesaria para la realización de la síntesis de ADNc (Fig. 7). Figura 7. Electroforesis de ARN en condiciones no reductoras (A) y reductoras (B), usando biomasa fresca. 28s y 18s corresponden a las subunidades ribosomales. Como se muestra en la Figura 6, las electroforesis de ARN en condiciones reductoras y no reductoras, muestra la presencia de las subunidadades ribosomales mayor (28s) y menor (18s), como parámetro para evaluar la estabilidad del ARN después de la extracción. Se obtuvieron absorbancias de 0,311/0,230 a 260/280nm y una relación de 1,351 (260/280), que equivalen a una concentración de ARN de 1368 μg/ml. A pesar que la relación 260/280 es baja y que en la 22
electroforesis se observó degradación del ARN, como se discutirá mas adelante este permitió la síntesis de ADNc. Este resultado sugiere que el ARN pierde su forma nativa y es degradado por ARNasas en muestras de biomasa almacenadas por largos periodos, debido al mayor tiempo de exposición a estas enzimas (Chirgwin J. et al. 1979). 6.5 Síntesis de ADNc de primera y Segunda cadena Para la síntesis de ADNc se utilizo ARN extraído en el paso anterior (Fig. 7). Las reacciones de RT‐PCR realizadas se emplearon para evaluar la presencia del transcrito del gen ftasa en las muestra de ARN empleado. Para evaluar la reacción de RT‐PCR y confirmar la síntesis de ADNc y de segunda cadena se realizaron 3 reacciones de PCR (Fig.8), de las cuales dos eran con las parejas de cebadores F‐R y 1‐4 usando la muestra de ADNc (Fig. 8 B,C), y una con los cebadores F‐R usando la muestra de segunda cadena (Fig. 8A). Se encontró que las parejas F‐R y 1‐4 presentaban bandas de 375 pb y 237pb respectivamente, las cuales tenían el tamaño esperado correspondiente al fragmento de ADNc asociado al gen ftasa. De igual forma se evidenció una banda de 375pb para los cebadores F‐R usando la muestra de segunda cadena, demostrando de esta manera que tanto la reacción de síntesis de de ADNc como de segunda cadena fue realizada adecuadamente y que la secuencia del gen ftasa estaba presente en ambos productos de reacción. Figura 8. Electroforesis de los productos de PCR de ADNc y segunda cadena usando los cebadores F‐R (A,B) y 1‐4 (C). M corresponde al marcador molecular φX174 HaeIII GibCoBRL . Sin embargo, como se observa en la figura 8, la banda obtenida utilizando la segunda cadena presentó una mayor intensidad que la obtenida empleando el producto de reacción de la síntesis de la primera cadena. Este resultado puede estar asociado a que el número de copias sintetizadas durante la reacción de PCR con la muestra de cDNA de primera cadena es menor 23
que con el cDNA de segunda cadena, ya que este último a diferencia del ADNc esta conformado por dos hebras de ADN que permiten obtener mas copias durante la reacción. 6.6 Librería de ADNc Una vez sintetizada la segunda cadena de ADNc, se intentó realizar la clonación del gen ftasa mediante la elaboración de una librería de ADNc. Para esto se utilizó como vector de clonación el plasmído pUC13 (Fig. 3) el cual fue previamente tratado con RNAasa y purificado con fenol/cloroformo/isoamilacohol (25:25:1). El plásmido se cuantificó y se obtuvo en una concentración de 1348 μg/ml (Fig. 9A). El plásmido fue digerido con la enzima de restricción SmaI con la que se obtuvo una banda de 2680 pb, correspondiente al ADN plasmídico linealizado (Fig. 9B). La banda fue extraída desde el gel y el ADN recuperado fue cuantificado obteniéndose una concentración de 224 μg/ml. La recuperación del plásmido a partir del gel de agarosa fue confirmada con una segunda electroforesis, la cual mostró que la recuperación realizada inicialmente fue adecuada (Fig. 10). Figura 9. Tratamiento y purificación de pUC13 con RNAasa y Fenol/cloroformo/isoamilalcohol (A) Digestión de pUC13 con SmaI (B) Figura 10. Electroforesis confirmatoria de pUC13 después de ser recuperado a partir de gel de agarosa. 24
Con el plásmido purificado se llevó a cabo la reacción de ligación usando como inserto la segunda cadena evaluada en la reacción de síntesis previa (Fig. 8A), Para el proceso de transformación fueron probadas las cepas E. coli XL‐Gold, DH5α y JM‐109. Sin embargo, al cabo de varios intentos no se obtuvo transformación usando estas cepas, debido a que las bacterias no crecieron en el agar, y aquellas que lo hicieron no presentaban características morfológicas y de separación optimas. El análisis del ADN plasmídico extraído de estas colonias mostró que ninguna bacteria tenía el plásmido y que posiblemente se trataba de bacterias que generaron resistencia a la ampicilina del medio, posiblemente por contaminación de las soluciones de trabajo durante el proceso de elaboración de células competentes. Adicionalmente se observó que las bacterias crecieron en las cajas de petri usadas para los controles positivos y negativos de la transformación. La elaboración de la librería de ADNc mostró pocos rendimientos, por esta razón se estableció una estrategia alternativa para la clonación del gen ftasa basada en la técnica PCR. 6.7 Clonación del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 Debido a los problemas observados durante la producción de la librería de ADNc para clonar el gen ftasa de Aspergillus oryzae N74, se diseñó una estrategia pare el clonación del gen ftasa empleando una pareja de cebadores capaces de amplificar la secuencia total del gen mediante PCR. Debido a la alta variación observada en las regiones 5’ y 3’ de las secuencias de ftasa reportadas para cepas de Aspergillus oryzae, se realizó un análisis de restricción del fragmento de PCR de Aspergillus oryzae N74 obtenido con los cebadores F‐R y se comparó los predichos para las secuencias ftasa de las cepas de Aspergillus oryzae GX0015 (EU181219), RIB 40 (XM_001823193) y GX0010 (EU142022), con el objetivo de seleccionar la secuencia para el diseño de los cebadores de clonación. Como se observa en la Figura 11, la reacción in silico de PCR para la secuencia de la cepa RIB40, produjo un fragmento de 393 pb el cual fue digerido únicamente con la enzima HindIII, el fragmento de GX0010 fue de 399 pb y mostró ser digerido por las enzimas EcoRI y SmaI, a diferencia de las secuencias RIB 40 y GX0010, la secuencia GX0015 no presento digestión alguna con las enzimas empleadas en el análisis. Los resultados obtenidos luego de la digestión mostraron que el fragmento de 375pb no fue digerido con ninguna de las enzimas empleadas (Fig. 12), lo que sugiere que la secuencia del 25
gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 podría tener un alto grado de similaridad con el de Aspergillus oryzae GX0015 y los cebadores para amplificar el gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 podrían ser diseñados usando la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae GX0015. Para el diseño de los cebadores para la clonación del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 se tomaron los primeros 20 nucleótidos correspondientes a los extremos 5´ y 3´ de la secuencia Aspergillus oryzae GX0015 (EU181219). Con el objetivo de facilitar los pasos adicionales de clonación, se agregó en cada cebador la secuencia de reconocimiento para la enzima EcoRI y una secuencia aleatoria que permitiera el corte de la enzima, esta ultima secuencia es necesaria ya que la enzima EcoRI por ser una endonucleasa sólo puede cortar al interior y no en los extremos de una secuencias (Hartwell Leland 2004). El cebador delantero de la pareja fue nominado Ftasa‐F y el reverso Ftasa‐R (Tabla 6) Figura 11. Perfil de restriccion de los fragmentos de PCR obtenidos usando los cebadores F‐R para cada una de las secuencias de genes ftasa de las cepas de Aspergillus oryzae RIB 40, GX0015 y GX0010. 26
Figura 12. Electroforesis de la digestión realizada a los fragmentos de PCR. A: SmaI, B: HindIII, C: EcoRI, D: Control PCR de DNA genómico usando los cebadores F‐R, M: marcador de peso molecular λ HindIII NEB Tabla 6. Secuencias de los cebadores Ftasa‐F y Ftasa‐R. En letra itálica: Primeros 20 nucleótidos de los extremos 5´ y 3´, En minúscula y con negrita: Secuencia de reconocimiento para la enzima EcoRI, Subrayada: Secuencia aleatoria. 6.8 Evaluación de los cebadores de clonación Para evaluar los cebadores de clonación (Ftasa‐F y Ftasa‐R) se realizaron PCRs con el ADN genómico de Aspergillus oryzae N74 y con los productos de reacción de la síntesis de primera y segunda cadena de ADNc. Figura 13. Electroforesis de los productos de PCR usando los cebadores Ftasa con ADN genomico (A), ADNc de primera cadena (C) y ADNc de segunda cadena (D). Como control de reacción de síntesis de primera cadena de ADNc se emplearon los cebadores F‐R (B). M: marcador de peso molecular λ HindIII NEB Como se observa en la figura 13 los cebadores Ftasa amplificaron un fragmento de aproximadamente 1,6 kb usando la muestras de ADN genómico, ADNc de primera cadena y el ADNc de segunda cadena. Este resultado sugirió que el gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 podría tener un tamaño y secuencia similar al de Aspergillus oryzae GX0015 debido al tamaño 27
observado del producto de PCR y a los resultados derivados del perfil de restricción mostrados en la figura 12. Adicionalmente se probó que la reacción de síntesis de ADNc y segunda cadena fue adecuada ya que el control de la reacción usado empleando los cebadores F‐R mostró el producto de 375 pb esperado. Para asegurar que el fragmento de PCR amplificado usando los cebadores Ftasa correspondía al gen ftasa se realizaron dos análisis. El primer análisis consistió en la purificación del fragmento de 1,6 kb desde el gel de agarosa y posterior PCR usando los cebadores F‐R. Como se observa en la figura 14 se obtuvo una banda con un tamaño esperado de 375 pb lo que sugiere que el producto de PCR obtenido con los cebadores Ftasa puede corresponder al gen ftasa de Aspergillus oryzae N74. Figura 14. Electroforesis del producto de PCR realizada usando los cebadores F‐R y el fragmento de 1,6 kb obtenido con los cebadores Ftasa. M: marcador de peso molecular λ HindIII NEB Con el objetivo de corroborar el resultado anterior, se realizó un análisis de digestión del producto de PCR. Para esto, la secuencia del gen gen ftasa de la cepa Aspergillus oryzae GX0015 fue digerida computacionalmente con las enzimas HindIII, SmaI, MluI y EcoRI (Fig.15). 28
Figura 15. Perfil de restricción del gen ftasa de Aspergillus oryzae GX0015 usando las enzimas EcoRI, HindIII, MluI Y SmaI El perfil de restricción mostró que la secuencia de Aspergillus oryzae GX0015 es digerida por las enzimas EcoRI y MluI, pero no por las enzimas SmaI y HindIII. Con base en estos resultados, se realizó la digestión de los productos previamente obtenidos de PCR con los cebadores Ftasa con ADNc de segunda cadena y ADN genómico (Fig.13 A, D). Se encontró que al igual que la secuencia de Aspergillus oryzae GX0015, el fragmento de PCR correspondiente al ADN genómico fue digerido por las enzimas EcoRI y HindIII (Fig. 16 carriles 1, 7). Sin embargo, no se observo digestión con el producto de PCR correspondiente al ADNc de segunda cadena, lo que pudo deberse a la concentración de la muestra de ADNc de segunda cadena (B) usada en las digestiones la cual fue inferior a la del producto de PCR obtenido a partir de ADN genómico, impidiendo su detección en la electroforesis (Figura 15 carril B). 29
Figura 16. Electroforesis de las digestiones realizadas a los productos de PCR de ADNc de segunda cadena y ADN genómico obtenidos con los cebadores Ftasa. A: Control sin digestión del producto de PCR con ADN genómico, B: Control sin digestión del producto de PCR con ADNc de segunda cadena. Carriles 1,3,5,7 corresponden a digestiones del producto de PCR de ADN genómico con las enzimas EcoRI, HindIII, SmaI y MluI respectivamente. Carriles 2,4,6,8 corresponden a digestiones del producto de PCR de ADNc de segunda cadena con las enzimas EcoRI, HindIII, SmaI y MluI respectivamente. 6.9 Análisis del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 La secuencia correspondiente al fragmento de PCR de ADN genómico obtenida luego de la secuenciación, mostró un tamaño de 1630 pb igual al reportado para la cepa Aspergillus oryzae GX0015 (Fig. 17). Se encontró un intron de 52 nucleótidos ubicado entre las posiciones 172 y 223. El análisis de similaridad comparando la secuencia de Aspergillus oryzae N74 con las secuencias de Aspergillus oryzae GX0015, GX0010 y RIB 40, mostró porcentajes del 99, 12 y 99, respectivamente. Estos resultados mostraran que la secuencia de Aspergillus oryzae N74 es diferente de las tres secuencias usadas reportadas para el gen ftasa en otras cepas de Aspergillus oryzae. Con el objetivo de reconocer las diferencias puntuales entre la secuencia de Aspergillus oryzae N74 con las secuencias de las cepas de Aspergillus oryzae GX0015 y RIB 40 (con las que mostró similaridades del 99%) se identificaron los nucleótidos diferentes y los efectos de estos sobre la proteína FTasa. El análisis fue realizado empleando la secuencia correspondiente al ADNc de segunda cadena (Fig.17) En este análisis se encontró que la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 presentó con respecto a la secuencia RIB 40 siete sustituciones nucleotidicas, donde cinco de ellas corresponden a mutaciones silenciosas en los sitios c.45A>G, c.346T>C, c.653A>G, c.886T>C y 1546T>A. Adicionalmente se encontraron dos sustituciones en las posiciones c.861 T>C y c.719 C>T correspondientes a mutaciones de cambio de sentido (Fig. 17). De la misma forma se comparó la secuencia de Aspergillus oryzae N74 contra la secuencia de Aspergillus oryzae GX0015, encontrándose tres mutaciones silenciosas en las posiciones c.733A>C, c.817C>T, c.1432C>T y una mutación de cambio de sentido en la posición c.516A>T (Fig. 17). Dos sustituciones exclusivas de la secuencia ftasa de Aspergillus oryzae N74, en comparación con las secuencias de las cepas GX0015 y RIB40 fueron reconocidas en las posiciones c.430 A>T y c.949 T>C, los que correspondieron a mutaciones silenciosas (Fig. 17) La secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 fue comparada contra las secuencias reportadas para Aspergillus terreus NIH2624, Aspergillus foetidus NRRL 337, Aspergillus sydowi IAM2544, Aspergillus fumigatus AF293 y Aspergillus níger B60, IBT10SB CBS 513.88. Se encontró que la 30
secuencia ftasa de Aspergillus oryzae N74 mostró porcentajes de similaridad de 1, 12, 2, 68 y 1 a 7, respectivamente, lo que significa que hay una gran variedad entre las secuencias de los genes ftasa de especies de Aspergillus y no es posible hacer ningún tipo de deducciones filogenéticas. En conjunto estos resultados sugieren que las secuencias se han mantenido conservadas entre las cepas de Aspergillus oryzae GX0015, RIB 40 y N74. Sin embargo, esto no se observó con la cepa de Aspergillus oryzae GX0010 la cual mostró ser similar en un 97 % a la secuencia de Aspergillus foetidus NRRL 337. Así los resultados proponen que las secuencias GX0015, RIB 40 y N74 se han mantenido conservadas atravez del tiempo y ha diferencia de esto la secuencia de la cepa Aspergillus oryzae GX0010 ha sido divergente, manteniendo un mayor grado de conservación con la cepa Aspergillus foetidus, sugiriendo que posiblemente tanto la cepa A. oryzae GX0010 como la cepa A. foetidus NRRL 337, hayan sido aisladas de ambientes muy similres y por lo tanto hayan estado sometidas a presiones de selección natural similares lo que permitió mantener las secuencias ftasa conservadas entre si. Finalmente, las secuencias de ADN genómico y ADNc de segunda cadena correspondientes al gen ftasa de A. oryzae N74 fueron sometidas a la base de datos GenBank bajo los números de acceso GU1434136 y GU145137 31
Figura 17. Secuencia del gen ftasa y de la enzima predicha fructosiltransferesa de Aspergillus oryzae N74. En color amarillo se muestran las mutaciones de Aspergillus oryzae N74 con respecto a la secuencia de Aspergillus oryzae RIB 40, en minúscula aquellas de tipo silenciosa, en mayúscula y resaltadas las mutaciones de cambio de sentido. En color gris se muestran las mutaciones de Aspergillus oryzae N74 con respecto a la secuencia de Aspergillus oryzae GX0015, en minúscula aquellas de tipo silenciosa, en mayúscula y con negrita de tipo cambio de sentido. En color rojo y con negrita se muestran las mutaciones de tipo silenciosa únicas en la secuencia de Aspergillus oyzae N74 con respecto a las cepas RIB 40 y GX0015. El recuadro rojo representa el péptido señal de la proteína FTasa, mientras que la secuencia en cursiva y subrayada corresponde al sitio activo de la proteína. 32
6.10 Análisis de la proteína FTasa de Aspergillus oryzae N74 A partir de la secuencia del ADNc de segunda cadena de Aspergillus oryzae N74 se predijo la secuencia de la proteína FTasa (Fig. 17). Se encontró que la proteína esta compuesta por 525 aminoácidos, un punto isoeléctrico de 4,83 y un índice de hidropaticidad de ‐0,292. Adicionalmente la proteína presenta 6 puntos potenciales de N‐glicosilación y un péptido señal de 17 aminoácidos, el cual es removido por la enzima peptidiltransferasa entre los residuos AQA‐AS (Tabla 7, Fig. 17). Como se menciono anteriormente, la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 presenta 2 mutaciones de cambio de sentido con respecto a la secuencia a la secuencia RIB 40, se encontró que los aminoácidos sustituidos se encuentran en las posiciones p.L223F y p.V270A. Con respecto a la mutación de cambio de sentido con la secuencia FTasa de la cepa GX0015 la sustitución ocurrió en p.N155I. El análisis de similaridad comparando la secuencia de Aspergillus oryzae N74 con las secuencias de Aspergillus oryzae GX0015, GX0010 y RIB 40, mostró porcentajes del 99, 36 y 99 respectivamente. Estos resultados muestran el alto grado de conservación de la secuencia entre las cepas Aspergillus oryzae RIB 40, GX0015 y N74 soportando así los resultados obtenidos en el análisis con la secuencia del gen. Como se observó en los análisis del gen, la secuencia de la cepa GX0010 no presentó valores altos de similaridad con respecto a las cepas GX0015, RIB 40 y N74. A diferencia de esto se evidenció que la cepa GX0010 es 100% similar a la secuencia de Aspergillus foetidus NRRL 337. El análisis indicó que la secuencia FTasa de Aspergillus oryzae N74 presenta valores de similitud del 13%, 34%, 14%, 69% y 11‐15% con respecto a las secuencias reportadas para esta enzima en cepas de Aspergillus terreus NIH2624, Aspergillus foetidus NRRL 337, Aspergillus sydowi IAM2544, Aspergillus fumigatus AF293 y Aspergillus níger B60, IBT10SB y CBS 513.88, respectivamente. Los análisis realizados para determinar las constantes físicas y moleculares de las secuencias FTasa, mostraron que las secuencias de las cepas RIB 40, GX0015 y N74 presentan las mismas características. Sin embargo el índice de hidropaticidad entre las tres secuencias fue diferente (Tabla 7), lo que se puede deber a las variaciones en los aminoácidos descritas anteriormente, las cuales afectan las condiciones de solubilidad de las proteínas. Como se observa en la Tabla 33
7, con respecto a las cepa A. oryzae N74 y A. oryzae RIB 40 la que mas alto índice de hidropaticidad presento fue GX0015 (‐0,285), este resultado sugiere que esta proteína es mas hidrofílica que la de A. oryzae N74 ya que la medida de hidropaticidad GRAVY (Grand Average of Hydropathy) esta dada en valores positivos para proteínas hidrofóbicas (Kyte et. al 1982). Este resultado también muestra que el cambio de una asparagina (N) por una isoleucina (I) en la secuencia FTasa de Aspergillus oryzae N74 puede tener un efecto sobre la solubilidad de la proteína o afectar considerablemente su estructura secundaria y terciaria. Por otro lado la secuencia RIB 40 mostró tener un índice de hidropaticidad mas bajo con respecto a la secuencias de la cepa A. oryzae N74 (Tabla 7), lo que sugiere que la secuencia FTasa de A. oryzae N74 es mas hidrofílica que la secuencia de A. oryzae RIB 40 y que por lo tanto la actividad de esta proteina esta restringida a medios acuosos. Esto se debe a las dos sustituciones de aminoácidos presentes en la enzima de la cepa A. oryzae N74. Aunque ambos aminoácidos leucina (L) (presente en RIB 40) y fenilananina (F) (presente en N74) sean hidrofóbicos, en la escala de hidropaticidad propuesta por Kyte et al. 1982, la leucina presenta valores mas altos de hidrofóbicidad que fenilalanina. Esto mismo ocurre con el aminoácido valina (V) el cual fue sustituido en la secuencia de la cepa A. oryzae N74 por alanina (A). Tabla 7. Constantes físicas y moleculares de las secuencias FTasas empleadas en el análisis. Convenciones: 1. A. terreus NIH2624, 2. A. foetidus NRRL 337, 3. A. sydowi IAM2544, 5. A. niger B60, 7. A. niger ATCC 20611, 9. A. niger IBT10SB, 10. A. oryzae GX0015, 11. A. fumigatus Af293, 12. A. oryzae GX0010, 13. A. oryzae RIB 40, 15. A. oryzae N74, 4‐6‐8‐14 A. niger CBS 51388. Cuando la secuencias de la proteína FTasa de A. oryzae N74 fue comparada con secuencia de la cepa A. oryzae GX0010, se encontró que esta última presenta características tanto físicas como 34
moleculares diferentes a la secuencia de A. oryzae N74 (Tabla 7). Adicionalmente se encontró que todos los parámetros evaluados fueron idénticos entre la secuencia FTasa de Aspergillus oryzae GX0010 y la secuencias de Aspergillus foetidus NRRL 337 (Tabla 7). Estos resultados sugieren que las proteínas de la cepa A. oryzae GX0010 y A. foetius NRRL 337 podrian ser homologas y que por ende ambas cepas pudieron ser aisladas de ambientes similares. La secuencia FTasa de Aspergillus oryzae N74 fue también comparada contra las secuencias de Aspergillus terreus NIH2624, Aspergillus sydowi IAM2544, Aspergillus fumigatus Af293 y Aspergillus niger ATCC 20611, B60 IBT10SB y CBS 51388. Se observó que los valores de pI e índice de hidropaticidad fueron variados, esto se debe a las diferencias en el número y la composición de aminoácidos de cada proteína. Adicionalmente se encontró que las secuencias de las proteínas FTasa 4, 8 y 14, correspondientes a la cepa Aspergillus niger CBS 5138.8 carecen de péptido señal y de glicosilaciones, lo que coincide con lo reportado por Xiao L. et al. 2006 quienes sugieren que tanto la proteína 4 como la 8 son de tipo intracelular. En el caso de la secuencia 14, esta es una proteína hipotética obtenida de la secuenciación del genoma de Aspergillus oryzae CBS51388 (Pel H. et al. 2007) y a la fecha no existe ninguna descripción acerca de esta secuencia. Sin embargo, en este trabajo se sugiere que la proteína 14 debería ser de tipo intracelular por carecer de péptido señal y por la tanto de glicosilaciones. Con el objetivo de sugerir y analizar posibles relaciones de parentesco entre las secuencias FTasa empleadas se construyo un fenograma. Este análisis permitió establecer grupos taxonómicos basados en las relaciones de parentesco entre las secuencia (Fig. 18). Figura 18. Fenograma de las secuencias FTasa agrupadas por parentesco. Casillas roja y negra corresponden a grupos monofiléticos, Casillas amarilla, gris y azul grupos parafiléticos 35
El análisis usando el Fenograma mostró que las secuencias del las cepas A. oryzae GX0015, RIB 40 y N74 podrían establecer un grupo parafilético (casilla amarilla), y que así mismo la secuencias de A. oryzae GX0015 y N74 podrían pertenecen a un grupo monofilético. Adicionalmente se encontró que de estas secuencias, la mas distante de todas y que por ende podría ser la mas ancestral es la de A. oryzae RIB 40 y la más reciente la de A. oryzae GX0015, lo que se puede sugerir con base en los valores de distancia basados en la divergencia producida por el número de cambios o modificaciones entre las secuencias comparadas. La secuencia que se localizó mas cercana al grupo de las secuencias de Aspergillus oryzae fue la correspondiente a Aspergillus fumigatus Af293. Sin embargo, esta no fue incluida dentro del grupo de las secuencias de Aspergillus oryzae por presentar mas de dos posibles ancestros comunes. En el análisis fueron sugeridos adicionalmente dos grupos parafiléticos, el primero reunió las secuencias de las cepas de A. niger B60, IBT10SB y CBS 51388 (numero 6) (Casilla gris), el segundo grupo reunió las secuencias 14, 4 y 8 de la cepa de Aspergillus niger CBS 51388 (casilla azul). Este último grupo mostró contener las secuencias que posiblemente sean las mas recientes de todas las secuencias de Aspergillus niger, ya que las secuencias 14, 4 y 8 de CBS 51388 mostraron valores de divergencia superiores a los observados con las secuencias de A. niger B60, IBT10SB y CBS 51388 (numero 6). Finalmente, dos grupos monofiléticos fueron sugeridos en el primero se agrupan las secuencias Aspergillus terreus 2544 y de Aspergillus sydowi IAM 2544 (casilla roja), siendo esta última posiblemente la más reciente. El segundo grupo estuvo conformado por las secuencias de Aspergillus oryzae GX0010 y Aspergillus foetidus NRRL 337 las cuales no mostraron tener valores de divergencia entre ellas, lo cual coincide con los resultados de similaridad de las secuencias del gen y la proteína, así como también con los resultados de los análisis de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas de estas dos cepas. Finalmente de las secuencias empleadas en el análisis posiblemente la mas ancestral de todas es la cepa Aspergillus terreus ATCC 206111, ya que no fue agrupada con ninguna otra secuencia, adicionalmente mostró el menor valor de divergencia desde la raíz del árbol. 6.11 Relación Estructura Actividad Con base a las secuencias de las proteínas FTasa y a los estudios enzimáticos reportados para cada secuencia, se hizo un análisis para relacionar las estructuras y propiedades fisicoquímicas de las proteínas y su implicación en la actividad catalítica. Para esto se realizó un alineamiento con las proteínas FTasa, de donde fueron reconocidas doce regiones conservadas (Fig. 19). A 36
partir del análisis usando la herramienta ScanProsite (http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/), se encontró que la región 1 corresponde al sitio activo de la proteína por estar asociada al patrón consenso del sitio activo para la familia GH32, la cual esta compuesta por invertasas, levanasas, inulinasas y fructosiltransferasas (Xiao Y. et al. 2006). 37
Figura 19. Regiones conservadas entre las secuencias FTasa deducidas a partir de un alineamiento. Convenciones: Asterisco (*): aminoácidos idénticos, Dos puntos (:) similaridad conservada, un punto (.) Similaridad semiconservada La secuencia patrón de esta familia según Henrissat B (1991) es H‐x(2)‐[PV]‐x(4)‐[LIVMA]‐N‐D‐
P‐N‐[GA]. Con base en esto, se encontró que las secuencias 4, 14 y 8 de A. niger CBS 533.88 no presentaron prolina o valina en la cuarta posición correspondiente al patrón [PV], a diferencia de esto se identificó una alanina en esta posición (Fig.19 región 1). Adicionalmente se encontró que la secuencia 9 correspondiente a A. niger IBT10SB no presentó ninguno de los posibles aminoácidos con respecto a la posición nueve del patrón ([LIVMA]). Por el contrario, se identificó para esta posición una serina (S). Las secuencias de A. terreus NIH2624, A. Sydowi IAM 2544, A. niger B60, A. niger CBS51388 (6) y A. niger ATCC20611 no presentaron una asparigina en la posición 10 del sitio activo consenso, encontrándose para estas cepas hay una glicina en esa posición. La cepa A. niger IBT10SB difiere de la secuencia patrón en las posiciones diez (N) y once (D) ya que fueron observados una valina y una isoleucina esas posiciones. Cuando fue evaluada la posición 13 (N) de la secuencia patrón, se encontró que las cepas A. terreus NIH2624, A. sydowi IAM 2544, A. niger B60, A. niger CBS51388 (6, 14, 8, 4), y A. niger ATCC20611 presentan una cisteína en vez de una asparagina en esa posición. Finalmente, la secuencia patrón para el sitio activo muestra que en la posición 14 debería haber o una glicina (G) o una alanina (A), sin embargo, las secuencias de A. niger CBS51388 y B60 mostraron para esta posición una leucina, y la secuencia A. niger IBT10SB una cisteína (Fig.19 región 1). En conjunto estos resultados sugieren que la secuencia consenso para el sitio activo de las fructosiltransferasa podría ser ajustada de la siguiente manera: H‐x(2)‐[PA]‐x(4)‐ [MIS]‐ [NGV]‐ [DI]‐P‐[NCA]‐ [GACL]. De igual manera este resultado mostró la secuencia correspondiente al sitio activo para las enzimas de la familia GH32 puede ser más diversa que lo propuesto por Henrissat B 1991. Xiao Y. et al 2006 identifico 8 dominios altamente conservados entre las proteínas de la familia GH32. Sin embargo, después del análisis del alineamiento de las proteínas FTasa solo 3 de esos dominios fueron identificados los cuales corresponden a las regiones 1, 7, 9 (Fig. 19). Se observó que cada una de estas regiones tiene un aminoácido de tipo acido conservado (D, D y E respectivamente), los cuales según Xiao Y. et al 2006 son capaces de interactuar con el 38
sitio activo y debido a su función relevante en la actividad catalítica se han mantenido conservados en todas las proteínas de la familia GH32. Adicionalmente se observó para las demás regiones que existe un alto grado de conservación entre las diferentes cepas, ya que cada región esta constituida por aminoácidos que se mantienen conservados, algunos que son similares y otros con similaridades semiconservadas. Aunque no existen reportes acerca de la actividad específica de cada región y el posible papel que estas desempeñen en la actividad de la enzima, se sugiere que estas regiones deben estar relacionadas en la conformación y equilibrio de la estructura terciaria de la enzima, debido al grado de conservación que estas presentan en las secuencias. Con el fin de establecer una posible explicación a la función que estas regiones desempeñan en la proteína y la relación con los valores de actividad enzimática reportados (Tabla 8), se realizó la predicción de las estructuras secundarias para cada una de estas regiones (Fig. 20) Tabla 8. Características enzimáticas de las secuencias FTasas empleadas en el análisis. Convenciones: 1. A. terreus NIH2624, 2. A. foetidus NRRL 337, 3. A. sydowi IAM2544, 5. A. niger B60, 7. A. niger ATCC 20611, 9. A. niger IBT10SB, 10. A. oryzae GX0015, 11. A. fumigatus Af293, 12. A. oryzae GX0010, 13. A. oryzae RIB 40, 15. A. oryzae N74, 4‐6‐8‐14 A. niger CBS 51388. Como observa en la figura 20, el sitio activo de la proteína corresponde a un pliegue seguido de un giro. Sin embargo. Las secuencias de las cepas A. terreus NIH2624 y A. fumigatus Af23 presentaron un pliegue pequeño adicional. La región 2 esta compuesta por un pliegue prolongado presente en todas las secuencias analizadas. La región 3 esta compuesta por un pliegue y un giro, sin embargo a diferencia de las de otras secuencias, la de A. niger ATCC 26241 mostró dos pliegues separados por giros, posiblemente esto se deba a los residuos de alanina (A), glicina (G) y aspartato (N) exclusivos de esta secuencia. La región 4 muestra una gran diversidad de estructuras secundarias, aunque en todas se observo la presencia de pliegues. Cuando se analizaron las estructuras secundarias en las regiones 5, 6, 7, 9 y 11, se identificaron pliegues que eran seguidos de giros. Se observó también que estas estructuras son constantes entre las secuencias. Sin embargo, algunas de ellas varían con respecto a las demás a pesar de tener secuencias idénticas. Estos resultados sugieren que para dar una 39
interpretación mas precisa de la relación entre las estructuras secundarias y la actividad de cada enzima, es necesario un análisis a partir de la estructura terciaria, con el fin de identificar la disposición y la función de cada una de estas estructuras dentro de la enzima. Cuando se observo la región 8 se encontró que hubo una predicción de 3 pliegues, 4 giros cortos y una hélice para la secuencia de Aspergillus foetidus NRRL 337. Sin embargo, esta no fue identificada en la secuencia de A. oryzae GX0010 la cual mostró los mismos aminoácidos para esta región. Finalmente, cuando se observa la región 10 las secuencias de Aspergillus oryzae N74 y GX0015 a parte de mostrar un giro y un pliegue también mostraron una hélice, patrón que no fue observado en la secuencia de la cepa RIB 40 a pesar de poseer los mismos aminoácidos para esta región. Estas variaciones en la predicción de la estructura secundaria a pesar de tener secuencias de aminoácidos idénticas pueden ser corregidas mediante la predicción de la estructura secundaria empleando diferentes programas y construyendo una predicción consenso. Debido a la amplia variedad de patrones estructurales que presentaron las secuencias resulto difícil hacer alguna inferencia que relacionara los valores enzimáticos mostrados en la Tabla 8 con respecto a las estructuras secundarias de las proteínas. Por esta razón se sugiere hacer la predicción y el análisis de la estructura terciaria para modelar la relación de la proteína con el sustrato y entender en conjunto la dinámica catalítica. Aunque no se pudo establecer una relación estructura‐actividad entre las proteínas, con base al análisis de similaridad obtenido mediante el alineamiento previo con ClustalW2 para las proteínas, se sugiere que la enzima FTasa de la cepa A. oryzae GX0010 presenta valores de actividad enzimática iguales a los reportados para A. foetidus NRRL 337 (Tabla 8). Como se observa en la tabla 8 las secuencias de las cepas A. foetidus NRRL 337. A. sydowi IAM2544, A. niger B60, A. niger ATCC 20611,y A. niger CBS 51388.(4,6) muestran valores enzimáticos diferentes con respecto a A. oryzae N74, estas variaciones pueden estar relacionadas a la amplia diferencia en cuanto a tamaño y composición de aminoácidos observados entre las secuencias de la enzimas FTasa, que posiblemente estén determinando la estructura terciaria. Finalmente no existe un reporte completo donde se describa la actividad enzimatica de las secuencias de A. oryzae GX0010 y RIB 40., Sin embargo los resultados que se obtuvieron durante la comparación de estas secuencias solo permiten sugerir que las diferencias en los 40
rendimientos de síntesis entre la cepa de A. oryzae GX0010 y N74 puedan deberse a la sustitución del aminoácido aspartato por isoleucina (Fig. 17). 41
Figura 20. Predicción de la Estructura secundaria de las regiones consenso mostradas en la figura 14. Convenciones: Línea: giro, Flecha: pliegue, Cilindro: Hélice. Por otro lado aunque la secuencia de la cepa A. oryzae RIB 40 no posee datos de actividad enzimática, esta mostró un porcentaje alto de similaridad con respecto a la cepa N74 lo que permite sugerir que sus valores de actividad y rendimientos de producción de FOS podrían ser similares a los de A. oryzae N74. 42
7. CONLUSIONES •
Se diseñaron cebadores capaces de amplificar de manera parcial y completa el gen ftasa que podrían ser empleados como herramientas para la clonación de genes similares. •
La secuencia del gen ftasa de A. oryzae N74 presenta un tamaño de 1630 pb y un intron de 52 nucleótidos. El gen ftasa mostró similaridades del 99% con respecto a las secuencias de las cepas A. oryzae GX0015 y RIB 40 y simlaridades entre 1 y 12% con las secuencias de las demás cepas de Aspergillus. •
EL gen ftasa de A. oryzae N74 codifica para una enzima de 525 aminoácidos, tiene un pI de 4.83, un índice de hidropaticidad de ‐0.292, una secuencia péptido señal de 18 aminoácidos y 6 puntos diferentes de glicosilacion que sugieren que la enzima es de tipo extracelular. •
La enzima FTasa de A. oryzae N74 mostró similaridades del 99% con respecto a las enzimas de A. oryzae GX0015 y RIB 40, y del 12 al 68% con las demás cepas de Aspergillus. La Estructura secundaria de la proteína, mostró estar compuestas por múltiples giros, pliegues y hélices. •
El Fenograma mostró que las secuencias de la enzima FTasa son muy diversa entre las diferentes cepas de Aspergillus. Sin embargo, las secuencias de las cepas A. oryzae GX0015 y N74 establecieron un grupo monofilético que sugiere que estas proteínas pueden ser homologas 43
8. RECOMENDACIONES •
Estandarizar las condiciones de reacción para los cebadores 1‐3 probando diferentes temperaturas de anillamiento, concentraciones de MgCl y Tiempos de elongación. •
Realizar la reacción de ligación con el ADNc de segunda cadena y un vector plásmidico para ensayos de expresión. •
Probar la transformación de las células BL21 con el vector de expresión portando el gen ftasa. •
Realizar el modelamiento de la estructura terciaria para la enzima FTasa de la cepa A. oryzae N74 para relacionar la secuencia de la proteína con el sustrato y entender en conjunto la dinámica catalítica de la enzima. 44
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