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RT- PCR diagnóstica del Cotton leafroll
dwarf virus (CLRDV) en plantas de algodón
La identificación rápida y precisa de los patógenos que afectan a los
cultivos de interés agronómico es crítica para predecir y controlar las
enfermedades y para seleccionar plantas tolerantes o resistentes en
los programas de mejoramiento.
Para el caso de infecciones virales, en los últimos años se han
desarrollado y optimizado métodos de diagnóstico por RT-PCR de
virus pertenecientes a la familia Luteoviridae
La enfermedad azul del algodón es producida por el Cotton leafroll
dwarf virus (CLRDV). El genoma del CLRDV fue recientemente
secuenciado por nuestro grupo y se desarrolló un método efectivo
de diagnóstico de la enfermedad permitiendo realizar un diagnóstico
temprano del virus en las zonas afectadas.
Objetivo del TP: Discutir protocolos de extracción de ARN a partir de
muestras de origen vegetal y la subsiguiente síntesis de ADN copia.
Realizar el diagnóstico molecular del CLRDV mediante la detección
de secuencias propias del virus en plantas de algodón infectadas
mediante la técnica de RT-PCR (transcripción reversa y posterior
PCR).
Parte I: Discutir con los docentes el protocolo de extracción de
ARN a partir de plantas del algodón y síntesis del ADN copia
(ADNc), observando los detalles importantes para obtener de
manera óptima estas moléculas.
Tejido vegetal
infectado
Sanas
Obtención de
RNA total
RT-PCR
Enfermas
Los protocolos de extracción de ARN involucran en general 4 etapas básicas:
1- Maceración mecánica para romper las paredes y membranas celulares del
tejido. La maceración de tejido fresco se hace en presencia de nitrógeno
líquido.
2- El tejido se resuspende en el buffer de extracción para la lisis del mismo y
la solubilización de las membranas lipoprotéicas y desnaturalización de las
proteínas, en tanto que el ARN es protegido de la acción de enzimas
degradativas.
3- La suspensión se somete a una extracción con solventes orgánicos, como
Fenol ácido (ph 4,5) y cloroformo, y las fases orgánica y acuosa se separan
por centrifugación. En esta extracción, lípidos, proteínas, la mayoría de los
polisacáridos y el ADN quedan retenidos en la fase orgánica en tanto que el
ARN y algunos polisacáridos quedan en fase acuosa. A la fase acuosa
obtenida en la etapa anterior se le adiciona alcohol (etanol o isopropanol). El
ARN en presencia de alcohol forman un precipitado, que a veces es visible,
que puede ser sedimentado por centrifugación. A este precipitado luego se lo
lava con alcohol para eliminar las sales remanentes.
4-En la última etapa, el ARN es resuspendido en agua MiliQ libre de RNAsas
(agua con Dietil Pirocarbonato).
Protocolo de extracción de ARN utilizando TRIZOL
Buffer de extracción
Sanas
Enfermas
Nitrogeno líquido
5 min a temperatura ambiente.
Centrifugar en microcentrífuga
refrigerada a 4 C durante 10
minutos a 12.000 rpm para
obtener un sobrenadante limpio
sin restos de material vegetal
Trizol (Isotiocianato
de Guanidinio-fenol
ácido, pH: 4,5)
100 mg de
tejido
Sobrenadante
cloroformo frío hasta volumen
final de 1,4 ml. Vortex 2 min
y
centrifugar
en
microcentrífuga refrigerada
a 4 C durante 10 minutos a
12.000 rpm.
Fase acuosa: ARN
1 volumen de
isopropanol.
Dejar durante la
noche a -20 C
Interfase: ADN y proteinas
Fase orgánica: AND y Proteinas
Fase acuosa
Descartar el máximo
posible de sobrenadante
sin perder el pellet
Lavar el pellet
con 250 μl de
etanol
70%.
Centrifugar
10
min a 14.000 rpm
a 4 C. Repetir
Resuspender el pellet en
50μl de agua libre de
RNAsas (agua DEPC:
Dietil Pirocarbonato)
Centrifugar en
microcentrífuga
refrigerada
a
4 C durante 30
minutos
a
14.000 rpm
Guardar
el ARN a
-80 C
El RNA es muy lábil y fácilmente degradado por la acción de RNAsas
presentes en la piel y por temperaturas superiores a 4ºC, lo que
constituye el principal problema de la extracción del RNA, por ello se
utiliza inhibidores de RNasas, guantes para su manipulación, se
utiliza todo el material libre de RNAsas y se trabaja a temperaturas
inferiores a 4ºC.
S
E
Síntesis de ADNc.
RNA
cDNA
3
5
Primers al azar o poliT
Transcriptasa reversa
cDNA 1ª cadena
3
5
PCR
Gel
Secuenciar
cDNA
Para la síntesis de ADNc se utilizara el kit comercial SuperScript III (Invitrogen)
ARN
dNTPs (10 mM)
Random primers (150 ng/ l)
H2O Depc
1
1
1
X
g
l
l
l
Volumen
15 l
Colocar 5 min a 70 C y luego inmediatamente en hielo. Hacer un spin.
Agregar la siguiente mix:
Buffer 1st strand 5x
DTT 0,1M (Dithiothreitol)
RNAse out (40U/ l)
Transcriptasa reversa (200U/ l)
(Superscript III)
4
1
1
1
l
l
l
l
22
Colocar en un termociclador con el siguiente programa:
25 ºC
2 min
50ºC
2 hs
70ºC
15 min
16ºC
ON
PARTE II: Detección de secuencias específicas del CLRDV mediante
PCR para su diagnóstico molecular.
ORF 0
ORF 3
785 pb
606 pb
ORF 0: 785 pb
ORF3: 606 pb
Gh Ubiquitina: 500 pb
Se realizará otro control (control positivo) para confirmar que la reacción
de amplificación por PCR funcionó. Para ello utilizaremos un plásmido que
tiene clonado el ORF 0 (P0) y otro plásmido que tiene clonado el ORF 3
(CP) con los primers correspondientes. Control con DNA Gh para primers
Ubi
Tubo 1: ADNc planta enferma con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 2: ADNc planta sana con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 3: plásmido CP con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 4: mix sin ADNc con Primers 1 y 2 (CP)
Tubo 5: ADNc planta enferma con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 6: ADNc planta sana con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 7: plásmido P0 con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 8: mix sin ADNc con Primers 3 y 4 (P0)
Tubo 9: ADNc planta enferma con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
Tubo 10: ADNc planta sana con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
Tubo 11: ADN algodón con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
Tubo 12: mix sin ADNc con Primers 5 y 6 (Gh UBI)
Reactivos
Concentración
final
Volúmen en l
Volúmen total
MIXADNc
plásmido o ADN
H2O MilliQ
----
16,45
l
Buffer 10X
1X
2,5
l
MgCl2 50mM
1,5 mM
0,75
l
dNTPs 10 mM
0,4 M
1
l
Primer up 50
ng/ l
1
Primer low 50
ng/ l
2 ng/ l
Taq Platinum
(10 U/ l)
0,08 U/ l
1
l
0,3
l
ADNc ó
plasmido (1
ng/ l)
2
(por tubo)
Volúmen final
25
l
El programa de amplificación es el siguiente:
1 ciclo
94 C, 4 min (desnaturalización inicial)
35 ciclos
94 C, 1 min (desnaturalización)
55 C, 1 min (hibridación)
72 C, 1 min (extensión)
1 ciclo
72 C, 10 min (extensión final)
16 C, infinito