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Universidad de Puerto Rico
Recinto Rio Piedras
Resistencia al Acido Hipocloroso en
Vibrio fischeri
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
Maestría en Ciencias en Biología
GERTY PIERRE
Diciembre 2014
TABLA DE CONTENIDO
LISTAS DE FIGURAS .................................................................................................... iv LISTAS DE TABLAS ........................................................................................................v ABREVIATURAS .............................................................................................................v RESUMEN .........................................................................................................................1 INTRODUCCION .............................................................................................................2 1.1 Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) ........................................................................... 2 1.2 Fuentes Generadoras de Especies Reactivas de Oxigeno ................................................. 2 1.3 Efectos de las Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) en bacterias ................................. 3 1.4 Respuestas a estrés oxidativo ............................................................................................ 5 1.4.1 Sensores en la respuesta al estrés oxidativo .............................................................. 5 1.4.2 Desintoxicación de las EROs .................................................................................... 6 1.4.3 Reparación de daño oxidativo ................................................................................... 7 1.5 Interacción simbiótica entre Vibrio fischeri-Euprymna escolopes .................................... 8 1.5.1 El simbionte: Vibrio fischeri ..................................................................................... 8 1.5.2 El hospedero: Calamar sepiolide Hawaiano, Euprymna escolopes ......................... 10 1.5.3 Interacción simbiótica: V. fischeri- E. escolopes .................................................... 12 1.5.4 Ciclo diario de E. escolopes ................................................................................... 15 1.5.5 Bioluminiscencia y Simbiosis ................................................................................. 16 1.6 Especies Reactivas de Oxígeno en la Interacción Vibrio-Calamar ................................. 17 1.6.1 Óxido nítrico (NO) en el calamar ........................................................................... 17 1.6.2 Evidencia de Peróxido de Hidrógeno (H2O2) en el calamar .................................... 18 1.6.3 Evidencia de Acido Hipocloroso (HOCl) en el calamar ......................................... 18 Importancia de la Investigación .................................................................................................. 22 Pregunta de Investigación ...............................................................................................23 ii Objetivo General ..............................................................................................................23 Objetivos Específicos ................................................................................................................. 23 2 3 MATERIALES y METODOLOGIA ......................................................................25 2.1 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC). ...................................... 27 2.2 Tolerancia al acido hipocloroso (NaOCl). ...................................................................... 27 2.3 Producción de luz. .......................................................................................................... 27 2.4 Supervivencia a peróxido de hidrogeno (H2O2) .............................................................. 28 RESULTADOS .........................................................................................................29 3.1 Cepas de V. fischeri son sensitivas al ácido hipocloroso (NaOCl). ................................. 29 3.2 Genes lux son necesarios en la respuesta a NaOCl ......................................................... 30 3.3 Genes necesarios para supervivencia en peróxido también son necesarios en respuesta a
NaOCl 31 3.4 Ausencia de msrABC y katA induce bioluminiscencia en presencia de NaOCl .............. 32 3.5. Inducción de genes lux en V. fischeri por NaOCl ................................................................ 33 3.5 Genes lux están envueltos en la supervivencia a H2O2 de V. fischeri .............................. 35 4 DISCUSION ..............................................................................................................37 5 CONCLUSIONES ....................................................................................................44 6 TRABAJOS FUTUROS ...........................................................................................45 7. REFERENCIAS .......................................................................................................47 iii LISTAS DE FIGURAS
Figura 1: Generación de especies reactivas de oxígeno. .................................................... 3
Figura 2: Operón lux en Vibrio fischeri. . .......................................................................... 9
Figura 3: El hospedero Euprymna escolopes.. ................................................................. 11
Figura 4: Modelo contra-iluminación de Euprymna escolopes ...... Error! Bookmark not
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Figura 5: Proceso de colonización por Vibrio fischeri en el órgano de órgano luz de
Euprymna escolopes .................................................................................................. 15
Figura 6: Ciclo diario del calamar Euprymna escolopes.. ............................................... 16
Figura 7: Tolerancia a NaOCl en mutantes oscuros de Vibrio fischeri.. ......................... 31
Figura 8: Tolerancia al NaOCl en cepas msrABC de Vibrio fischeri............................... 32
Figura 9: Luminiscencia específica máxima en cepas Vibrio fischeri ............................. 33
Figura 10: Efecto de 1.25mM NaOCl en la luminiscencia especifica máxima en cepas de
Vibrio fischeri con promotor no nativo en los genes lux.. ......................................... 34
Figura 11: Supervivencia a H2O2 en cepas de Vibrio fischeri.......................................... 35
iv LISTAS DE TABLAS
Tabla 1: Genes envueltos en respuesta al HOCl ............................................................... 20
Tabla 2: Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo ....................................................... 25
Tabla 3: Determinación del MIC de NaOCl en cepas de V. fischeri ................................ 29
v ABREVIATURAS
V. fischeri: Vibrio fischeri
3-oxo-C6-HSL: N-3-oxo-hexanoilhomoserina lactona
E. Escolopes: Euprymna escolopes
C8-HSL: octanoil-L homoserina lactona
ERO: Especies Reactivas de Oxígeno
LuxAB: Luciferasa
HOCl: Ácido Hipocloroso
SOD: Dismutasa de superóxido
NaOCl: Hipoclorito de Sodio
HPO: Haluro peroxidasa
H2O2: Peróxido de hidrogeno
MPO: Mieloperoxidasa
-
O 2: Superoxido
Met: Metionina
NO: Oxido nítrico
Cys: Cisteína
•
OH: Radical hidroxilo
Msr: Reductasa sulfόxido de metionina
O2: oxigeno molecular
Kat: Catalasa
FMNH2: mononucleótido de flavina
reducido
FMN: mononucleótido de flavina
Ahp: Alkilo de hidroperóxido reductasa
UFC: Unidad formadora de colonia
oxidado
v RESUMEN
Vibrio fischeri es una bacteria bioluminiscente marina, que forma una simbiosis
específica con el calamar hawaiano, Euprymna escolopes. El calamar produce especies
reactivas de oxigeno, incluyendo ácido hipocloroso (HOCl), en respuesta a V. fischeri.
HOCl puede causar daño macromolecular y dar a lugar muerte celular. Hipotetizo que V.
fischeri posee genes que confieren resistencia a HOCl. Caractericé la respuesta a NaOCl
de varias cepas de V. fischeri. Cepas mutantes en los genes katA, msrABC, y luxC-G son
menos tolerantes al NaOCl. Algunos mutantes mostraron una mayor luminiscencia en
presencia de NaOCl, sugiriendo que la bioluminiscencia es inducida por NaOCl. Además,
demostré que los genes lux están envueltos en la supervivencia a H2O2. En conjunto, estos
resultados indican que V. fischeri posee genes que confieren resistencia a HOCl, algunos
de los cuales son importantes para una exitosa colonización del calamar.
Palabras claves: Vibrio fischeri, estrés oxidativo, HOCl, simbiosis, bioluminiscencia
1 INTRODUCCION
1.1
Especies Reactivas de Oxígeno (EROs)
La toxicidad de oxígeno está mediada principalmente por la reducción parcial de
oxígeno a especies reactivas de oxígeno (EROs) (revisado en, Imlay, 2013). Estas EROs
incluyen: superóxido (O-2), peróxido de hidrógeno (H2O2), óxido nítrico (NO), y ácido
hipocloroso (HOCl). Debido a su alta reactividad las EROs son nocivas para la célula ya
que pueden reaccionar con la mayoría de las macromoléculas e inactivar su función, por lo
que las células han evolucionado respuestas al estrés oxidativo para asegurar su
supervivencia (Imlay, 2013).
1.2
Fuentes Generadoras de Especies Reactivas de Oxigeno
Estas EROs son subproducto de la respiración aeróbica (Seaver y Imlay, 2004).
También son generadas por células inmunes como defensa contra invasiones microbianas
y en la mucosa epitelial (Collins et al., 2012; Ha et al., 2005; Winterbourn et al., 2006). El
O-2 se degrada de manera espontánea por dismutación o mediante la enzima superóxido
dismutasa (SOD) para convertirse H2O2 y oxígeno. H2O2 en presencia de iones metálicos
como Fe2+ o Cu+ puede reducirse y formar •OH, por la reacción Fenton (Cabiscol et al.,
2010). •OH reacciona instantáneamente con cualquier molécula, de la que abstrae un
átomo de hidrógeno para producir agua (Imlay, 2013). El óxido nítrico (NO) participa en
los procesos biológicos incluyendo la inmunidad innata, la transducción de señales y la
protección contra el estrés oxidativo (Fang, 2004). NO se genera a partir de un centro
hierro-azufre y un grupo hemo, (Fang, 2004), y puede actuar como un oxidante o puede
reaccionar con O-2 y H2O2 para generar peroxinitrito (ONOO-), que finalmente se
descompone a •OH (Wang et al., 2007). El ácido hipocloroso (HOCl) es una especie
2 reactiva de oxígeno antimicrobiana con alto potencial oxidante (Gray et al., 2013; Drazic
et al., 2013). HOCl, es generado por las células del sistema inmune (neutrófilos,
macrófagos) mediante la enzima mieloperoxidasa (MPO) en la presencia de H2O2 y un ion
de cloro (Gray et al., 2013; Drazic et al., 2013; Fig. 1).
Figura 1: Generación de especies reactivas de oxígeno. Mieloperoxidasa (MPO) y
Superóxido Dismutasa (SOD). Reducción parcial del oxígeno molecular (O2) en
superoxido (O-2). El O-2 se degrada mediante la enzima superóxido dismutasa (SOD) para
convertirse H2O2 y oxígeno. H2O2 en presencia de iones metálicos como Fe2+ o Cu+ puede
reducirse y formar •OH (reacción Fenton). •OH reacciona instantáneamente con cualquier
molécula, de la que abstrae un átomo de hidrógeno para producir agua. El HOCl se
produce mediante la enzima mieloperoxidasa por peróxido de hidrogeno (H2O2) y un ion
cloro (Cl-).
1.3
Efectos de las Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) en bacterias
EROs son moléculas bactericidas con un rol clave en el sistema inmunológico
(Collins et al., 2012; Ha et al., 2005; Winterbourn et al., 2006). Son nocivas para las
células ya que causan daños en una variedad de macromoléculas, incluyendo ADN,
lípidos y proteínas (Gray et al., 2013, Imlay, 2013; Cabiscol et al., 2010; Dukan et al.,
3 1996,). La toxicidad de H2O2 y O-2 es menor que HOCl y el radical hidroxilo (•OH) debido
a la estabilidad del enlace oxígeno-oxígeno en H2O2, y la carga negativa en O-2 le impide
atravesar membranas así como oxidar moléculas ricas en electrones (Imlay, 2013). El O-2
inactiva enzimas con centros de hierro-azufre (Fe-S) debido a su tendencia a ser
electrostáticamente atraído por el átomo de hierro en estos centros catalíticos (Imlay,
2013). El hierro liberado de estos centros dañados puede inducir mutagénesis (reacción
Fenton), por lo que la producción de O-2 está también relacionada con una alta tasa de
mutación (Imlay, 2013).
H2O2, aunque es menos reactivo que O-2, debido a su elevada capacidad de difusión
puede reaccionar con una gran cantidad de macromoléculas e inactivar su función (Imlay,
2013; Cabiscol et al., 2010). H2O2 puede oxidar las cadenas laterales de los amino ácidos
e inducir la introducción de grupos carbonilo (Stadtman y Levine, 2003). Generalmente,
estas modificaciones conllevan una alteración en la estructura de la proteína que conduce a
la pérdida de su función o su actividad, también se han descrito modificaciones reversibles
inducidas por H2O2 por ejemplo; la oxidación de metionina a sulfóxido de metionina y
ciertos estados de oxidación de residuos de cisteína (Levine et al., 2009; Drazic et al.,
2013;).
HOCl reacciona fácilmente con macromoléculas celulares y proteínas particularmente,
dando lugar a despliegues y oxidación de proteínas (revisado en Davies, 2005; Cabiscol et
al., 2010). Oxidación preferencial de los residuos de azufre en cisteína (Cys) y metionina
(Met) es una de las principales razones para la reducción de la viabilidad de las células
después de la exposición HOCl (Rosen et al., 2009; Winter et al., 2009). Sin embargo, los
mecanismos de protección activados por HOCl apenas comienzan a ser identificados.
4 1.4
Respuestas a estrés oxidativo
La respuesta al estrés oxidativo tiene varias partes: sensores que detectan el estado
redox de la célula, enzimas que desintoxican directamente las EROs, y sistemas de
reparación de daño oxidativo (revisado en Imlay, 2013).
1.4.1
Sensores en la respuesta al estrés oxidativo
En respuesta a estrés oxidativo las células activan rutas de transmisión de señales,
que incluyen factores de transcripción, que aumentan la expresión de genes que codifican
para proteínas antioxidantes y/o reparación de daño oxidativo (revisado en Imlay, 2013).
Esta respuesta es específica al ERO y tiene como función disminuir los niveles de EROs
así como reparar los daños producidos por estos oxidantes. En E. coli, se han identificado
y caracterizado dos factores de transcripción OxyR y SoxR que controlan la expresión de
genes en respuesta a H2O2 y O-2, respectivamente (Aslund et al., 1999; Zhen et al., 2001).
Estudios recientes han identificado factores de transcripción que responden a HOCl. Estos
incluyen HypT y NemR ((Drazic et al., 2013; Gebendorfer et al., 2012) en E. coli y en B.
subtilis OhrR y TrhI (Gray et al., 2013; Chi et al., 2011). HypT es un factor de
transcripción LysR, que protege a las células de E. coli específicamente del estrés por
HOCl al inducir genes implicados en la biosíntesis de Met y Cys, y la adquisición de
hierro (Drazic et al., 2013 Gebendorfer et al., 2012). HypT es activado por HOCl al oxidar
una Met sensible (Gebendorfer et al., 2012). NemR es un factor de transcripción que actúa
como sensor en respuesta al estrés por HOCl y utiliza el estado de oxidación de los
residuos de cisteína que son sensibles al HOCl (Gray et al., 2013). El factor sigma S
(RpoS) regula la respuesta a estreses en general (Park, et al., 2004; Yildiz y Schoolnik,
1998). Al unirse a la polimerasa de ARN, activa la expresión de genes que confieren
5 resistencia a varios tipos de estrés en algunas bacterias Gram-negativas, durante la fase
estacionaria (Park, et al., 2004; Yildiz y Schoolnik, 1998). Las bacterias V. vulnificus y V.
cholera utilizan rpoS para sobrevivir al estrés oxidativo causado por H2O2 (Park, et al.,
2004; Yildiz y Schoolnik, 1998). rpoS también es necesario para virulencia en varias
bacterias, incluyendo E. coli, S. typhimurium y V. cholerae (Park, et al., 2004; Yildiz y
Schoolnik, 1998).
1.4.2
Desintoxicación de las EROs
Una de las estrategias utilizadas por las bacterias para responder ante la exposición
a EROs es la producción de enzimas que remueven los mismos. La enzima superóxido
dismutasa (SOD) se encarga de mantener concentraciones no tóxicas de O-2 al catalizar la
reacción de dismutación de O-2 a H2O2 y O2 (revisado en Imlay, 2013). Por otro lado, las
enzimas catalasa (Kat) y reductasa de hidroperóxido de alquilo (Ahp) se encargan de
disminuir los niveles de H2O2 en la célula (revisado en Imlay, 2013). Kat cataliza la
descomposición de H2O2 a O2 y H2O (Seaver y Imlay, 2001). Esta enzima también juega
un papel en la resistencia al estrés por HOCl en algunas bacterias (Mahawar et al., 2011;
Maalej et al., 2006; Dukan y Touati., 1996). Ahp es una peroxirredoxina capaz de reducir
H2O2 y peróxidos orgánicos (Seaver et al., 2001). La expresión de kat y ahp están
reguladas por HOCl en muchas especies bacterianas (Gray. et al., 2013; Bodet et al.,
2012; Ceragioli et al., 2010), pero pocos experimentos han probado directamente si ahpC
protege las bacterias contra el estrés HOCl.
6 1.4.3
Reparación de daño oxidativo
Una proteína oxidada puede perder su función si el daño toma lugar en amino
ácidos directamente relacionados con actividad enzimática o estructura tridimensional
(Drazic et al., 2013; Davies, 2012; Cabiscol et al., 2010). La pérdida de la función ya sea
estructural o enzimática tiene como consecuencia un desequilibrio en el metabolismo
celular (Imlay, 2013; Cabiscol et al., 2010). La oxidación en proteínas resulta en
modificaciones en amino ácidos, centros de hierro-azufre, fragmentación de la cadena de
péptido y/o aumento en degradación (Davies, 2012). Metionina (Met) es uno de los
residuos más oxidables en las proteínas (Weissbach, et al., 2005). Se ha demostrado que la
oxidación de los residuos Met desempeñan un papel clave en la regulación de la
estructura, la función, y la actividad de las proteínas (Davies, 2012). Las reductasas de
sulfóxido de metionina (Msr) intervienen en la reparación de daño oxidativo al reducir
sulfóxido de metionina (Ezraty, 2005; Luo, 2009). Tanto bacterias asociadas a plantas o
animales requieren Msr para superar el estrés oxidativo, colonizar y persistir en su
hospedero (Ezraty, et al., 2005). H2O2, así como HOCl, oxida los grupos tiol de los
residuos de cisteína en las proteínas formando ácido sulfónico o enlaces de disulfuro con
otras cisteínas (Gray et al., 2013; Drazic et al., 2013). Debido a que la cisteína es el amino
ácido más implicado en la formación de centros de Fe-S, no es extraño que el tratamiento
de las bacterias con HOCl pueda conducir a su destrucción (Hurst et al., 1991; Drazic et
al., 2013). Curiosamente, la inducción mediada por EROs de los genes involucrados en la
reparación del daño de los centros Fe-S se ha observado en bacterias Gram-negativas
(Bodet et al., 2012; Gebendorfer, et al., 2012). El ADN es uno de los puntos más sensibles
a EROs resultando en mutagénesis (Imlay, 2013; Gray et al., 2013; Cabiscol et al., 2010).
7 Aunque, H2O2 y O2- no son capaces de dañar directamente el ADN, bacterias deficientes
en enzimas que desintoxican H2O2 o O2- muestran una alta tasa de mutación al ser tratadas
con estos oxidantes (Imlay, 2013; Drazic et al., 2013; Park et al, 2004). La reacción de
ADN con HOCl resulta la formación de cloraminas, que pueden conducir a la disociación
de la doble hebra de ADN y la interrupción de la formación de enlaces de hidrógeno (Gray
et al., 2013; Drazic et al., 2013; Gebendorfer et al., 2012). Las bacterias tienen una
respuesta bien estudiada y compleja al daño del ADN, que incluyen los sistemas de
recombinación homóloga, reparación de nucleótidos dañados y polimerasas de ADN
(Gray et al., 2013). Hay evidencia de que la recombinación homóloga podría desempeñar
un papel en la respuesta al HOCl (Dukan y Touati, 1996). Mutantes de recA, un factor
esencial para la recombinación homóloga, son más sensibles a HOCl en condiciones
aeróbicas, especialmente en combinación con mutaciones en otros factores de resistencia a
EROs (Dukan et al., 1999; Dukan y Touati, 1996; Gebendorfer et al., 2012). Estos
resultados sugieren que HOCl puede causar daño en el DNA y producir roturas en la
cadena del mismo y un importante contribuyente a la alta toxicidad del HOCl (Gray et al.,
2013; Drazic et al., 2013).
1.5
1.5.1
Interacción simbiótica entre Vibrio fischeri-Euprymna escolopes
El simbionte: Vibrio fischeri
V. fischeri es una bacteria marina Gram-negativa, que se encuentra en aguas
templadas y subtropicales. Esta bacteria pertenece a la familia Vibrionaceae, que contiene
especies que forman interacciones beneficiosas y patógenas (Nyholm et al., 2000). V.
fischeri forma una simbiosis específica con el calamar E. escolopes. V. fischeri comprende
8 menos del 0.1% de la población total de bacterias en el agua de mar donde habitan los
calamares (Lee y Ruby, 1992), sin embargo, este es el único organismo que se encuentra
en el órgano de luz del calamar (Ruby, 1996). La bioluminiscencia, es un factor esencial
de colonización (Visick et al., 2000), y es codificada por genes en el operón lux (Fig.2;
Gray y Greenberg, 1992). La bioluminiscencia se genera cuando luciferasa, compuesta por
LuxA y LuxB, se une a FMNH2, O2, y un aldehído alifático para convertirlos en FMN,
agua, un ácido alifático, y energía libre en la forma de luz azul-verde a 490nm (Boylan et
al., 1989; Gray y Greenberg, 1992). La reacción de bioluminiscencia que se produce en V.
fischeri es:
Figura 2: Operón lux en Vibrio fischeri. El operón lux está compuesto por los genes
luxICDABEG. Los genes luxA y luxB codifican luciferasa; luxI codifica una proteína que
cataliza la síntesis del Autoinductor (AI) y el gen regulador luxR. Los genes luxC, luxD y
luxE codifican las enzimas que forman parte en la síntesis del aldehído alifático de cadena
larga. Las flechas indican la dirección de la transcripción. En los cuadros aparecen los
genes y su posición en el operón lux. Líneas y corchetes indican funciones de algunos
genes.
9 V. fischeri es un modelo valioso para el estudio de comunicación célula-célula, el
cual regula la bioluminiscencia (Hastings y Greenberg, 1979). En V. fischeri, la señal de
acil-homoserina-lactonas (acil-HSL) es sintetizada por la proteína LuxI y detectada por la
proteína LuxR (Dunlap et al., 1995). A bajas densidades celulares la señal es producida a
un nivel bajo (Dunlap et al., 1995). A medida que aumenta la densidad celular, la señal se
acumula hasta alcanzar una concentración umbral, que al unirse con LuxR induce la
transcripción del operón lux (Fuqua et al., 1996).
1.5.2
El hospedero: Calamar sepiolide Hawaiano, Euprymna escolopes
Euprymna escolopes pertenece al filo Molusca de la clase Cefalópoda y se
encuentra en la costa de Hawái. Son depredadores nocturnos que se entierran en la arena
durante el día y salen durante la noche para alimentarse y parearse (Boettcher et al., 1996).
En su etapa adulta pueden alcanzar aproximadamente 5 cm de longitud (Fig. 3B). El
calamar tiene una estructura especializada situada en la cavidad del manto, llamada órgano
de luz, que fomenta el crecimiento de V. fischeri (Fig. 3A; McFall-Ngai y Ruby, 1991). Se
cree que el calamar utiliza la bioluminiscencia bacteriana como camuflaje para evadir a
depredadores. Este fenómeno es conocido como contra-iluminación, en el que el calamar
emite luz hacia abajo haciendo coincidir la luminiscencia con la intensidad de la luna y así
ocultar su silueta de los depredadores (Fig 4; Harper y Case, 1999; Jones y Nishiguchi,
2004). Algunos depredadores incluyen, lagartos (familia Synodontidae), barracudas
(género Sphyraena) y la foca monje de Hawaii (Monachus schauinslandi) (Jones y
Nishiguchi, 2004).
10 A
B
Figura 3: El hospedero Euprymna escolopes. (A). El órgano de luz, representado por la
flecha (roja), McFall-Ngai y Ruby. (B). El calamar sepiolide hawaiano E. escolopes,
imagen de Chris Frazee.
Figura 4: Modelo contra-iluminación de Euprymna escolopes. Basado en la estructura del
órgano de luz, se cree que Euprymna escolopes colonizado con Vibrio fischeri puede
ocultar su silueta al controlar la emisión de luminiscencia, mientras que un aposimbiótico
(que carecen de simbiontes) proyectaría una sombra. Imagen cortesía de Eric Stabb.
11 1.5.3
Interacción simbiótica: V. fischeri- E. escolopes
Esta simbiosis es un sistema modelo de los procesos de colonización y persistencia
en interacciones microbio-hospedero y el efecto de los microbios en el desarrollo del
hospedero (Montgomery y McFall-Ngai, 1998). Al igual que en otras interacciones
animal-bacteria, V. fischeri infecta persistentemente al hospedero sin causar enfermedad
(McFall-Ngai y Ruby, 1999).
Esta
relación
simbiótica
tiene
unas
características
que
la
hacen
experimentalmente manejable (revisado en Stabb, 2006):
i)
Ambos organismos se pueden mantener por separado en el laboratorio.
Los calamares pueden completar su ciclo de vida en cautiverio. Su pequeño
tamaño, aproximadamente 5 cm, permite utilizar acuarios pequeños. Una
hembra típica puede producir 500-1000 huevos durante su vida reproductiva,
de 2-6 meses, en el laboratorio. Los calamares juveniles adquieren a V. fischeri
del ambiente, por transmisión horizontal.
La bacteria V. fischeri es cultivable, con un tiempo de generación de 20
minutos.
ii)
El genoma de V. fischeri está disponible y la bacteria es genéticamente
manipulable. Lo que permite la fácil introducción y manipulación de genes,
que se practican comúnmente en el laboratorio.
iii)
Podemos reconstituir la interacción en el laboratorio. V. fischeri no está
presente en los huevos de los calamares, los juveniles la adquieren mediante
12 transmisión horizontal, lo que permite establecer una simbiosis controlada en el
laboratorio.
Especificidad de la interacción Vibrio-calamar:
El proceso de colonización ocurre una sola vez a través de transmisión horizontal es
altamente específico y contiene una serie de pasos más específico uno al otro (McFallNgai y Ruby, 1991; Fig.5). V. fischeri, también infecta persistentemente al calamar sin
causar enfermedad, lo cual es mas típica de las interacciones bacteria-animales (Nyholm y
McFall-Ngai, 2004). El proceso de la colonización ocurre una sola vez (Nyholm et al.,
2000). El calamar tiene el órgano emisor de luz localizado en el centro de la cavidad del
manto debajo del saco de tinte (Fig. 5A). Cada medio segundo el calamar juvenil ventila
alrededor de 1.3µl de agua de mar ambiente a través de su cavidad del manto (Nyholm et
al., 2000).
i) Una vez nascen los calamares juveniles, adquieren a V. fischeri en el ambiente
por transmisión horizontal (Nyholm et al., 2000; Nyholm y McFall-Ngai,
2003);
ii) Los apéndices del órgano de luz están expuestos al agua de mar, al percibir
peptidoglícano, componente de la pared celular bacteriana, los apéndices
secretan una mucosidad alrededor de los poros del órgano de luz, donde células
viables de V. fischeri se adhieren para formar un agregado (Nyholm et al.,
2002; 2000);
iii) El calamar produce una sustancia que es la quitina desde las criptas del órgano
de luz que atrae a V. fischeri, solo bacterias viables y motiles de V. fischeri son
13 capaces de migrar hacia los poros y los ductos del órgano de luz de E.
escolopes y V. fischeri utiliza sus flagelos para migrar al órgano de luz,
(DeLoney-Marino et al., 2003; Nyholm y McFall-Ngai, 2004);
iv)
Horas después de entrar en estas criptas, las bacterias han provocado cambios
dramáticos en el desarrollo del hospedero, incluyendo la regresión de
apéndices en la superficie del órgano de luz (Doino y McFall-Ngai, 1995;
Foster y McFall-Ngai, 1998).
v)
Una vez que la bacteria coloniza el órgano de luz, el mantenimiento de este
socio bacteriano bioluminiscente es importante tanto, para la supervivencia del
calamar que ha evolucionado un órgano especial en el centro de su cavidad del
cuerpo para promover el crecimiento de las bacterias y el control de la emisión
de luz (McFall-Ngai, 1999; Visick y McFall-Ngai, 2000).
vi)
Además, aun estrechamente relacionados, el calamar Euprymna escolopes
puede infectarse por cepas de V. fischeri aisladas de otras especies de
calamares estrechamente relacionados (Visick et al., 2000). Cepas non-nativas
pueden colonizar a los calamares y están fuera de competencia, cuando los
animales están expuestos a cepas nativas (Nishiguchi et al., 1998; Visick et al.,
2000). Por lo tanto, el calamar puede seleccionar entre diferentes cepas de V.
fischeri y encontrar las simbiontes adecuadas (Nishiguchi et al., 1998).
vii)
En una vez estén en los conductos y los espacios de las criptas células de V.
fischeri deben soportar un ambiente oxidativo severo (Weis et al., 1996; Small
and McFall-Ngai, 1999; Davidson et al., 2004), y esta capacidad para tolerar el
14 estrés oxidativo puede ser una clave para la especificidad estricta de la
simbiosis. Figura 5: Proceso de colonización por Vibrio fischeri en el órgano de órgano luz de
Euprymna escolopes. (A). Imagen del calamar juvenil. Estructura en el medio es el saco
de tinte con el órgano de luz. (B). Ampliación del saco de tinte y el órgano de luz. Los
apéndices del órgano de luz están expuestos al agua de mar. Las bacterias V. fischeri
(Verde) entran al órgano de luz por los poros (aberturas), luego pasan a través de los
ductos. Sólo las bacterias flageladas, como Vibrio fischeri, pueden nadar dentro de él y
llegar al interior. Una vez se alojen en las criptas pierden sus flagelos y colonizan. Figura
modificada de Norsworthy y Visick, 2013.
1.5.4
Ciclo diario de E. escolopes
Cada mañana, el 95% de las células de V. fischeri son expulsadas del órgano de
luz, el 5% restante se multiplica a lo largo del día, de modo que el órgano de luz se vuelve
a llenar para el tiempo que el animal reanuda su comportamiento nocturno (Boettcher y
McFall-Ngai, 1996; Nyholm y McFall-Ngai, 1998; Fig. 6). Por lo tanto, existe un ciclo
diario de proliferación del simbionte, expulsión, y de nuevo crecimiento bacteriano que
15 está apoyado por los nutrientes suministrados por el tejido del hospedero (Lee y Ruby
1994b). Como resultado de esta expulsión diurna, hay una alta población de V. fischeri en
los hábitats ocupados por E. escolopes (Lee y Ruby, 1994a), afectando la abundancia
relativa y distribución geográfica del simbionte bacteriano (Ruby y Lee, 1998).
Figura 6: Ciclo diario del calamar Euprymna escolopes. El calamar es nocturno y sale a
cazar en la noche. En la madrugada el calamar expulsa el 95 % de bacterias (verde) en el
órgano de luz al medio ambiente. El calamar se entierra debajo de la arena (rectángulo
marrón) y durante el día el 5% restante de bacterias en el órgano de luz se reproducen. Al
llegar la noche el órgano de luz del calamar está lleno de V. fischeri y la bioluminiscencia
producida es utilizada por el calamar como camuflaje. Líneas debajo del calamar
representan la dirección de la bioluminiscencia producida por V. fischeri.
1.5.5
Bioluminiscencia y Simbiosis
La producción de bioluminiscencia por luciferasa (LuxAB) es necesaria para la
colonización del órgano de luz por el V. fischeri (Visick et al., 2000). La bioluminiscencia
16 producida por V. fischeri es altamente inducida durante colonización simbiótica, al
compararse con la bioluminiscencia producida en cultivo, sugiriendo que señales del
calamar inducen la bioluminiscencia en V. fischeri (Boettcher y Ruby, 1990). De acuerdo
con estos resultados, los componentes de luciferasa son la primera y la tercera proteínas
más abundantes en células simbióticas de V. fischeri (Schleitcher, et al., 2011). Debido al
consumo de oxígeno por LuxAB, se ha planteado la hipótesis de que la producción de la
luz protege a V. fischeri de EROs derivadas del hospedero (Ruby, y McFall-Ngai, 1999).
1.6
Especies Reactivas de Oxígeno en la Interacción Vibrio-Calamar
El calamar produce especies reactivas de oxígeno en respuesta a V. fischeri,
incluyendo óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogeno (H2O2) y ácido hipocloroso (HOCl)
(Small, et al., 1999; Wang 2010 Heath-Heckerman y McFall-Ngai, 2011).
1.6.1
Óxido nítrico (NO) en el calamar
Al igual que el sistema inmune de los mamíferos, el calamar produce NO un ERO
implicado en procesos biológicos incluyendo la inmunidad innata y señalización
(Davidson, 2004; Cary et al., 2006). NO se genera a partir de un centro hierro-azufre y un
grupo hemo, de manera endógena durante la reducción de nitrito, y/o de forma exógena
por las defensas del hospedero (Fang, 2004). NO se produce durante las primeras etapas
de la asociación simbiótica entre el calamar y V. fischeri, no sólo como un determinante de
especificidad, sino también como una señal simbiótica (Davidson, et al., 2004).
Flavohemoglobina (hmp), de V. fischeri protege contra el NO, tanto en cultivo como
durante la colonización (Wang et al., 2010). Según los estudios presentados por Wang et
al., 2010, demuestran que en el órgano de luz del calamar NO actúa como una molécula
17 de señal que prepara a las células simbiontes para sobrevivir mejor en el órgano de luz y
también es necesario para el desarrollo del tejido del hospedero.
1.6.2
Evidencia de Peróxido de Hidrógeno (H2O2) en el calamar
Se detectó la presencia de proteínas envueltas en la respuesta al estrés de peróxido
(AhpC, TrxB, Bcp, KatA y peroxidasa de tiorredoxina) en células simbióticas de V.
fischeri (Schleicher TR et al., 2011). Donde AhpC es la quinta proteína más abundante y
la más abundante en respuesta a estrés. Además, V. fischeri posee una catalasa (katA)
necesaria para la supervivencia a H2O2 y competitividad simbiótica (Visick y Ruby,
1998). Esto sugiere que V. fischeri está expuesto a H2O2 durante interacción con el
calamar.
1.6.3
Evidencia de Acido Hipocloroso (HOCl) en el calamar
En el órgano de luz se ha encontrado una alta abundancia de ARNm con 30% de
similitud a haluro peroxidasa (HPO; Tomarev et al., 1993). Mieloperoxidasa (MPO) es un
tipo de HPO producida por neutrófilos que tiene un rol importante en el sistema inmune
innato (Klebanoff et al., 1991). Esta enzima cataliza la conversión de peróxido de
hidrógeno y un ion de cloro a ácido hipocloroso (Klebanoff et al., 1991). En los tejidos del
calamar, la actividad de HPO se detectó en el órgano de luz, branquias, bolsa de tinta
incluyendo la glándula de tinta (Heath-Heckman et al. 2011). Según Small y McFall-Ngai,
1999, la abundancia de HPO en el órgano de luz es parte de una estrategia que el calamar
utiliza contra las bacterias no deseadas y que permite la colonización especifica del
simbionte en el órgano de luz.
18 En conjunto, estos estudios sugieren que V. fischeri está expuesto a diferentes
EROs durante la interacción con el calamar y que la respuesta al estrés oxidativo es
necesaria para colonizar exitosamente el órgano de luz. Sin embargo, se desconoce los
mecanismos de resistencia al HOCl en V. fischeri. Durante la simbiosis entre el calamar
Euprymna escolopes y la bacteria Vibrio fischeri, el calamar produce ácido hipocloroso en
respuesta a V. fischeri, por lo que formulé la pregunta: ¿Cómo V. fischeri sobrevive al
estrés causado por el ácido hipocloroso (HOCl)?
En otras bacterias Gram-negativas genes en la respuesta a estrés oxidativo también
son necesarios para la supervivencia a HOCl (Romsang et al., 2013; Chi, et al., 2011;
Rosen et al., 2009; Barth et al., 2009; Maalej et al., 2006; Dukan y Touati, 1996). La
mayoría de estos genes se encuentran en V. fischeri (Tabla 1).
El objetivo general de este trabajo fue: Identificar y caracterizar genes de Vibrio
fischeri envueltos en la respuesta al estrés causado por el ácido hipocloroso. Para esto se
formulo los siguientes objetivos específicos: i) determinar la concentración mínima
inhibitoria (MIC) del ácido hipocloroso (NaOCl) en la cepa tipo salvaje, Vibrio fischeri
ES114; ii)
determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) de ácido hipocloroso
(NaOCl) de mutantes en la respuesta al estrés oxidativo de Vibrio fischeri y por último iii)
Caracterizar las cepas mutantes sensitivos a NaOCl. Encontrar genes responsables de la
resistencia a HOCl es importante para entender interacciones microbio-hospedero.
19 Tabla 1: Genes envueltos en respuesta al HOCl
Gen
Microorganismo
Función
Homólogo
Referencias
en V. fischeri
kat
E. coli, H. pylori, S.
Catalasa
VF_A0009
aureus
Dukan et al.
1996; Maalej et
al. 2006 ;
Mahamar et al.
2011
ahpC
S. aureus
Peroxidasa
VF_1975
Maalej et al.
2006
trx
S. aureus
reductasa
msr
tiorredoxina
VF_0902
reductasa
Maalej et al.
2006
E. coli, B. subtilis,
reductasa de
VF_0331,
Boschi-Mulle y
B. cereus, B.
sulfóxido de
VF_0914,
Branlant G,
cenobepacia y P.
metionina
VF_A0005
2008 ; Rosen H
aeruginosa
et al. 2009 ;
Maalej et al.
2006 ; Mahawar
et al. 2012,
Romsang et al.
2013
dps
metE
E. coli, B. subtilis,
Protección de
B. cereus, B. aureus
DNA
B. subtilis, B.
sintasa de
megaterium, B.
metionina
ausente
Dukan y
Touati, 1996
VF_1721
Chi, et al. 2011
VF_1545
Drazic et al.
pumilus, and B.
amyloliquefaciens
hypT
E.coli
Factor
transcripción
oxyR
E. coli
Factor
2013
VF_1974
Dukan y Touati,
20 transcripción
VF_2299
1996, Chi, et
al.2011
ycfR
E. coli, S. enterica
Factor
ausente
Wang, 2010
VF_2438
Small D, et al.
transcripción
nemR
E. coli, B. subtilis,
Factor
B. cereus, B.
transcripción
2007, Gray, et
cenobepacia y P.
al. 2013
aeruginosa
spx
B. subtilis, cereus
Factor
ausente
Chi, et al.2011
ausente
Peeters E, et al.
transcripción
ohrR
B. subtilis, cereus,
Factor
cenocepacia
transcripción
2010; Chi BK,et
al.2011
arcA
E. coli, S. enterica
Regulador de
VF_2120
respuesta
Albrich,
Mahawar M. et
al. 2012,
Morales et al.
2012
recN
hsp33
recA
rpoS
E. coli (0157:H7),
Enzima de
P. aeruginosa
recombinación
B. subtilis, cereus
Proteína de
V. cholerae
choque térmico
E. coli, L.
Enzima de
pneumophila
recombinación
E. coli, B. subtilis
Factor sigma S
VF_1998
Rosen H et al.
1990
VF_2477
Wholey, 2012
VF_0535
Dukan y Touati,
1996
VF_2067
Dukan y Touati,
1996
ompW
Salmonella enterica
Proteína de la
serovar T.
membrana
VF_1954
Morales, et al.
2012
externa
21 Importancia de la Investigación
Todos los animales están asociados con microorganismos que contribuyen a la salud y
desarrollo del hospedero (McFall-Ngai, 1994; Darveau et al., 2003). La simbiosis mutualista
entre el calamar E. escolopes y la bacteria V. fischeri ofrece una oportunidad única para
estudiar las interacciones microorganismo-hospedero dentro de un ambiente natural (McFallNgai, 1999; Visick y McFall, 2000). V. fischeri es la única especie bacteriana que logra
colonizar el órgano de luz del calamar, lo que se sugiere que simbiontes competentes expresan
factores necesarios para supervivencia y persistencia dentro del calamar (Schleicher y
Nyholm, 2011). Se ha demostrado que el calamar produce HOCl en respuesta a V. fischeri
(Small and McFall-Ngai, 1999; Weis et al., 1996, Heath-Heckerman, et al., 2012). HOCl es
uno de los más potentes agentes antimicrobianos capaz desnaturalizar las proteínas (Gray, et
al., 2013; Parker, et al., 2013). Sin embargo, se desconoce cómo V. fischeri sobrevive al estrés
causado por HOCl. Entender las respuestas ante HOCl en bacterias es importante para la
comprensión de las interacciones entre bacterias y el sistema inmune de hospederos. Además,
los mecanismos relacionados a la especificidad de esta simbiosis, nos ayudará a entender
problemas tales como el resurgimiento de enfermedades a los hospederos, la aplicación
efectiva de los probióticos, la reacción del sistema inmune a las bacterias comensales y efectos
negativos a los antibióticos. El trabajo descrito en esta tesis proporcionará información sobre
las funciones de algunos genes en V. fischeri envueltos en el estrés oxidativo y la
bioluminiscencia. Además, Los resultados ayudarán a ampliar el conocimiento de algunos
mecanismos que las bacterias utilizan para responder ante los daños causados por el estrés
oxidativo.
22 Pregunta de Investigación Durante la simbiosis entre el calamar Euprymna escolopes y la bacteria Vibrio fischeri, el
calamar produce ácido hipocloroso en respuesta a V. fischeri, por lo que formulé la
pregunta: ¿Cómo V. fischeri sobrevive al estrés causado por el ácido hipocloroso (HOCl)?
Objetivo General
Identificar y caracterizar genes de Vibrio fischeri envueltos en la respuesta al estrés
causado por el ácido hipocloroso.
Objetivos Específicos
Objetivo #1: Determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) del ácido hipocloroso
(NaOCl) en la cepa tipo salvaje, Vibrio fischeri ES114.
En este objetivo se determinó la concentración mínima de NaOCl que inhibe el
crecimiento de V. fischeri ES114, luego de ser sometida a diferentes concentraciones de
NaOCl.
Objetivo #2: Determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) de ácido hipocloroso
(NaOCl) de mutantes en la respuesta al estrés oxidativo de Vibrio fischeri.
En este objetivo se determinó la concentración mínima de NaOCl que inhibe el
crecimiento de cepas mutantes en la respuesta al estrés oxidativo de Vibrio fischeri, con el
fin de determinar sensitividad de los mutantes al NaOCl.
23 Objetivo #3: Caracterizar las cepas mutantes sensitivos a NaOCl.
En este objetivo se caracterizaron las cepas mutantes sensitivas a NaOCl, identificadas en
el objetivo 2. Decidí enfocarme en mutantes en los genes lux, katA, y msrABC, ya que
estudios previos demostraron que estos genes son importantes en la respuesta a estrés
oxidativo y relación simbiótica con el calamar (Visick, 1998; Flores-Cruz y Stabb, en
preparación). Para determinar si estos genes también son importantes en la respuesta a
NaOCl, se realizó una serie de experimentos con el objetivo caracterizarlos: i) determinar
la tolerancia a NaOCl; ii) cuantificar el efecto de NaOCl en la bioluminiscencia específica
de estas cepas; iii) cuantificar la supervivencia al peróxido de hidrógeno (H2O2) de estos
mutantes.
24 2
MATERIALES y METODOLOGIA
Las cepas utilizadas en este estudio se encuentran en la Tabla 2. Todas las cepas de V.
fischeri fueron cultivadas en medio LBS (10g triptona, 5g extracto de levadura, 20g NaCl,
y 50mM Tris (pH 7.4-7.5); Dunlap et al., 1989) o SWTO (5g triptona, 3g extracto de
levadura, 6mL glicerol en 700mL de Océano Instantáneo (Instant Ocean, Marineland,
Cincinnati, OH, U.S.A)) a 36 ppt, 300mL agua y 5M NaCl hasta llegar a 43ppt; Boettcher
y Ruby, 1990)).
Tabla 2: Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo
Cepa
Genotipo
Descripción
referencias
ES114
Tipo salvaje
Aislada de calamar
Boettcher y Ruby, 1990
EVS102
∆luxC-G
Mutante oscuro
Bose et al., 2007
ANS10
katA::erm
Inserción en gen catalasaA
Flores-Cruz-Z y Stabb, EV,
en preparación
ZF7
∆msrABC
Deleción de genes A,B y C Flores-Cruz-Z y Stabb, EV,
de Reductasa de sulfόxido de en preparación
metionina
ANS11
ZF14
katA::erm,
Inserción en gen catalasaA, Flores-Cruz-Z y Stabb, EV,
∆luxC-G
mutante oscuro
katA::erm,
Inserción en gen catalasaA, Flores-Cruz-Z y Stabb, EV,
∆msr ABC
Deleción de genes A,B y C en preparación
en preparación
de reductasa de sulfόxido de
metionina
25 1920
bcp::miniTn5
Inserción de mini Tn5 en gen
de peroxidasa
0902
trxB::miniTn5
Inserción de mini Tn5 en gen
der
reductasa
de
Tiorredoxina B
0909
trxC::miniTn5
Inserción de mini Tn5 en gen
de Tiorredoxina C
0783
ybbN::miniTn5
Inserción de mini Tn5 en gen
tiorredoxina
2067
rpoS::miniTn5
Inserción de mini Tn5 en gen
de Factor sigma S
JB22
LG1
ES114
lacIq Reemplazo
del
promotor Bose et al., 2008
PA1/34-
nativo del operón lux con
luxCDABEG
uno inducible IPTG
ES114
lacIq JB22/ Inserción en el gen de Flores-Cruz,
PA1/34-
catalasa
Z.,
en
preparación.
luxCDABEG,k
atA::erm
26 2.1
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC).
Para determinar el MIC a NaOCl se utilizó el método de macrodilución en líquido
utilizado por Carson et al., 1995. Se inocularon las cepas en 3mL de LBS por 8 horas a
28ºC y 200rpm. Se diluyeron 1:1000 y se incubaron nuevamente de 12-18 horas a 28ºC y
200rpm. Se midió la densidad óptica del cultivo por un espectrómetro UV-Visible
(Thermo Scientific BioMate 3S, Madison, WI, U.S.A), a un largo de onda de 600nm y se
calculó el inoculo inicial para una densidad óptica final de 0.1. Las concentraciones de
NaOCl (Acros Organics, New Jersey, USA) utilizadas fueron 5.67, 2.94, y 1.5 mM. Se
determinó el crecimiento de las cepas por turbidez luego de incubación de 12-18 horas a
28ºC y 200 rpm.
2.2
Tolerancia al acido hipocloroso (NaOCl).
Luego de una incubación de 8 horas a 28ºC y 200 rpm en LBS, los cultivos fueron
diluidos 1:1000 y se incubaron nuevamente por 12-18 horas a 28ºC 200rpm. Se midió la
densidad óptica y se calculó el inoculo para un O.D.600 final de 0.1 en SWTO en presencia
y ausencia de 1.25 y 1.21 mM NaOCl. Se midió la densidad óptica (O.D.600) de los
cultivos incubados a 24ºC y 200rpm cada media hora por 10 horas.
2.3
Producción de luz.
Al mismo tiempo se cuantificó la bioluminiscencia de cada cepa en cultivo, en
presencia y ausencia de 1.21 y 1.25mM NaOCl. La luminiscencia se midió mediante un
luminómetro de Promega GloMax 20/20 (Sunnyvale, CA, USA). La luminiscencia se
normalizó con la densidad óptica OD600 (Boettcher y Ruby, 1990; Lee y Ruby, 1992).
27 2.4
Supervivencia a peróxido de hidrogeno (H2O2)
La supervivencia a H2O2 se determinó utilizando células en crecimiento logarítmico
creciendo en SWTO a 24°C y 200 rpm. Las células fueron centrifugadas, lavadas y resuspendidas en 1mL de Océano Instantáneo (36 ppt) estéril y diluidas a un O.D.600 de 0.1.
La supervivencia se determinó al calcular las unidades formadoras de colonias (UFC)
antes y después de exponer las células a H2O2 por 10 min. Las reacciones con H2O2 fueron
detenidas al añadir catalasa exógena.
28 3
RESULTADOS
3.1
Cepas de V. fischeri son sensitivas al ácido hipocloroso (NaOCl).
Se ha demostrado en muchas bacterias como E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa y H.
Pylori tienes genes que confieren resistencia a HOCl (Tabla 1). Muchos de estos genes
están presentes en el genoma de V. fischeri. Para determinar si estos genes también son
necesarios para la respuesta a NaOCl en V. fischeri, estudiamos la sensitividad a NaOCl
en diferentes cepas mutantes en algunos de estos genes. Este experimento se replico 9
veces, para escoger el MIC de cada cepa se tomo en consideración resultados que tuvieran
una frecuencia de 7 o más. Varios mutantes demostraron mayor sensitividad al NaOCl que
la cepa tipo salvaje (Tabla 3). Entre ellos, los mutantes de catalasa (katA) y reductasa de
sulfóxido de metionina (msrABC). Sin embargo, una cepa sin katA (ANS10) o msrABC
(ZF7) tiene el mismo MIC que una cepa sin katA y msrABC (ZF14), sugiriendo que MIC
no es una prueba sensitiva o que catalasa y las reductasas de sulfóxido de metionina no
trabajan conjuntamente para proteger a V. fischeri de NaOCl. Además, los resultados
indican que el mutante oscuro EVS102 (∆luxC-G) tiene el mismo MIC que la cepa
parental.
Tabla 3: Determinación del MIC de NaOCl en cepas de V. fischeri
Cepa
Genotipo
Descripción
MIC (mM) Frecuencia*
ES114
Tipo salvaje
Aislada de calamar
5.67
9/9
EVS102
∆luxC-G
Mutante oscuro
5.67
9/9
ANS10
kat::erm
catalasa
2.94
9/9
ZF7
∆msrABC
Reductasa de sulfóxido
2.94
9/9
29 de metionina ABC
ANS11
kat::erm, ∆luxC-G
Catalasa, oscuro
ZF14
kat::erm, ∆msrABC Catalasa, reductasa de
2.94
9/9
2.94
7/9
sulfóxido de metionina
ABC
1920
bcp::miniTn5
Peroxidasa
2.94
8/9
0902
trxB:: miniTn5
Tiorredoxina reductasa
2.94
9/9
B
0909
trxC:: miniTn5
Tiorredoxina C
2.94
8/9
0783
ybbN:: miniTn5
Tiorredoxina
2.94
4/9
2067
rpoS:: miniTn5
Factor sigma S
2.94
7/9
Determinación de MIC en cepas mutantes de V. fischeri. Experimento replicado 9 veces
para cada cepa. *Reproducibilidad del experimento, frecuencia de MIC encontrada para
cada cepa.
3.2
Genes lux son necesarios en la respuesta a NaOCl
Los resultados en la Tabla 3 sugieren que los genes lux no son necesarios para la
respuesta a NaOCl. Para determinar si hay un efecto en la adaptación de las células
bacterianas al NaOCl, se crecieron las cepas en presencia y ausencia de 1.21mM NaOCl.
Las cepas EVS102 (luxC-D), ANS10 (katA) y ANS11 (luxC-D/katA) crecen igual al tipo
salvaje ES114 en ausencia de NaOCl (Fig.7). Sin embargo, en presencia de NaOCl, los
mutantes crecen más lento que el tipo salvaje. Donde el mutante ANS11 parece ser el
menos tolerante al NaOCl, seguido por ANS10 y EVS102 (Fig.7).
30 Densidad Optica(O.D600)
2.5 Tipo Salvaje
luxC-G
katA
luxC-D/katA
Tipo Salvaje
luxC-G
katA
luxC-D/katA
2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (h)
Figura 7: Tolerancia a NaOCl en cepas de Vibrio fischeri. Crecimiento de cepas en
presencia y ausencia de 1.21mM NaOCl. Resultados son el promedio de tres experimentos
independientes, con tres replicas técnicas en cada uno. Las barras de error representan el
error estándar.
3.3
Genes necesarios para supervivencia en peróxido también son necesarios en
respuesta a NaOCl
Según el MIC (Tabla 3), los mutantes: ZF7 (msrABC), ANS10 (katA) y ZF14
(msrABCkatA) tienen la misma sensitividad a NaOCl. Para determinar si hay una
diferencia entre estas cepas, se crecieron en presencia y ausencia de NaOCl. Los
resultados indican que no hay diferencia en el crecimiento entre las cepas en ausencia de
NaOCl (Fig.8). Sin embargo, todas las cepas mutantes fueron menos tolerantes al
31 tratamiento con NaOCl que la cepa tipo salvaje (Fig.8). El cuádruple mutante ZF14 es
menos tolerante a NaOCl, seguido por las cepas ANS10 y ZF7.
Densidad Optica (O.D600)
2.5 Tipo Salvaje
msrABC
katA
msrABC/katA
Tipo Salvaje
msrABC
katA
msrABC/katA
2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 6 Tiempo (h) 8 10 12 Figura 8: Tolerancia al NaOCl en cepas de Vibrio fischeri en presencia y ausencia de
1.21mM en NaOCl. Promedio de tres experimentos independientes con tres replicas
técnicas en cada uno. Las barras de error representan el error estándar.
3.4
Ausencia de msrABC y katA induce bioluminiscencia en presencia de NaOCl
Para determinar el efecto de NaOCl en la bioluminiscencia, las cepas fueron
expuestas a una concentración de 1.21mM. Los resultados indican que en ausencia de
NaOCl no hay diferencia significativa entre las cepas (Fig. 9). Sin embargo, en presencia
de NaOCl ZF14 (msrABCkatA) y ANS10 (katA) demostraron una luminiscencia específica
32 máxima significativamente más alta que ES114 bajo ambas condiciones, y ZF14 y ANS10
en ausencia de NaOCl, donde ZF14 es la cepa más brillante (Fig.9).
Luminiscencia Específica Máxima
10000000 C
B
1000000 A
A
A
A
A
A
100000 10000 Tipo Salvaje katA msrABC msrABC/katA Cepas Figura 9: Luminiscencia específica máxima en cepas Vibrio fischeri en presencia (gris) y
ausencia (negro) de 1.21mM HOCl. Resultados son el promedio de 3 experimentos
independientes con 3 réplicas técnicas cada uno. Barras de error representan el error
estándar. Letras diferentes representan diferencia estadísticamente significativa según
ANOVA, P< 0.05.
3.5. Inducción de genes lux en V. fischeri por NaOCl
Resultados presentados en la Fig. 9 sugieren que el estrés causado por NaOCl
induce la bioluminiscencia en V. fischeri. Para determinar si el aumento en
bioluminiscencia se debe a un aumento en la expresión de genes lux, se determinó la
luminiscencia especifica máxima en respuesta a NaOCl en cepas donde los genes lux están
33 bajo control de un promotor no nativo inducible por IPTG (JB22; Bose et al., 2008) y
mutante en el gen de catalasa (LG1). No se observó diferencia significativa en la
luminiscencia específica máxima entre las cepas JB22 y LG1 en presencia de NaOCl (Fig.
10). Incorporación de IPTG no genero una diferencia significativa entre las cepas en
presencia o ausencia de NaOCl (data no presentada).
Luminiscencia Especi;ica Máxima 1000000 A
A
100000 10000 1000 ES114 lacIq PA1 Cepas lacIq PA1/katA Figura 10: Efecto de 1.25mM NaOCl en la luminiscencia especifica máxima en cepas de
Vibrio fischeri con promotor no nativo en los genes lux. Resultados representan tres
experimentos independientes con tres replicas técnicas cada uno. Barras de error
representa. Barras de error representa el error estándar. Letras diferentes representan
diferencia estadísticamente significativa según Student’s t-test, P<0.05.
34 3.5
Genes lux están envueltos en la supervivencia a H2O2 de V. fischeri
Resultados anteriores (Fig. 9) sugieren que bioluminiscencia puede ayudar a la
célula a defenderse del estrés oxidativo, para confirmar esto se midió la sobrevivencia de
los mutantes oscuros a H2O2. Para determinar la supervivencia a H2O2 de cepas de V.
fischeri, células en fase de crecimiento logarítmica, fueron expuestas a 16mM (Fig. 11B) o
44mM (Fig.11A) de H2O2. Los resultados indican que EVS102 es significativamente más
sensitiva a 44mM H2O2 que ES114 (Fig.11A), sugiriendo que los genes lux están
envueltos en la supervivencia a H2O2. Las cepas mutantes en el gen de catalasa (ANS10 y
ANS11) son mas sensitivas a H2O2 (Fig. 11B) sin embargo, no se observó una diferencia
significativa entre las cepas ANS10 y ANS11 al ser expuestas a 16mM H2O2 (Fig. 11B).
-­‐2 B
A A [Log(CFU Antes/CFU Despues)]
B -­‐3 A
A
0 -­‐0.5 -­‐3.5 -­‐4 B
B
-­‐1 -­‐1.5 -­‐4.5 -­‐5 1 0.5 -­‐2.5 [Log (CFU Antes/CFU Despues)]
A
Tipo salvaje Cepas luxC-­‐G -­‐2 Cepas
Figura 11: Supervivencia a H2O2 en cepas de Vibrio fischeri. (A) Efecto de 44mM H2O2
en EVS102 y ES114. Diferentes letras representan diferencia estadísticamente
significativa según Student’s t test P<0.05. (B) Efecto de 16mM H2O2 en ES114, EVS102,
35 ANS10 y ANS11. Barras de error representa el error estándar. Resultados son el promedio
de 3 experimentos independientes con 3 réplicas técnicas cada uno. Diferentes letras
representan diferencia estadísticamente significativa según ANOVA P<0.05.
36 4
DISCUSION
Todos los animales han co-evolucionado asociaciones con microorganismos (McFall-
Ngai, 1999; Douglas, 1994). La simbiosis entre la bacteria Vibrio fischeri y el calamar
Euprymna escolopes sirve de modelo para la comprensión de interacciones entre bacterias
beneficiosas y animales (McFall-Ngai et al. 2010). El establecimiento y mantenimiento de
esta asociación es altamente específica y depende de la selección de V. fischeri y la
expulsión de bacterias no simbióticas del medio ambiente (Nyholm y McFall-Ngai, 2004).
La evidencia actual sugiere que el sistema inmune innato del calamar ayuda a controlar la
presencia de V. fischeri en el órgano de luz (McFall-Ngai et al. 2010).
Las EROs, especialmente los radicales altamente reactivos como el HOCl, son
nocivos y pueden reaccionar con las macromoléculas e inactivando su función (Imlay,
2013; Gray et al., 2013; Davies et al, 2005). HOCl es un oxidante con una fuerte actividad
bactericida. Tiene una importancia clave en el sistema inmune innato para controlar
infecciones microbianas. Esta molécula es producida por la enzima mieloperoxidasa
(MPO), a partir de iones de cloro y H2O2, en neutrófilos (Ha E. et al., 2005; Winterbourn
C. et al., 2006).
En el interior del órgano de luz de E. escolopes se ha encontrado alta abundancia
de mRNA que codifica para la enzima haluro-peroxidasa (HPO; Tomarev, et al. 1993). Se
demostró que al igual que el sistema inmune de los mamíferos, el calamar produce ácido
hipocloroso (HOCl) en respuesta a V. fischeri (Small y McFall-Ngai, 1999; HeathHeckman et al., 2011). La actividad bactericida de HOCl se debe al daño oxidativo
ocurrido mayormente en las proteínas cuya acumulación puede conducir a muerte celular
37 (Gray M. et al. 2013; Davies, 2005). Por lo tanto, existen condiciones de estrés oxidativo
causado por HOCl en el interior del órgano de luz (Small et al. 1993; Weis et al. 1996).
Sin embargo, poco se sabe sobre la respuesta de V. fischeri a HOCl.
Este trabajo se enfocó en el estudio de genes en la respuesta a estrés oxidativo, ya
que en otras bacterias se ha reportado la importancia de muchos de estos genes en
respuesta al hipoclorito de sodio (NaOCl; Tabla 1). Los genes kat, aphC, msr confieren
resistencia al NaOCl en E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa y H. pylori (Chi, et al., 2011;
Evelyn Barth et al., 2009; Romsang et al., 2013; Rosen et al. 2009). De acuerdo a estos
resultados y dado que estos genes están presentes en V. fischeri, se determinó el rol de
estos en la respuesta a NaOCl en V. fischeri.
Investigué la sensitividad de cepas mutantes de V. fischeri a NaOCl con el
propósito de identificar genes envueltos en la respuesta a NaOCl. Esta caracterización
produjo una serie de resultados interesantes: (i) algunas de las cepas mutantes de V.
fischeri estudiadas demostraron una alta sensitividad a NaOCl comparando con el tipo
salvaje, (ii) las cepas mutantes sensitivas y una no sensitiva a NaOCl fueron menos
tolerantes a NaOCl, (iii) NaOCl induce la bioluminiscencia en algunas cepas mutantes,
(iv) los genes lux parecen estar envueltos en la respuesta a NaOCl y también son
necesarios para la supervivencia a peróxido de hidrógeno (H2O2). Juntos, estos resultados
sugieren que V. fischeri ha desarrollado un sistema de protección contra el estrés oxidativo
causado por NaOCl y que V. fischeri tiene genes involucrados en la resistencia a NaOCl.
38 Fue curioso notar que el MIC de NaOCl para muchas de las cepas estudiadas fuera
el mismo. No obstante, estas cepas fueron más sensitivas que la cepa tipo salvaje de V.
fischeri, con excepción de EVS102 (ΔluxC-G), sugiriendo que los genes lux no están
envueltos en la resistencia a NaOCl. Al comparar el MIC de las cepas mutantes en katA
(ANS10) y msrABC (ZF7) con el cuádruple mutante msrABCkatA (ZF14), observamos el
mismo MIC. Estos resultados sugieren que (i) MIC no es suficientemente sensitivo para
detectar pequeñas diferencias en sensitividad y/o (ii) que los genes que confieren
resistencia a NaOCl en V. fischeri no tienen un efecto aditivo.
Para examinar la primera posibilidad, estudiamos la tolerancia a NaOCl en cepas
mutantes sensitivas al NaOCl, para ver el efecto de este en el crecimiento de algunas cepas
mutantes de V. fischeri. Me enfoque en genes en la respuesta a estrés oxidativo (katA y
msrABC) y genes lux. Ya que se ha demostrado que katA y msrABC están envueltos en la
respuesta al estrés oxidativo y que son importantes durante interacción simbiótica entre V.
fischeri y el calamar E. escolopes (Visick, 1998; Flores-Cruz, y Stabb, en preparación).
Además, se ha demostrado que la bioluminiscencia generada por V. fischeri es necesaria
para una simbiosis exitosa (Visick et al., 2000) y se ha hipotetizado que durante la
interacción con el calamar la bioluminiscencia podría ayudar a esta bacteria a sobrevivir al
estrés oxidativo (Ruby y McFall-Ngai, 1999).
En ausencia de NaOCl, no hubo diferencia en el crecimiento de las cepas mutantes
en los genes msrABC, katA, msrABCkatA y el tipo salvaje. Sin embargo, todas las cepas
mutantes (msrABC, katA, msrABCkatA) fueron menos tolerantes al tratamiento con
NaOCl que la cepa tipo salvaje, sugiriendo que todos estos genes están involucrados en la
respuesta a NaOCl y que protegen a V. fischeri del estrés causado por NaOCl.
39 Resultados similares se han encontrado en cepas de E. coli y H. pylori que carecen
msr y kat, respectivamente, las cuales son más sensitivas a NaOCl (Chi, et al., 2011;
Evelyn Barth et al., 2009; Rosen et al. 2009). Se ha demostrado que en E. coli y H. pylori,
las cepas que carecen msr son más sensibles al estrés de HOCl, mientras que en el tipo
salvaje, la sobreexpresión de msr aumenta la resistencia al HOCl (Rosen et al., 2009;
Mahawar, et al., 2011).
En V. fischeri katA es importante para supervivencia en H2O2 y msrABC son
necesarios para tolerancia a O-2 y supervivencia a H2O2 en la ausencia de katA (Visick,
1998; Flores-Cruz y Stabb, en preparación). Además, ambos katA y msr son importantes
durante la relación simbiótica entre el calamar y V. fischeri (Visick, 1998; Flores-Cruz, y
Stabb, en preparación). En conjunto, estos resultados sugieren que bacterias asociadas a
hospederos que causan interacciones mutualistas y patogénicas utilizan procesos similares
para defenderse de NaOCl y que V. fischeri tiene genes envueltos en la respuesta al estrés
de NaOCl que también son necesarios durante simbiosis con el calamar.
El cuádruple mutante ZF14 (msrABCkatA) fue menos tolerante a NaOCl, seguido
por las cepas ANS10 (katA) y ZF7 (msrABC), sugiriendo que MIC no es una prueba
sensitiva para estudiar resistencia a NaOCl en cepas de V. fischeri y que estos genes
trabajan conjuntamente para proteger a V. fischeri de NaOCl.
Según nuestros resultados de MIC el mutante oscuro (EVS102) tiene la misma
sensitividad que el tipo salvaje a NaOCl. Sin embargo, nuestros resultados también
sugieren que MIC no es una prueba sensitiva para estudiar la resistencia a NaOCl, por lo
tanto condujimos experimentos de tolerancia con esta cepa. Los resultados indican que el
40 mutantes oscuro (EVS102) es menos tolerante a NaOCl, sugiriendo que los genes lux
están envueltos en la tolerancia a NaOCl. Estos resultados además, son consistentes con
mi observación de que MIC no es una prueba sensitiva para determinar sensitividad a
NaOCl.
Los resultados de tolerancia además indican que el mutante oscuro/katA (ANS11)
es menos tolerante al NaOCl que las demás cepas, EVS102 y ANS10, sugiriendo que hay
un efecto aditivo en la resistencia a este oxidante. Previamente se ha demostrado que los
genes lux también son necesarios durante la interacción simbiótica con E. escolopes
(Visick et al., 2000). Por lo tanto, al igual que los resultados con los genes katA y
msrABC, estos resultados indican que V. fischeri tiene genes envueltos en la respuesta al
estrés de NaOCl que también son necesarios durante simbiosis con el calamar.
La cuantificación de luminiscencia específica máxima en cepas expuestas a NaOCl
indica que este oxidante induce la producción de luz en cepas que experimentan alto estrés
oxidativo. La cepa mutante ZF14 (msrABCkatA) fue la más brillante seguida por la cepa
ANS10 (katA), estas cepas fueron las cepas más sensitivas a NaOCl que aún pueden
producir bioluminiscencia. Por lo tanto hipotetizo que a mayor estrés oxidativo más alta
será la bioluminiscencia.
Para determinar si esta inducción en bioluminiscencia se debe a una inducción en
la expresión de los genes lux, se determinó la luminiscencia específica máxima en
respuesta a NaOCl en cepas donde los genes lux están bajo control de un promotor no
nativo, inducible por IPTG (JB22; Bose et al., 2008) y la misma cepa sin el gen katA
(LG1). No se observó diferencia significativa en la luminiscencia específica máxima entre
41 las cepas JB22 y LG1 en presencia de NaOCl, sugiriendo que la inducción de la
bioluminiscencia en el mutante ANS10 en presencia de NaOCl se debe a una inducción en
la expresión de genes lux. De acuerdo con nuestros resultados, una de las señales que
recibe V. fischeri en el órgano de luz del calamar que induce la bioluminiscencia podría
ser la producción de HOCl.
Se ha sugerido que bioluminiscencia puede proteger a V. fischeri del estrés
oxidativo (Ruby, 1999). Esta hipótesis es consistente con nuestros resultados de
tolerancia, donde las cepas oscuras son menos tolerantes que la cepa tipo salvaje a NaOCl.
Para confirmar esto decidí cuantificar la supervivencia a H2O2 en los mutantes oscuros
(EVS102 y ANS11). Nuestros resultados indican que la cepa EVS102 (ΔluxC-G) es más
sensitiva a 44mM H2O2 que el tipo salvaje, sugiriendo que los genes lux también están
envueltos en la supervivencia a H2O2. Por lo tanto en V. fischeri los genes lux son
importantes en respuesta a estrés oxidativo y que la bioluminiscencia protege a la bacteria
a mas una ERO. Sin embargo, no se observó una diferencia significativa entre las cepas
ANS10 (katA) y ANS11 (luxC-D/katA) al ser expuestas a 16mM H2O2. Esto sugiere que
no hay un efecto aditivo de protección entre los genes lux y catalasa a esta concentración
de peróxido.
En este trabajo, hemos identificado genes de V. fischeri envueltos en la resistencia
a NaOCl, se demostró que el aumento de la bioluminiscencia en presencia de NaOCl se
debe a un aumento en la expresión de los genes lux; que mutantes oscuros, deficientes en
interacción simbiótica (Visick, 2000), son sensitivos al NaOCl y peróxido, lo que sugiere
que V. fischeri tiene sistemas de resistencia a más de un ERO. Al igual que en otras
bacterias, se demostró que las cepas mutantes en los genes msr y kat (los cuales son
42 necesarios durante interacción simbiótica; Visick, 1998; Flores-Cruz, Z. y Stabb, EV., en
preparación) contribuyen a la resistencia a NaOCl en V. fischeri. Por lo tanto, V. fischeri
tiene genes que confieren resistencia al estrés oxidativo causado por NaOCl que
también son necesarios durante simbiosis con el calamar. Además, mis resultados
sugieren que la interacción entre V. fischeri y el clamar puede ser utilizada como modelo
para el estudio de la respuesta a estrés oxidativo durante interacciones mutualistas y
patogénicas.
Un factor que podría contribuir a la capacidad de V. fischeri para sobrevivir en el
hospedero es su capacidad para soportar el estrés oxidativo (Visick, 1998). La simbiosis
entre el órgano de luz E. escolopes y V. fischeri ofrece oportunidades únicas para estudiar
relación bacteria-hospedero (Nyholm, y McFall-Ngai, 1998). Nuestros resultados sobre el
simbionte V. fischeri han proporcionando evidencia de que esta bacteria activa
mecanismos de defensa y expresa genes en respuesta a HOCl. Además, los resultados
demuestran que V. fischeri tiene genes que confieren resistencia a HOCl y que trabajan
conjuntamente para protegerla, y sugieren que la bioluminiscencia es inducida, en parte,
por estrés oxidativo.
43 5 CONCLUSIONES
Basándose en el objetivo general de esta tesis puedo concluir que cepas mutantes
de V. fischeri son sensitivas al NaOCl. Este último retrasa el crecimiento de las cepas
mutantes en los genes lux, msrABC y katA, sugiriendo que los mismos están involucrados
en la respuesta por NaOCl. Los genes msr son importantes no sólo para la supervivencia a
peróxido de hidrogeno y superóxido, sino también, para la resistencia al estrés oxidativo
producido por NaOCl. También podemos decir que mutantes en los genes lux (luxC-D) de
V. fischeri sensitivos a NaOCl, son necesarios para la supervivencia estrés causado por
peróxido de hidrogeno, confirmando que los genes lux de V. fischeri están involucrados en
la respuesta al estrés oxidativo.
En este trabajo medí la bioluminiscencia de V. fischeri en presencia de NaOCl, y
encontré que: 1) El estrés causado por NaOCl induce la bioluminiscencia en los mutantes
msrABCkatA y katA; 2) dicha inducción es el resultado de un aumento en la expresión de
los genes lux.
En conjunto, V. fischeri tiene genes envueltos en la respuesta al estrés oxidativo
producido por HOCl, que también son necesarios para mantener la interacción simbiótica
con el calamar E. escolopes.
44 6 TRABAJOS FUTUROS
Mis resultados sugieren que V. fischeri tiene genes envueltos en la respuesta a
NaOCl. El daño oxidativo ocurre mayormente en las proteínas, por lo que propongo
cuantificar el daño en proteínas causado por NaOCl. Para demostrar esto, cepas mutantes
de V. fischeri, al igual que la cepa salvaje serán expuestas a NaOCl. El daño del estrés
oxidativo en proteínas se detectará mediante el uso del kit comercial Oxi-Blot, que detecta
carbonilación de proteínas (Luo, 2009). Esto me permitirá cuantificar daño causado por el
estrés oxidativo en cepas sensitivas a NaOCl.
Los resultados presentados en la figura 10, indican que la bioluminiscencia es
inducida por el estrés causado por NaOCl. Se propone identificar el mecanismo de
inducción de los genes lux en presencia de NaOCl. El procedimiento consiste en exponer
tanto las cepas tipo salvaje como mutantes en presencia y ausencia de NaOCl, y luego se
cuantificara mediante técnicas moleculares usando qPCR con sus respectivos primers.
Este experimento nos ayudara a contestar la hipótesis de que los genes lux protegen a V.
fischeri contra el estrés oxidativo y sobre una de las estrategias que utiliza V. fischeri para
colonizar y persistir en el órgano de luz del calamar E. escolopes.
Los resultados presentados en esta tesis indican que el mutante en los genes
msrABC es menos tolerante a NaOCl, pero hasta ahora no se sabe con certeza cuál de
estos genes es el responsable de este fenotipo. Por esta razón se propone determinar el rol
de cada uno de estos genes frente a NaOCl. Para determinar esto se expondrá las cepas
tipo salvaje, mutantes dobles y simples de msr en presencia y ausencia de 1.21mM
NaOCl y se monitoreará el crecimiento de las bacterias con el uso de un
45 espectrofotómetro. Esto nos permitirá identificar la especificidad de los genes msr en la
respuesta a NaOCl. Resultados preliminares indican que msrB es el responsable de la
tolerancia a NaOCl.
46 7.
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