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10/3/2008
T.P.
T
P Nº 5
Pruebas Bioquímicas
q
1
10/3/2008
l ió de
d cepas que comparten
t propiedades
i d d estables
t bl y difieren
difi
Especie bacteriana: colección
significativamente de otros grupos de cepas.
Asociación DNA-DNA (>70%)
Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)
IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO
Pruebas bioquímicas:
Ensayos que ponen de manifiesto características metabólicas
de los microorganismos.
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Catalasa
Oxidasa
Hidrólisis de almidón
Motilidad
Sensibilidad a antibióticos
IMViC
Agar Hierro-Dos azúcares de Kligler
API 20E
Pruebas bioquímicas para la
identificación de
enterobacterias
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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)
Vibrio
Aeromonas
Pseudomonas
Escherichia coli
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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)
Se utiliza un donor de
electrones artificial (tetrametil(tetrametil
p-fenilenediamina).
Reacción +
Reacción -
Vibrio
Aeromonas
Pseudomonas
Enterobacterias
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Prueba de la Catalasa
Peróxido
ó i de hidrógeno
i ó
Radical hidroxilo
Compuesto producido en pequeñas cantidades
durante la respiración aeróbica. Su producción
está mediada por flavoproteínas.
Radical libre altamente reactivo. Agente
oxidante capaz de atacar cualquier molécula
orgánica presente en la célula.
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Prueba de la Catalasa
Enzimas que actúan sobre
los derivados tóxicos del
oxígeno:
Catalasa
Peroxidasa
Enzimas que destruyen el peróxido de
hidrógeno.
Superóxido dismutasa
Enzima que destruye el anión
superóxido
p
(
)).
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Prueba de la Catalasa
-
+
Reacción +
Ensayo:
Se toman bacterias de un cultivo
sólido y se esparcen con ansa sobre
una gota de peróxido de hidrógeno
30%.
Aerobios estrictos o
facultativos
Bacillus
Staphylococcus
Enterobacterias
Reacción - Clostridium
S
Streptococcus
Anaerobios estrictos o
Lactobacillus
microaerófilos
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Hidrólisis de almidón
( )
α-amilasa:
α
amilasa: Enzima qque hidroliza los enlaces α(1-4)
de polímeros de glucosa.
-
+
Reacción +
(Halo transparente)
Agregado de
Lugol
B ill
Bacillus
Agar - almidón
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Motilidad
Se detecta la presencia de flagelo bacteriano.
Se cultivan las bacterias por punción en
placas de agar blando.
Se observa migración como un halo desde
el punto de siembra.
Bacterias móviles
Bacterias no móviles
Pseudomonas
Bacillus
Enterobacter
Vibrio
Staphylococcus
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Sensibilidad a antibióticos
Mecanismos de acción
Inhibición de la síntesis de la pared (Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,
Cefalosporinas, Vancomicina, etc.)
Inhibición de la síntesis de proteínas (Streptomicina, Gentamicina,
Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)
Inhibición de la sínteis de ácidos nucléicos (Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)
Disrupción de la membrana (Polimixina B)
Antagonistas metabólicos (Sulfonamida, Trimetoprima)
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Sensibilidad a antibióticos
MIC (concentración inhibitoria mínima)
Análisis de
sensibilidad a
antibióticos
MLC (concentración letal mínima)
Análisis de difusión en agar
(sistema de discos)
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Sensibilidad a antibióticos
Metodología de trabajo:
Se crecen cultivos en medio líquido.
Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.
Se depositan discos con diferentes antibióticos.
Se mide el diametro del halo de inhibición.
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Pruebas bioquimicas para la
identificación de Enterobacterias
Cocobacilos Gram negativos
Aerobios facultativos (Catalasa positivos)
Fermentadores de Glucosa
Oxidasa negativos
1) IMViC
a)) Prueba del Indol
b) Rojo Metilo
c) Voges Proskauer
d) Prueba del citrato
2) Agar Hierro Dos Azúcares de Kligler
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1)) IMViC
a) Prueba del Indol
Indol: Subproducto de la degradación del aminoácido Triptofano
por la enzima triptofanasa.
Cultivar la bacteria en caldo de peptonas
(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.
Reacción –
Reacción +
Formación de una fase Formación de una fase
orgánica amarilla
orgánica roja
Agregar al cultivo cinco gotas de reactivo
de Kovacs (dimetilaminobenzaldehído).
El reactivo de Kovacs reacciona con el
indol dando un producto de color rojo.
Salmonella
E. coli
Enterobacter
Proteus
Klebsiella
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Fermentacion:
Tipos de Fermentación
1) Láctica
2) Alcohólica
3) Propiónica
4) Butilenglicólica
5) Ácido Mixta
6) Aceto-Butírica
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F
Fermentación
t ió Butilenglicólica
B til
li óli
Enterobacter
Serratia
Erwinia
Bacillus
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Fermentación Ácido
Á
Mixta
Escherichia, Salmonella,
Proteus, etc.
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1)) IMViC
b) Rojo de Metilo
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar
f
fermentación
ió ácido-mixta.
á id
i
Rojo de Metilo:
Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3
Se inocula medio RM
RM-VP
VP
Incubación 48h a 37ºC
Reacción –
Reacción +
(Amarillo)
(Rojo)
Se agregan 3 gotas de Rojo de
Metilo 0,1%.
Enterobacter
E. coli
Klebsiella
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1)) IMViC
c) Voges Proskauer
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de producir
acetilmetilcarbinol
il
il bi l (acetoína)
(
í ) a partir
i de
d la
l frementación
f
ió butilenglicólica
b il li óli de
d la
l
glucosa.
Se inocula medio RM-VP
Reacción –
Reacción +
E. coli
Enterobacter
Incubación 48h a 37ºC
Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit
(
(α-naftol,
f l vira
i all rojo
j all reaccionar
i
con la
l
acetoína) y 0,2 ml de KOH 40%.
Klebsiella
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1)) IMViC
d) Prueba del Citrato
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizar
citrato como única fuente de carbono.
carbono
Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul de
b
bromotimol
ti l como indicador
i di d de
d pH).
H)
Incubación 48h a 37ºC
Reacción –
Sin cambio (medio de
color verde).
Reacción +
Crecimiento y viraje al
azul (la eliminación del
citrato alcaliniza el
medio).
E. coli
Salmonella
Shigella
g
Enterobacter
Klebsiella
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1)) IMViC
I M V C
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Salmonella
Enterobacter
Kl b i ll
Klebsiella
_
+ +
_
+ +
_
_
+
_ _
+
_ _
+
_
_
+
+
+
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2)) Agar
g Hierro-Dos azúcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.
Peptona de
d carne
A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendo
una alcalinización del medio.
Lactosa y Glucosa
(10:1)
La fermentación de estos sustratos produce compuestos
ácidos.
Tiosulfato de sodio.
Citrato de hierro y amonio.
Rojo fenol
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrógeno, el cual reacciona con la sal de hierro
produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .
Vira al amarillo en medio ácido.
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2)) Agar
g Hierro-Dos azúcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.
Se inocula el medio por
punción y estría en
superficie.
superficie
Incubación 24h a 37ºC
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2)) Agar
g Hierro-Dos azúcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.
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API 20E
Sistema ppara la identificación rápida
p de enterobacterias.
Dispositivo plástico con tubos que contienen medios deshidratados.
Se inocula cada minitubo con una suspensión del microorganismo a analizar y se
incuba 24 hs a 37ºC en una atmósfera húmeda.
Al cada resultado se le asigna un código que da como resultado un número de 7
cifras q
que se compara
p con tablas o bases de datos para
p la identificación de la
especie..
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