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Apuntes de Laboratorios – Microbiología
 Laboratorio 1. Tinciones
Tipos
 Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente la morfología.
 Compuestas ó especiales: constituidas por 2 ó más tintes o reactivos y sirven para
clasificar las bacterias u observar sus características especiales.
 Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
 Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras refringentes.
Tinciones compuestas.
Tinción de Gram
Principio: Composición de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ está compuesta por
varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana externa con un
componente estructural único que son los lipopolisacáridos.
Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta después de la decoloración y aparecen de color azul
intenso (purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta después de la
decoloración y son teñidas de rojo con safranina.
Pasos:
1) Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un asa
bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia bacteriana.
a. Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia, igual en
muestra semisólida.
b. Muestra liquida: colocar la colonia directamente.
2) Dejar secar al aire, luego fijar la preparación
pasando la placa rápidamente por el mechero (2 ó
3 veces)
3) Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos
(Colorante primario), enjugar con agua
seguidamente.
4) Agregar yodo gram durante 40 a 60 segundos
(mordente), enjuagar con agua seguidamente
5) Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua
inmediatamente (decoloración, disuelve lípidos de
la pared de G- )
6) Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar
con agua seguidamente.
*Mordente: compuesto químico intensificador de color.
Tinción de Moeller (esporas)
Se suspende una bacteria del genero Bacillus,
evidencia capsula incolora en un contraste
morado.
1) Se prepara el extendido de la muestra
2) Se deja secar y se fija con calor
3) Se tiñe con carbol-fuschina hasta llenar
por completo el portaobjetos
4) Pase un mechero por debajo de la placa
calentando hasta que vea que se emiten
vapores y sin dejar que hierva por 3
minutos. Si la placa se va secando, ir
agregando mas tinte hasta cumplir el
tiempo. (Se calienta el tinte para que
penetre la espora que contiene
dipecolinato de calcio)
5) Se enjuaga con agua y se coloca acido
sulfúrico al 1% por 2 minutos (decolorante para retirar el carbol-fuchina)
6) Se enjuaga con agua y se tiñe finalmente con azul de metileno por 1 minuto
7) Dejar secar
Tinción de Anthony (cápsula)
Es una tinción negativa en donde vemos la cápsula no teñida sobre un fondo morado y se visualiza
la bacteria en el centro de la cápsula, esta pude ser de glicoproteínas o polisacáridos.
1) Colocar leche descremada al 20% o leche litmus en un extremo del portaobjetos
2) Agregar la muestra de bacteria en la leche del borde
3) Realizar un extendido con la ayuda de
otro portaobjetos
4) Se deja secar al aire (no se fija con calor
ya que la leche se pega al portaobjetos)
5) Teñir por 2 minutos con violeta-cristal.
6) Lavar con sulfato de cobre.
7) Se deja secar al aire.
 Laboratorio 2. Cultivo de Bacterias y morfología colonial.
Medios de cultivo, según composición química:
 Nutritivos: puede crecer cualquier bacteria, ej.: BHI
 Selectivo: solo crecen determinadas bacterias, ej.: McConkey (solo bacterias G-)
Son inhibidores de G+, contienen sales biliares y violeta-cristal
 Diferencial: ej: McConkey(bacterias fermentadoras y no fermentadoras)
Contienen rojo neutro que indica cambios de pH, G- fermentadores se tiñen de rosado, los
G- NO fermentadores son transparentes.
 Enriquecidos: agregados nutrientes extras ej: agar sangre(agregamos sangre)
Medios de cultivo, según composición física:
 Sólidos ej.: agar
 Líquidos ej.: caldo
 Semisólidos: consistencia gelatinosasolo se inocula con aguja sembrando en el fondo
entrando y saliendo en línea recta, verifican motilidad, ej.: SIM
Medios de cultivo, según aspecto físico:
 Inclinado: Se usa una aguja o asa bacteriológica y se hace un estriado en el plano
inclinado(pico de flauta)
 Profundo e inclinado: Se usa solo una aguja bacteriológica, se inserta hasta el fondo y al
sacarle se hace un estriado sobre el plano inclinado ej.: TSI
Como Cultivar:
1) Usar un asa bacteriológica
2) Tomar el plato con agar y proceder a poner la cantidad de colonia en un extremo y estrié
hasta la mitad del plato, incinerar el asa
3) Tomar la última porción del primer estriado y continuar con estrías mas separadas hasta
cubrir un cuarto del plato, incinerar el asa
4) Tome la última porción del segundo estriado y continúe con el último cuarto del plato
haciendo estrías mas separadas, incinere el asa antes de guardar.
Evaluación de las colonias:
 Tamaño: pequeña (1-5mm), mediana (5-8mm), grande (mayor de 8mm)
Se aíslan colonias en un tejido
para ver las morfologías
individuales.
 Laboratorio 3. Efectos de los agentes físicos y químicos sobre las bacterias
Antiséptico: sustancia que elimina bacterias sobre personas
Asepsia: proceso diseñado para evitar que los microorganismos lleguen a un ambiente protegido
Desinfectante: sustancia que elimina bacterias inhibiendo su crecimiento, usado sobre
superficies inertes
Desinfección: empleo de agentes químicos para destruir microorganismos patógenos con eficacia
variable.
Esterilización: destrucción de toda forma viviente
Pasteurización: utilización del calor para matar las formas vegetativas de las bacterias.
Métodos de desinfección físicos:
 Autoclave: el calor húmedo permite la desnaturalización rápida de proteínas y se utilizan
parámetros de presión (15 lb), temperatura (121°) y tiempo de exposición (15 minutos).
 Horno: el calor seco requiere de una temperatura de 160° y de 2 horas de exposición.
 Rayos UV: requiere de exposición directa, produce la perdida de la capacidad para
replicarse, tiempo de 10 a 15 minutos, tiene poco poder de penetración.
 Filtración: usado para líquidos, agentes más pequeños que los poros logran atravesar.
Métodos de desinfección químicos:
 Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas y como
agentes deshidratantes. Lesionan la membrana celular de los microorganismos y
desnaturalizan proteínas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica. No destruyen
esporas y tienen una acción germicida lenta.
 Fenol y compuestos fenólicos son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana
citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa
filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis.
 Cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y
ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos,
indoles y al hidroxifenol de la tirosina.
 Antisépticos: peróxido de hidrogeno, yodofóro
Características del desinfectante ideal:
 Actividad antimicrobiana a baja concentración
 Solubilidad
 No ser tóxico para personas y animales
 No combinarse con materia orgánica extraña
 Actividad a temperatura ambiente o del cuerpo
 Capacidad de penetración
 No ser corrosivo ni teñir
 Poder desodorante
 Disponible y barato
Pruebas de sensibilidad (antibiogramas)
Se usa el agar Mueller Hinton, es un agar nutritivo, porque esta estandarizado y el antibiótico
difunde sin ningún problema.
 Difusión en plato ó método de Kirby-Bauer
 Colocar una pequeña cantidad del cultivo en solución salina y llevar la turbidez
hasta hacerla equivaler con el tuve 0.5 de la escala de McFarland (1.5 x 108
UFC/ml) (contiene acido sulfúrico y cloruro de bario, la función de esta escala es la
estandarización del inoculo)
 Sembrar en agar Mueller-Hinton (baja concentración de iones divalentes. Medio
recomendado por la NCCLS, no contiene timina o timidina, profundidad en el orden
de 4 mm., pH: 7.2 y 7.4)
 Usar hisopo esteril impregnado de la suspensión anterior y difuminar varias veces
incluso por los bordes.
 Colocar discos de antibióticos, alejados unos de otros
 Incubar a 37° por 24 horas. Se leen los halos de inhibición midiendo el diámetro y
se comparan con las tablas disponibles.
A mayor efecto de antibiótico, mayor halo de inhibición
 E-Test (epsilon test): Técnica que combina los métodos de difusión en agar y dilución para
determinar la CIM. La sistemática es similar al método de difusión en agar pero en lugar
de discos utiliza tiras de E-test.
Estas tiras contienen un gradiente del antimicrobiano en la superficie inferior que
difunde en el agar estableciendo un gradiente continuo del mismo a lo largo de la tira.
Después de la incubación se forma una zona elíptica de inhibición del crecimiento y la CMI
corresponde con el punto donde el área de inhibición del crecimiento intersecciona con la
tira.
CIM (concentración inhibitoria mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir
el desarrollo de una cepa bacteriana dada.
CBM (concentración bactericida mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de
destruir una cepa bacteriana dada.
 Laboratorio 4. Flora Normal y del ambiente.
Se conoce como la Flora Indígena, es una colección de organismos que se encuentra
habitualmente en el individuo sano normal y que coexisten en forma comensal.
Conformada por: hongos, bacterias y parasitos. La colonización del cuerpo humano empieza en el
nacimiento, se adquiere a través de la leche materna. La flora normal microbiana en humanos
está confinada especialmente a la piel y las mucosas
División del cuerpo en áreas (según presencia o ausencia de F. Normal):
• Libres de agentes o estériles
– L.C.R, tejidos, órganos, zonal pleural, pericardio
• Posibles presencias
– Sangre, liquido linfáticos, orina
• Altamente pobladas
– Piel, boca, nariz, conjuntiva, faringe, intestinos delgado, Int. grueso, regiones
urinarias y anales.
Tipos de Flora normal
• La Flora basal: Son agentes que están siempre presente en un sector.
– S. epidermidis: en la piel
– E. coli : en el intestino
• La Flora transitoria: Son agentes que colonizan de forma intermitente un determinado
sector.
– S. aureus
– Enterobacterias y Acinetobacter en axilas e ingle.
Importancia de la Flora normal:
• Es una barrera biológica contra la
colonización de agentes patógenos.
• Contribuye a la respuesta inmune:
– aumenta la producción de
anticuerpos e interferones
– estimula la fagocitosis.
• Producción de bactericidas
– bacteriocinas, colicinas (M.
sec. y baja O2).
•
•
Consumo de compuestos esenciales
Producción de vitaminas (K, B)
Localización
Piel (zonas de piel con mas flora: cuero
cabelludo, cara, oído, axila, región urinaria y
anal, plantas y espacios interdigitales de los
pies)
Boca
Vagina (pre-pubertad)
Vagina (post-pubertad, pH 4-4.5)
Nariz
Intestino Grueso
Ejemplos
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus
Streptococcus
Streptococcus mitis
Streptococcus mutans
Streptococcus sanguis
Streptococcus salivarus
Staphylococcus
Streptococcus
Difteroides
Echerichia Coli
Lactobacillus o lactobacilos Donderlein
Candida albicans
Thichomona vaginalis (pH 5.5)
Staphylococcus aureus(20% población)
Staphylococcus epidermidis
Micrococcus
Streptococcus
Difteroides
Bacteroides sp
Fusobacterium sp
Enterococo faecalis
Enterobacterias (E. Coli, Klebsiella sp,
Salmonellas)
Lactobacillus
Pseudomonas
Eubacterias
Bifidobacterias
La vaginosis bacteriana es una infección cervicovaginal muy común dentro de la consulta
ginecológica. Se caracteriza principalmente por un incremento del fluido vaginal, lo cual origina
malestar en las pacientes. En esta patología se ha observado un aumento importante en la
concentración de microorganismos, sustancialmente de Gardenerella vaginalis y los anaerobios
presentes en la vagina. Se conoce también con el nombre de vaginitis no específica, nombrada así
por los médicos que al no encontrar ni tricomonas ni levaduras. Otros sinónimos son vaginitis
anaeróbica o vaginosis anaeróbica.
UCF=
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑥 0.2
𝑈𝐹𝐶/𝑚3 (𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟)
IC=𝑈𝐹𝐶/𝑚3(𝐸𝑥𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟)
IC= Índice de contaminación
IC menor que 1 es bueno, IC de 1 a 3 es regular, IC mayor de 3 es malo.
 Laboratorio 5. Cocos Gram + de importancia medica
Prueba de Catalasa (peróxido de hidrogeno)
Observa un burbujeo es +
No se observa burbujeo es –
Prueba de Coagulasa (Staph Plus)
Si se observa un coagulo es coagulasa +
No se observa coagulo es coagulasa –
Prueba de manitol-sal (indicador rojo fenol)
Color amarillo +
Color rojo ó rosa –
Prueba de Biliesculina
Color negro oscuro +
Color verde oliva Prueba de CAMP
La interacción del factor CAMP de Streptococcus agalactiae con β-lisinas de Staphylococcus
aureus potencia la hemolisis de S. agalactiae formando la zona de hemolisis en forma de flecha.
El desconocido se siembra perpendicular al S. aureus si es S. agalactiae se formara la flecha.
Clasificación de Lancefiel, Rebeca Lancefield, basada en los carbohidratos de la pared celular
(antígenos de membrana), Grupos A-G
Clasificación por hemolisis en agar sangre:
Alpha-color verde
Beta-Transparente
Gamma-Nada
 Laboratorio 9. Microbiología de aguas y alimentos
Enfermedades de transmisión alimentaria (ETA) pueden darse por el consumo de sustancias
toxicas o microorganismos patógenos.
Tipos de contaminación
Física ej.: pedazos de vidrio
Química ej.: insecticidas
Microbiana ej.: virus, bacterias, hongos
Como suceden:
 Enfriamiento inadecuado (principal causa de ETA)
 Calentamiento o recalentamiento a T° inadecuadas que no eliminan las bacterias
 Agregan ingredientes crudos o contaminados a los alimentos
 Mala higiene
 Descomposición y almacenamiento (descongelar y volver a congelar)
 Contaminación cruzada (alimentos crudos contaminan a los listos para comer)
 Ingerir alimentos de alto riesgo (muy manipulados, crudos)
Requerimientos de producción de bacterias en alimentos: Humedad, nutrientes, tiempo, pH,
temperatura
Laboratorio 10. Bacilos Gram -: fermentadores y no fermentadores
Características relevantes:
 Amplia distribución en el tracto gastrointestinal (TGI)
 Reducción de nitratos
 Fermentadores de glucosa (excepto Pseudomona sp)
 Citocromo oxidasa negativo (excepto Pseudomona sp)
Medios de cultivo
EMB (Eosina azul de metileno)
Este medio es selectivo y diferencial para el aislamiento de bacilos entéricos que permite una
diferenciación entre las colonias de microorganismos fermentadores de lactosa y aquellos que no
la fermentan. La presencia de sacarosa permite para ciertos miembros del grupo coliforme,
fermentarla con más facilidad que a la lactosa. Las colonias lactosa positivas son verdes con
brillo metálico o poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras. Mientras que
aquellas que son negativas en lactosa o sacarosa son rosa pálido translucidas.
McConkey
La inhibición de los microorganismos Gram positivos se obtiene mediante la mezcla de sales
biliares y cristal violeta. La acción diferencial del medio se basa en la fermentación de la lactosa.
Esta fermentación baja el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando
colonias rosa intenso con halo de inhibición precipitación. Los microorganismos no fermentadores
de la lactosa dan colonias de color ámbar o transparentes.
Salmonella-Shigela (SS)
La inhibición de microorganismos Gram positivos se debe a su contenido de sales
biliares, verde brillante y citratos. La diferenciación de los microorganismos
entéricos se logra por la incorporación de lactosa en el medio. Los microorganismos
que fermentan la lactosa producen ácido, el cual al reaccionar con el indicador rojo
neutro, forma colonias de color rojo. Los microorganismos no fermentadores de
lactosa forman colonias incoloras. Este último grupo contiene la mayoría de los
microorganismos patógenos intestinales incluyendo Salmonella y Shigella. El
tiosulfato de sodio y el citrato férrico, facilitan la detección de sulfuro de
hidrógeno, manifestándose por colonias con centros negros.
Pruebas Bioquímicas
Citrato: para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única
fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su
metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias
estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella,
Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia,
Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos
nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio
contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de
nitrógeno respectivamente y azul
de bromotimol como indicador de
pH. Sólo las bacterias capaces de
metabolizar el citrato podrán
multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto
con la eliminación del citrato
(ácido),
generará
una
fuerte
basificación del medio que será
aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.
TSI (triple azúcar hierro): es un medio nutriente y diferencial que permite
estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y
lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S.
Sirve para la identificación de enterobacterias según la fermentación de tres
azúcares (lactosa[10 g/l], sacarosa[10 g/l] y dextrosa[1 g/l, se va al fondo]) y
producción de sulfhídrico. El sulfato férrico sirve como indicador y el rojo fenol
como indicador del pH.
Pico alcalino/fondo alcalino K/K
No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no
fermentadoras como Pseudomonas sp.
Pico alcalino/fondo ácido K/A
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.
Pico alcalino/fondo negro K/A H2S+
Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de
ácido sulfhídrico. Salmonella spp.
Pico ácido/fondo ácido A/A
Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no.
E.coli A/A H2S +
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej.
A/AgH2S-.
*NUNCA va a haber A/K
Urea: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos
moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es
característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para
diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
retardado. La urea será
degradada
por
aquellos
microorganismos capaces de
producir el enzima ureasa
produciendo amoniaco que
hará variar el color del
indicador de amarillo a rojo.
Se cultiva el microorganismo
en slant en agar urea de
Christensen. El indicador es
el rojo fenol.
MR-VP (Rojo metilo_Voges-Proskauer): estas dos pruebas forman parte del
IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las
enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Se cultiva el microorganismo en caldo
RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días
como mínimo y 5 como máximo.
Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución
indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la
coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece
amarillo.
Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:
0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico
absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso.
0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el
aspecto lechoso y se agita fuertemente.
Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosadovioláceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo.
Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.
SIM: se mide la producción de sulfuro, la producción de
indol (con revelador) y la movilidad de la bacteria. Se pulla
el agar en tubo hasta el fondo sin mover. Si el tubo sale
turbio hay movilidad (caminito es -), si queda negro hay
producción de sulfuro y si tiene un anillo rojo arriba hay
producción de indol. Ni B. magaterium ni B. subtillis son
móviles (-).
Fenilalanina: determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido
fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina
desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es
característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por
lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias. Se cultiva el
microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con
abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml
(3 gotas) de una solución de cloruro férrico (FeCl3) al 10% de manera que inunde
todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se
manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verdeazulado.