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BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 227, 885–889 (1996) - ARTICLE NO. 1600
Leishmania donovani Possess a NADPH-Dependent
Alkylglycerol Cleavage Enzyme
Deqin Ma,* Stephen M. Beverley,† and Salvatore J. Turco*,1
*Department of Biochemistry, University of Kentucky Medical Center, Lexington, Kentucky 40536; and
†Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology,
Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115
Received September 10, 1996
Leishmania parasites possess an abundance of ether-linked hydrocarbons as components of phospholipids and
glycosylphosphatidylinositol anchors of glycoproteins and polysaccharides, including important surface molecules such as
lipophosphoglycan (LPG) and glycosylinositolphospholipids (GIPLs). Cleavage of the ether bond is an important feature in the
turnover pathway of alkylglycerols. In mammals, ether lipid cleavage activity requires a pteridine cofactor (H4-biopterin),
suggesting the potential for linkage between the unusual Leishmania pteridine metabolic pathways and lipid metabolism. In this
study, we partially purified and characterized an activity in L. donovani capable of cleaving the ether lipid 1-O-alkyl[3H]glycol.
Unlike the mammalian enzyme but like that of Tetrahymena, the Leishmania enzyme required NADPH rather than H4-biopterin.
The use of divergent cofactors by the parasite and mammalian enzymes may
provide a basis for the design of anti-parasitic drugs targeting ether-linked lipid metabolism. © 1996 Academic Press, Inc.
Leismaniasis
Las claves que determinan la infectividad de la leismaniasis y la supervivencia en
ambientes hostiles del huésped son sus lpofosfoglicanos conjugados en la superficie
(LPG) y glycosylinositolphospholipidos (GIPLs).
Los LPG son glycosylfosfatidylinositol polimórfico anclado polisacárido. La porción
de lípido de LPG característicamente contiene un 1-0-alkyl1-2lyso-fosfatidylinositol
en el cual la cadena alifática consiste en un C-24 o C26 saturado, hidrocarbono no
ramificado (1.2), mientras todo el GILPs tiene el mismo 1-0-alkylglicerol, algunos
poseen ácido graso esterificado en C-2 del glycerol en la espina dorsal.
En las células de los mamíferos, el volumen de 1-0-alkylglicerol requiere un éter
gliceril
monoxigenado
(1-0-alkyl-sn-glycerol,
tetrahydropteridina:
oxigeno
oxidoreductase, EC 1.14.16.5) que catalice la brecha oxidativa de lípido a grasa
aldeído y glicerol (3). El monoxigeno puede asi también, degradar el alkilglicerol.
Esta reacción requiere oxígeno molecular y tetrahydrobiopterina para hydroxilar el
carbon alifatico adyacente a la cinta del éter. El producto de la reacción inicial es un
hemiacetal, el cual espontáneamente hidroliza para rendir el aldeído graso y el
glicerol libre. Concentraciones relativamente bajas de alkilglicerol pueden ser
eficientemente catabolizadas por Leishmania mientras que altas concentraciones de
alkilglicerol son tóxicas. Debido a la abundancia del alkilglicerol anclado LPG y
GIPLs en la superficie de promastigotes de leishmania y la toxicidad del alkilglicerol
para los parásitos, investigamos la naturaleza de la enzima parasitaria que degrada
el alkilglicerol. En este estudio, reportamos el descubrimiento de una enzima en
leishmania capaz de catalizar la brecha del alkilglicerol. La enzima fue parcialmente
purificada y caracterizada y se encontró que requiere NADPH como coenzima a
diferencia de su contraparte mamífera.
Resultados
Experimentos in Vitro de la actividad de la brecha del alkilglicerol.
En un reporte previo de Kaufam, entre otros, se desarrolló un ensayo para probar la
brecha del alkilglicerol en el hígado de ratas usando alkilglicerol como sustrato.
Basados en ese estudio, se examinó una célula de L. donovani por la capacidad de
hidrolizar 1-0-octadecyl1[3H]glycol. La brecha in Vitro del sustrato lípido para formar
[3H]etileno fue lineal con el tiempo de 1 hora y dependiente de las concentaciones
de proteínas. Varias razones posibles del porqué la formación no fue lineal
proporcionalmente a la cantidad de proteína son efectos inhibitorios de las
cantidades ascendentes de lípido (de las membranas) en el ensayo, la consumición
de sustrato de cofactores, o incremento en las cantidades de enzimas degradantes.
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El ph óptimo para esta actividad fue 6.5-7. en contraste con el sistema de los
mamíferos, los cofactores no tienen efectos simulatorios sobre la brecha del sustrato
radiactivo mientras NADPH simula la actividad de la leishmania.
Solubilización y purificación parcial de la enzima de alkilglicerol. La actividad fue
granulada por centrifugación a 100.000 por g, indicativo de una enzima de la cinta de
la membrana. Para solubilizar la enzima, este grano fue incubado con CHAPS a una
concentración final de 2.0% por 30 min a 4°C, luego fue diluida en una
concentración de CHAPS de 0.3% por 2 horas adicionales. Luego de la
centrifugación a 100.000 por g por 1 hora, aproximadamente 80% de la actividad
enzimática se recuperó flotando en la superficie. La enzima solubilizada se sujetó a
una cromatografía de cambio de iones en una columna de celulosa QAE pre
equilibrada con 0.1% de CHAPS en 20 mM tris-HCI, pH 7.5. La cinta de la enzima al
soporte aniónico fue desplazada por elusión isocrática con 0.1 M Tris/HC1, pH 7.5,
Se reunieron las fracciones que contiene el principal pico de la actividad enzimática
y el enriquecimiento de la actividad específica se juzgó en 10.
Requerimientos de cofactor para la actividad del alkilglicerol. Se investigaron los
requerimientos de cofactor de la enzima parcialmente purificada de alkilglicerol. La
actividad monooxygenada estimulada del NADH con un Km aparente alrededor de
10uM. NADH (1 mM) fue aproximadamente 50% tan efectivo como NADPH en la
actividad estimulante. La adición de tetrahydrobiopterin y/o pteridina no tuvo efecto
en la actividad en ausencia de NADPH. Asi, la adición de derivados relacionados a
la pteridina con o sin PTR1, dimethyltetrahydropteridina y 5,6,7,8-tetrahydropteridina
o el metotrexate inhibidor de la pteridina (1 mM) falló en alterar la cinta. Glutathion
tampoco tuvo ningún efecto en la actividad. Resultados similares se obtuvieron
utilizando una preparación solubilizada de la enzima, la cual, no fue fraccionada en
celulosa QAE. Colectivamente, los resultados fueron consistentes con la presencia
de enzimas de alkilgliceroles dependientes de NADPH en L. donovani.
Sustratos de enzimas de alkilgliceroles. Desde el sustrato radiactivo del ensayo de
alkilglicerol, no fue una sustancia fisiológica, fue importante para confirmar que la
enzima hidroliza un sustrato biológicamente relevante. 1-0-octadecylglycerol está
presente en el parásito y es una versión en cadena mas corta de la porción de
alkilglicerol de LPG y GIPLs. Cuando 1-0-octadecylglycerol se usó como sustrato en
el ensayo in Vitro, la cinta del éter también fue observada y el producto hidrosoluble
fue identificado como glicerol en la cromatografía en papel. 1-0-octadecylglycerol se
examinó también por la inhibición de 1-0-[3H]octadecylglycerol análogo en el ensayo
de alkilglicerol usando enzima purificada de celulosa QAE incrementando la
concentración no radiactiva de 1-0-octadecylglycerol resultó en una disminución del
sustrato radiactivo. A 1 mM de 1-0-octadecylglycerol, mas del 95% del sustrato
glycol radiactivo permaneció sano. Estos resultados indican que la misma enzima
del alkilglicerol que cataliza la brecha de alkilglicerol es también responsable de la
degradación del alkilglicerol en L. donovani.
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