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Curs 103401.- Experimentant pels nous camins de la bioquímica
Guió professorat
Servei de Fermentació
Curs 103401.- Experimentant pels nous camins de la bioquímica
Varias prácticas con microorganismos
Clasificación de microorganismos infectantes por grupos de riesgo.
Grupo de Riesgo 1 (escaso o nulo riesgo individual y comunitario): pertenecen a este grupo
aquellos microorganismos que tiene pocas probabilidades de provocar enfermedades
humanas o animales.
Grupo de Riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo comunitario bajo): pertenecen a este
grupo aquellos agentes patógenos que puede provocar enfermedades humanas o animales,
pero que tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de
laboratorio, la comunidad, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio
puede provocar una infección grave, pero se dispone de medidas eficaces de tratamiento y de
prevención, y el riesgo de propagación es limitado.
Grupo de Riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo comunitario bajo): pertenecen a este
grupo aquellos agentes patógenos que suele provocar enfermedades humanas o animales
graves, pero que de ordinario no se propaga de un individuo infectado a otro. Se dispone de
medidas eficaces de tratamiento y de prevención.
Grupo de Riesgo 4 (elevado riesgo individual y comunitario): pertenecen a este grupo aquellos
agentes patógenos que suele provocar enfermedades graves en las personas o en los animales
y que puede propagarse fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. No suele
disponerse de medidas eficaces de tratamiento y prevención.
Normas de trabajo según el grupo de riesgo.
Grupo
1
Nivel de seguridad
Laboratorio Básico-Nivel
de Seguridad Biológica 1
Ejemplos de laboratorios
Enseñanza básica
Prácticas de laboratorio
TMAa
Equipo de seguridad
Ninguno; trabajo en la mesa
de laboratorio al descubierto
2
Laboratorio Básico-Nivel
de Seguridad Biológica 2
Servicios de atención
primaria de salud;
TMA y ropa protectora;
riesgo biológico
Trabajo en la mesa de
laboratorio al descubierto y
CSB
Hospital de nivel primario,
diagnóstico, enseñanza,
salud pública
3
Laboratorio de
Contención-Nivel de
de Seguridad Biológica 3
Diagnóstico especial
Prácticas de nivel 2 y ropa
especial, acceso controlado,
flujo direccional del aire
CSB y/o la restante contención
primaria para todas las
actividades
4
Laboratorio de
Contención Máxima-Nivel
de Seguridad Biológica 4
Unidades patógenas
peligrosas
Igual que el nivel 3 y entrada
con cámara de aire, salida
para la ducha y eliminación
especial de residuos
CSB de clase III o ropa de
presión positiva, autoclave de
doble extremo, aire filtrado
a
TMA = técnicas microbiológicas apropiadas.
b
CSB = cámara de seguridad biológica.
Curs 103401.- Experimentant pels nous camins de la bioquímica
Grupo 1:
Usos
Aliivibrio fischeri:
Bioluminiscencia, quorum sensing, antibiograma
Pseudomonas fluorescens
Fluorescencia (fluoresceína) bajo luz UV, test de movilidad
Streptomyces griseus
Producción de estreptomicina, vit. B12, geosmina
Streptomyces fradiae
Producción de fradicina y neomicina
Streptomyces venezuelae
Producción de cloranfenicol, cloromicetin, melanoides
Bacillus polymyxa
Producción de polimixina
Saccharomyces cerevisiae
Producción de etanol, CO2, vit. B3
Kloeckera apiculata
Producción de vit. B1; baja producción de etanol
Halobacterium spp.
Salinidad extrema
Penicillium chrysogenum
Producción de penicilina, crisogenina
Grupo 2:
Usos
Escherichia coli
Ensayos genómicos, antibiograma, motilidad
Serratia marcescens
Producción prodigiosina, quorum sensing, antibiograma
Staphylococcus aureus
Antibiogramas
Bacillus cereus
Antibiogramas, resistencia de esporas
Curs 103401.- Experimentant pels nous camins de la bioquímica
Extracción del pigmento prodigiosina a partir de un cultivo de
Serratia marcescens
INTRODUCCIÓN
En el año 1263 el sacerdote alemán, Pedro de Praga, se detuvo en la ciudad italiana de
Bolsena, mientras realizaba una peregrinación a Roma. Era un sacerdote piadoso, pero tenía
dudas sobre la doctrina de la transubstanciación, es decir, en la transformación del vino y el
pan en la sangre y el cuerpo de Cristo. Cuando estaba celebrando la Misa junto a la tumba de
Santa Cristina, al pronunciar las palabras de la Consagración, comenzó a salir sangre de la
Hostia consagrada y salpicó sus manos, el altar y el corporal. Atemorizado, quiso ocultar la
evidencia plegando el hábito, pero no pudo, pues apareció más sangre. Interrumpió la Misa y
viajó a Orvieto, lugar donde residía el Papa Urbano IV.
Un año después, el 11 de agosto de 1264 el Papa Urbano emitió la bula papal Transiturus de
hoc mundo, decretando Corpus Christi como una fiesta para toda la Iglesia Católica y
generadora de muchas indulgencias.
Casi un siglo más tarde, en agosto de 1383, tras un incendio en la iglesia de Wilsnack,
(Alemania). Un sacerdote dejó sobre el altar tres hostias consagradas, destinadas a los
enfermos; luego de ocho días y tras una lluviosa noche, las hostias, que estaban secas en
medio de un altar húmedo, comenzaron a ensangrentarse, fenómeno que fue progresando en
los días sucesivos.
Para tranquilizar a la horrorizada población, el obispo de Havelberg fue a decir misa. Dudoso
de las hostias rojas, trajo una de su ciudad, poniéndola sobre la tela del altar “entre las otras
tres”. Aunque consagrada, también ésta terminó por enrojecer.
¿Cómo explicar estos sucesos? La humedad, el tiempo transcurrido, el progresivo aumento de
la pigmentación, la transmisión a la nueva hostia, todo parece avalar la presencia de Serratia
marcescens. Pero el milagro quedó establecido, los peregrinos llegaron por millares y se
sucedieron las curaciones milagrosas.
Serratia marcescens es un bacilo Gram negativo de la familia Enterobacteriaceae. Es un
patógeno oportunista causante de importantes infecciones nosocomiales. Estas infecciones
por Serratia coinciden en algunos puntos claves: son infecciones intrahospitalarias, en
enfermos debilitados, generalmente con alguna grave enfermedad de fondo, tratados con
antibióticos, sometidos a instrumentación o a intervenciones quirúrgicas. En todos ellos
Serratia, actúa como patógeno oportunista y ha sido seleccionado por los antibióticos
empleados, por lo que actúa como invasor secundario. Numerosas cepas de origen “salvaje”
(de origen ambiental, no hospitalario) son productoras de un pigmento rojo, llamado
prodigiosina. La molécula de prodigiosina es un tripirrol que posee capacidad antibiótica,
anticancerígena, citotóxica y, además, posee posibles aplicaciones como antitumoral actuando
como un antiproliferativo y exhibe propiedades de inmunosupresor.
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La prodigiosina induce la apoptosis en las células cancerosas hematopoyéticas y en otras
células cancerígenas humanas. Induce la rotura de membranas celulares, la condensación de
la cromatina, la reorganización de la arquitectura de los microfilamentos de actina y la
desadsorción de las células del sustrato.
Ilustración 1. Estructura de la prodigiosina.
La prodigiosina se expresa como un metabolito secundario mediante una regulación génica del
tipo quorum sensing. En la regulación de la síntesis de la prodigiosina interviene un regulador
que tiene la capacidad de difundir en el medio, de forma que cuando la densidad celular es
baja se mantiene un nivel intracelular bajo del regulador. Cuando la concentración celular
aumenta, se incrementa la concentración intracelular del regulador, y una vez alcanzado un
nivel umbral se desencadena el fenómeno de la expresión de la vía de síntesis del pigmento.
De modo que la aparición de la pigmentación se produce únicamente cuando se llega a una
elevada densidad celular. El mismo fenómeno se produce en el crecimiento en placa, cuando
las colonias son pequeñas y se hallan espaciadas no se desarrolla la coloración hasta que las
colonias no comienzan a alcanzan un diámetro superior a 1 mm.
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Ilustración 2. Placa inoculada con Serratia marcescens.
Ilustración 3. Desarrollo de la pigmentación en Serratia marcescens.
La prodigiosina es muy poco soluble en agua y ligeramente soluble en determinado solventes
orgánicos. A continuación se detalla dos métodos rápidos de extracción del pigmento.
Extracción de la prodigiosina
Se partirá de una placa de agar TSA en la cual se haya hecho crecer S. marcescens, una
incubación de 72 horas a 30 C es más que suficiente. En caso de no disponer de un incubador
adecuado puede dejarse crecer la placa de Petri durante un mínimo de 5 días o hasta que las
colonias adquieran un color rojo intenso.
Se utilizarán como disolventes los siguientes productos: acetona, isopropanol, y cloroformo.
A continuación indicamos como efectuar una extracción rápida en microtubos. Debemos hacer
recordar que los estos disolventes tienen un punto de evaporación bajo y son inflamables, y
para poder tomar correctamente la cantidad con una pipeta automática debe hacerse pasar un
par de veces por la punta desechable el disolvente.
Extracción con acetona.
Se coloca 0,5ml de acetona en un microtubo de polipropileno (plástico esterilizable). Con una
torunda de algodón (bastoncillos para los oídos, hisopos, o un asa de siembra) se toman tres o
cuatro colonias bien crecidas. Con la ayuda de la torunda resuspendemos las colonias en la
acetona y procuramos homogenizar el resuspendido hasta que vemos que la acetona adquiere
una coloración claramente visible. Antes de extraer la torunda, escurrimos el exceso de líquido
apoyando repetidas veces la torunda en las paredes del tubo.
Desechamos la torunda en un recipiente con lejía o en uno adecuado para esterilizarlo
posteriormente.
Una vez preparados los tubos que son necesarios, sedimentamos los restos celulares con
ayuda de una centrífuga de sobremesa. Se recupera el sobrenadante con cuidado utilizando
una pipeta desechable, traspasándolo a un tubo de vidrio o de polipropileno. Se puede
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clarificar la solución de acetona resultante utilizando un filtro de jeringa de teflón de 0,20 µm
de diámetro de poro.
Extracción con isopropanol y cloroformo.
Se dispensa 0,5ml de isopropanol en un microtubo de polipropileno. Con una torunda de
algodón se toman tres o cuatro colonias bien crecidas. Con la ayuda de la torunda
resuspendemos las colonias en el alcohol homogeneizando las células hasta que vemos que el
alcohol adquiere una coloración claramente visible. Antes de extraer la torunda, escurrimos el
exceso de líquido apoyando repetidas veces la torunda en las paredes del microtubo. La
torunda se desecha en un recipiente con lejía o en uno adecuado para esterilizarlo
posteriormente.
Añadimos un volumen igual de cloroformo, se agita el tubo hasta que aparecen las dos fases
claramente mezcladas. Con ayuda de una centrífuga de sobremesa separamos las fases.
En la fase superior aparece la fase de isopropanol totalmente transparente, en la interfase de
isopropanol-cloroformo aparecerán los restos celulares, y en la fase de cloroformo, éste
aparecerá visiblemente coloreado. Con ayuda de una pipeta eliminamos la fase de isopropanol
y los restos celulares. Quedándonos en la fase del cloroformo la prodigiosina.
ATENCIÓN: La manipulación del cloroformo debe llevarse a cabo con guantes y si es posible
bajo una campana de extracción o en un ambiente bien ventilado.
¿Por qué obtengo una coloración amarillenta?
Explicación: la prodigiosina tiene un cambio de color según el pH sea ácido o alcalino. Si
hacemos crecer S. marcescens en un medio sin azúcares, la metabolización de aminoácidos y
pequeños péptidos produce amonio. De modo, que al incorporar con un hisopo colonias en el
solvente hacemos que el solvente se alcalinice, y la solución de prodigiosina resultante tiende
a amarillear, con lo que el resultado es una solución de una coloración de amarilla a
anaranjada. Así por ejemplo, si obtenemos una solución anaranjada al acidularla ligeramente,
adquiere una coloración fucsia.
IDEAS: Se puede enlazar este cambio de color para recordar como funciona un indicador de
pH. Hágase crecer S. marcecens en una placa de TSA y en una placa de TSA más maltosa
(10g/l), y realícese la extracción del pigmento.
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¿Por qué dos tipos de extracción?
Explicación: La prodigiosina es más soluble en cloroformo que en isopropanol, lo cual nos sirve
para mostrar diferencias de solubilidad de una sustancia dada en diferentes solventes, y como
la hacemos pasar de una fase a otra.
Además nos sirve para explicar la mezcla de dos soluciones inmiscibles, y como es posible
separarlas por decantación (la centrifugación no deja de ser una decantación “acelerada”).
IDEAS: ¿podemos concentrar la prodigiosina usando un volumen menor de cloroformo? ¿Qué
pasa cuando el cloroformo se evapora?
Uso de un espectrofotómetro
Si se dispone de un espectrofotómetro puede hacerse un barrido del espectro para ver cuáles
son los picos de absorción de la prodigiosina según el pH.
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A menos de que se dispongan de cubetas de vidrio óptico, en las cubetas de plástico
desechable (comúnmente poliestireno) no deben usarse ni acetona ni cloroformo. La primera
nos blanqueará la cubeta, y el segundo nos acabará solubilizando el plástico.
¿Cómo es posible hacer la lectura? Se puede hacer una dilución 1:10 de la prodigiosina
disuelta en acetona en isopropanol, y con esta solución hacer la medición en el
espectrofotómetro.
Ilustración 4. Pico de absorción a 536nm con la “prodigiosina fucsia”.
Ilustración 5. Pico de absorción a 466nm con la “prodigiosina amarilla”.
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Producción de bioluminiscencia.
INTRODUCCIÓN
La bioluminiscencia es una característica común en varias especias de bacterias marinos, como
las del género Vibrio. Aliivibrio fischeri y Vibrio harveyi son dos especias de vibrionaceas que
regulan su bioluminiscencia a través de un mecanismo que se conoce como “quórum sensing”.
El proceso de “quórum sensing” o detección de quórum seria análogo a la comunicación entre
células y fue observado por primera vez en 1977 en A. fischeri, una bacteria Gram negativa que
vivo como un simbionte en ciertas especias de animales marinos. En ésta simbiosis el
hospedador aporta nutrientes a la bacteria y la bacteria, a cambio, genera luz que sirve al
animal por atraer presas, alejar depredadores y para otras actividades.
El “quórum sensing” implica a la producción y liberación de moléculas de comunicación, las
cuales se acumulan el ambiente que rodea las bacterias y permiten a las bacterias co-regular
fenotipos específicos (producción de luz o no) siempre que estas moléculas o autoinductores
sobrepasen un valor determinado de detección (la producción de luz es un feedback +).
La ausencia de autoinductores, no obstante, produce un paro en la producción de luz, y este
fenómeno ocurre cuantas las bacterias se encuentran en vida libre.
En 1984 se demostró que se necesitan dos componentes reguladores por dirigir el proceso de
bioluminiscencia en A. fischeri. Por un lado hay el gen Luxl, que codifica por la enzima AHL
sintasa, que interviene en la producción del acil homoserin lactona (AHL) y el gen LuxR, que
codifica una proteína reguladora de transcripción que al unirse a la AHL activa el operón de la
luciferasa.
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AHL
Medi extern
AHL sintasa
(Lux I)
Proteïna reguladora
(Lux R)
Activació dels gens
productors de llum
Lloc de
l’operador
Citoplasma
Las moléculas de AHL pueden difundir libremente a través de las membranas de las bacterias,
cuando el número de bacterias es elevada la concentración de AHL en el medio y en el interior
de las células se eleva. Cuando las moléculas de AHL se unen al LuxR se activan los genes que
intervienen en la generación de luz, y a la vez se activa la expresión del gen Luxl que genera
más AHL sintasa que genera más moléculas de AHL, cosa que favorece que más bacterias
produzcan luz.
La reacción de luminiscencia bacteriana es catalizada por la enzima luciferasa. Involucra la
oxidación de un aldehído de una larga cadena alifática y de un flavin mononucleótido reducido
(FMNH2) con la liberación de un exceso de energía libre forma de luz azulada a 490 nm.
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FMNH2 + RCHO + O2 ----> FMN + RCOOH + H2O + luz (490nm)
Ilustración 6. Pico de producción de luz a 490 nm.
Composición de medios
Medio de crecimiento
Cloruro de sodio
Cloruro de magnesio
Peptona bacteriológica
Sulfato de sodio
Cloruro de calcio
Extracto de levadura
Cloruro potásico
Bicarbonato sódico
Citrato férrico
Bromuro potásico
Cloruro de estroncio
Ácido bórico
Fosfato disódico
Silicato sódico
Fluoruro sódico
Nitrato amónico
19,400 g·L-1
8,8000 g·L-1
5,0000 g·L-1
3,2400 g·L-1
1,8000 g·L-1
1,0000 g·L-1
0,5500 g·L-1
0,1600 g·L-1
0,1000 g·L-1
0,0800 g·L-1
0,0340 g·L-1
0,0220 g·L-1
0,0080 g·L-1
0,0040 g·L-1
0,0024 g·L-1
0,0016 g·L-1
Medio de bioluminiscencia
Cloruro de sodio
27,260 g·L-1
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Fosfato disódico
Peptona bacteriológica
Extracte de carne
Fosfato sódico
15,500 g·L-1
2,8000 g·L-1
2,8000 g·L-1
2,0000 g·L-1
Medio de no bioluminiscencia
Cloruro de sodio
Fosfato disódico
Peptona bacteriológica
Extracto de levadura
Fosfato sódico
27,260 g·L-1
15,500 g·L-1
5,0000 g·L-1
5,0000 g·L-1
2,0000 g·L-1
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Antibiogramas y concentración mínima inhibitoria (CMI) en placa.
INTRODUCCIÓN
Se considera que las ideas más antiguas sobre el contagio (transmisión por contacto) de
enfermedades data de los antiguos egipcios, y en la Biblia ya se recogen referencias sobre
enfermedades contagiosas como la lepra. Palabras tales como pestilencia, peste, plaga eran
usadas en la antigüedad para hacer referencia a cualquier transmisión de tipo epidémica.
Hipócrates en su tratado sobre los vientos, atribuye al “mal aire” como el principal causante de
la enfermedad, estableciendo que cuando el aire está infectado con miasmas la gente
enferma.
Durante la Edad Media a raíz de las observaciones de las grandes epidemias ocurridas, cobró
nuevamente impulso la teoría del contagio.
En 1530, Hieronymus Fracastorius escribió Syphilis sive morbus gallicus (Sífilis o el mal francés).
Un poema cuyo protagonista, el pastor Sífilo, fue castigado por el dios Apolo, a quien había
ofendido, con la enfermedad venérea llamada entonces, por las tumefacciones y tumores que
provocaba, casi siempre mortales, mal de las bubas. La realidad parece indicar que la sífilis fue
contraída por marineros españoles en América a finales del siglo XV y que éstos la trajeron a
Europa, y que más tarde los marinos portugueses acabaron llevando a Asia.
Posteriormente, en 1545, Fracastorious publicó su tratado De contagione et contagiosis, en el
cual se establece por primera vez de forma científica la verdadera naturaleza del contagio, la
infección, los gérmenes y los modos de transmisión e infección de enfermedades. Definió el
contagio como una infección que se transmitía de un individuo a otro y lo consideraba
diferente a la corrupción, desestimando así la teoría del “mal aire”. Definió así mismo tres
formas de realizarse el contagio: por contacto, a través de fómites y a distancia (pestilencias) y
que diferentes gérmenes de enfermedades afectan diferentes órganos. Defendió la
inefectividad de la consumpción (tisis).
Un siglo después, la opinión más difundida continuaba siendo que las pestilencias eran
exhalaciones muy deletéreas que surgían de las emanaciones de las fermentaciones de las
heces de la tierra y eran transportadas por el viento, y era la exposición a estas emanaciones
las que producían la enfermedad.
No fue hasta la invención del microscopio a principio del siglo XVII hasta que no se dispuso una
base objetiva para fijar con claridad el agente responsable.
En los trabajos de Athanasius Kircher publicados en 1646 y sobretodo en su Scrutinium
physicomedicum publicado en 1658, Kircher indica que es factible observar seres vivos
microscópicos en las substancias en descomposición; inclusive se refiere a los efluvios como
seres vivos constituidos por pequeños e imperceptibles cuerpos vivos (effluvium animatum).
Las ideas de Kircher recibieron un fuerte apoyo por parte de Christian Lange el cual en su
Phatologia animata publicada en 1688 defendía que la producción de las enfermedades se
debía a la entrada de diminutos seres vivos en el cuerpo.
Aún así y a pesar de que mediante el uso del microscopio, tanto August Haupmann en 1657
como Michael Ettmüller demostraron que la sarna era producida por un ácaro; no fue hasta el
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advenimiento de la microbiología en que se acabara aceptando la idea de que seres
microscópicos fueran los causantes de las enfermedades.
Antibiograma.
En microbiología clínica el método empleado para determinar la susceptibilidad frente a
antibióticos se basa en el método recomendado por el NCCLS (Nacional Committee for Clinical
Laboratory Standars), que se basa en el método de Kirby-Bauer.
El método de Kirby-Bauer nos permite realizar un test de susceptibilidad por difusión en disco.
Un disco que tiene una cantidad específica de antimicrobiano se coloca sobre la superficie del
aguar inoculado con el microorganismo. El antibiótico difunde desde el disco al medio de
cultivo, creando un gradiente de concentración. Si el microorganismo es susceptible al
antibiótico se produce una zona de inhibición alrededor del disco. En el borde de la zona de
inhibición se alcanza la CMI que inhibe el crecimiento bacteriano. La zona de inhibición es
medida y se relaciona inversamente con la CMI. Dependiendo del tamaño del halo de
inhibición se clasifican en susceptibles al antibiótico, con susceptibilidad intermedia, o
resistentes.
Esta metodología se encuentra estandarizada para el estudio de Enterobacteriaceas,
Pseudomonas aeruginosas, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp.,
Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp.,
Vibrio cholerae. El agar Mueller-Hinton deshidratado se prepara de acuerdo a las indicaciones
del fabricante.
Disco de antibiótico
Zona de inhibición del crecimiento
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Preparación de un antibiograma
Preparación de una CMI rápida
Inocular
• Con una torunda se
inocula una placa de agar
en toda su superficie.
Colocar
discos
• Se colocan los discos de
antibióticos usando una
pinza esterilizada.
Incubar
• Se incuba a la temperatura
óptima del crecimiento de
la bacteria.
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Nomenclatura de antibióticos de acuerdo a la WHONET: antibiótico (Sigla)
Acido nalidíxico (NAL), amicacina (AMK), amoxilina (AMX), amoxicilina-clavulánico (AMC),
ampicilina (AMP), ampicilina-sulbactam (SAM), azitromicina (AZM), imipenem (IPM), azlocilina
(AZL), aztreonam (ATM), cefaclor (CEC), cefaloridina (CEF), cefalotina (CEP), cefazolina (CFZ),
cefepime (FEP), cefoperazona (CFP), cefotaxima (CTX), cefotaxima-clavulánico (CTC), cefoxitina
(FOX), ceftazidima (CAZ), ceftazidima-clavulánico (CCV), ceftriaxona (CRO), cefuroxima (CXM),
ciprofloxacino (CIP), claritromicina (CLR), clindamicina (CLI), cloranfenicol (CHL), colistina (COL),
doxicilina (DOX), eritromicina (ERI), estreptomicina (STR), estreptomicina de alta carga (STH),
furazolidona (FRZ), gentamicina (GEN), gentamicina de alta carga (GEH), imipenem (IPM),
levofloxacina (LVX), lomefloxacino (LOM), meropenem (MEM), minociclina (MINO),
nitrofuratoína (NIT), norfloxacino (NOR), oxacilina (OXA), ofloxacino (OFX), penicilina (PEN),
pefloxacín (PEF), piperacilina (PIP), piperacilina-tazobactam (TZP), rifampicina (RIF), sulfatiazol
(SLF), sulfixozazol (SOX), teicoplanina (TEC), tetraciclina (TCY), ticarcilina (TIC), trimetoprimasulfametoxazol (SXT), tobramicina (TOB), vancomicina (VAN).
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Lectura de un antibiograma:
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Aislamiento de bacterias halófitas.
INTRODUCCIÓN
La diversidad microbiana incluye tanto variaciones en el tamaño celular y morfología, como
diferencias en otros aspectos estructurales y adaptaciones a diferentes ambientes, entre ellos
los extremos.
Las comunidades microbianas pueden encontrarse en muchas condiciones adversas, como
temperatura, pH y salinidad, entre otras. Los microorganismos que habitan en estos ambientes
extremos son llamados extremófilos, y poseen características bioquímicas y metabólicas que
les permiten vivir en hábitats poco comunes, resultando ser microorganismos muy útiles para
el desarrollo de nuevos procesos biotecnológicos.
Los microorganismos que requieren sal para su crecimiento son llamados halófilos, sin
embargo, entre los no halófilos hay microorganismos capaces de crecer tanto en ausencia
como en presencia de sal, los cuales reciben el nombre de halotolerantes.
Entre los microorganismos halófitos, podemos distinguir entre halófilos débiles, como lo son la
mayoría de los organismos marinos (3% de NaCl); los halófilos moderados cuyo crecimiento
óptimo se encuentra del 3 al 15% (w/v) de sal; y halófilos extremos, que presentan un
crecimiento óptimo al 20-30% (w/v) de NaCl.
Si bien los ambientes hipersalinos están bastante extendidos por todo el mundo, los ambientes
extremadamente salinos son raros.
Aunque la composición iónica de estos ambientes salinos varía considerablemente. En los
lagos salados los iones que predominan son el sodio y el cloro, encontrándose cantidades
significativas de sulfatos y un ligero pH alcalino. En el Mar Muerto son el magnesio y el cloro
los iones predominantes. En los lagos carbonatados el pH predominante se sitúan entre 10 y
12, y además, el magnesio y el calcio están prácticamente ausentes, al producirse su
precipitación debido al pH alcalino.
Las salinas marinas son también buenos hábitats para los halófilos extremos. Las salinas son
aguas de mar estancadas, que se evaporan lentamente por la acción del sol. A medida que la
salina se aproxima a la concentración de sales que permitan el crecimiento de los halófilos
extremos, las aguas se vuelven de color rojizo, debido a que las bacterias halófitas suelen
presentar carotenoides y otros pigmentos, de modo que al aumentar el número bacterias
halófilas que crecen en este hábitat, las aguas toman coloraciones rojizas.
Si bien no se conoce muy bien la función de estos pigmentos, parece ser que tienen un efecto
de protección frente a la luz del sol.
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Un caso particular de halófitas extremas son las halobacterias, una arqueobacteria que posee
el pigmento fotosintético bacteriorodopsina el cual absorbe la luz y funciona como bomba de
protones, creando un gradiente para la síntesis de ATP.
Las sales que precipitan en las salinas y no se encuentran sometidas a procesos de refinado
suelen adquirir coloraciones rosadas debido a que durante el precipitado se dan fenómenos de
arrastre de bacterias.
También se han aislando halófilos extremos en alimentos con alta concentración de sal, como
salazones, salmueras y ciertas salsas.
Crecimiento de halófitos.
Como se ha comentado anteriormente, la concentración salina juega un papel selectivo en el
crecimiento de estos microorganismos, dado que imposibilita el crecimiento de
microorganismos no halotolerantes.
En nuestro caso realizaremos el aislamiento de aquellos microorganismos contenidos en sal
marina sin refinar. La ventaja de realizar estos aislamientos es que no se necesita disponer de
material previamente esterilizado, dado que las altas concentraciones de sal nos impedirán
que crezcan la mayoría de los microorganismos presentes en un laboratorio.
El procedimiento a seguir es bastante sencillo, en un vaso de precipitados de 2 litros se pesará
200g de sal marina sin refinar (ideal si es de color rosada-rojiza), 5 g de extracto de levadura,
5g de peptona bacteriológica y 2g de extracto de carne. Se añadirá 800ml de agua destilada (si
no se dispone de ella, puede dejarse desclorar 1 litro de agua de grifo dejándola en reposo
toda una noche). Se mantiene en agitación hasta la completa disolución y acabamos de
enrasar a 1 litro. Finalmente se distribuye en matraces que los hacemos crecer a temperatura
ambiente.
El aislamiento de las bacterias puede realizarse mediante siembra en agar; la preparación de
las placas, se realiza preparando de nuevo un caldo con la misma composición más 15 g de
agar-agar. Si no se dispone de autoclave, puede utilizarse una olla a presión; en caso de no
disponer de una, puede llevarse a ebullición la solución durante 10 minutos.