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PROTEASAS
Prof. Andrés R. Alcántara.
Grupo de Biotransformaciones
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia
1
Enzimas que catalizan procesos
reversibles de hidrólisis de diferentes
sustratos
9Nomenclatura según el Enzyme Commission (E.C.)
E.C.3.X.Y.Z
Tipo de enzimas: Tipo de sustrato
Hidrolasas
sobre el que actúan
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3.1 Sobre ésteres
3.2 Glicosidasas (rompen enlaces glicosídicos)
3.3 Sobre éteres
3.4 Peptidasas (rompen enlaces peptídicos)
3.5 Sobre otros enlaces C-N no peptídicos
3.6 Sobre anhidridos de ácido
3.7 Sobre enlaces C-C
3.8 Sobre enlaces C-X
3.9 Sobre enlaces P-N
3.10 Sobre enlaces S-N
3.11 Sobre enlaces C-P
3.12 Sobre enlaces S-S
3.13 Sobre enlaces C-S
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E.C.3.4.-.- Acting on peptide bonds (peptide hydrolases).
There are 1582 PDB entries in enzyme class E.C.3.4.-.E.C.3.4.11.- Aminopeptidases. [ 46 PDB entries ]
E.C.3.4.13.- Dipeptidases. [ 8 PDB entries ]
E.C.3.4.14.- Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases. [ 4 PDB
entries ]
E.C.3.4.15.- Peptidyl-dipeptidases. [ 3 PDB entries ]
E.C.3.4.16.- Serine-type carboxypeptidases. [ 27 PDB entries ]
E.C.3.4.17.- Metallocarboxypeptidases. [ 35 PDB entries ]
E.C.3.4.18.- Cysteine-type carboxypeptidases. [ 1 PDB entry ]
E.C.3.4.19.- Omega peptidases. [ 6 PDB entries ]
E.C.3.4.21.- Serine endopeptidases. [ 780 PDB entries ]
E.C.3.4.22.- Cysteine endopeptidases. [ 122 PDB entries ]
E.C.3.4.23.- Aspartic endopeptidases. [ 338 PDB entries ]
E.C.3.4.24.- Metalloendopeptidases. [ 196 PDB entries ]
E.C.3.4.25.- Threonine endopeptidases. [ 2 PDB entries ]
E.C.3.4.99.- Endopeptidases of unknown catalytic mechanism. [ 14 PDB
entries ]
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LAS MÁS IMPORTANTES EN BIOCATÁLISIS
1.
2.
3.
4.
SERIN PROTEASAS
ASPARTIL PROTESASA
METALOPROTEASAS
CISTEIN PROTEASAS
DENTRO DE ELLAS, LAS SERIN PROTEASAS SON LAS MÁS USADAS:
SE SUBDIVIDEN EN:
GRUPO A:
Tripsina
Quimotripsina
Elastasa
Trombina
GRUPO B:
Subtilisina
Los miembros de cada grupo tienen un ancestro común,
Los grupos A y B se han hecho similares a través de un proceso de evolución
convergente
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Identidad de secuencia redspecto a la tripsina pancreática de mamíferos.
Fish trypsin
69%
Bacterial trypsin
43%
Mammalian chymotrypsin
50%
Mammalian elastase
48%
Fungal elastase
26%
Mammalian plasma thrombin
38%
Bacterial subtilisin
0%
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LAS PROTEASAS DIFIEREN EN SU ESPECIFICIDAD
S2
O
H
N
R3
SUBSITIO
S3
S'1
R2
N
H
O
H
N
O
R1
R'1
N
H
O
S1
H
N
O
R'2
S'2
HIDROLISIS
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S1-S’1
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Prsentan un centro de especificaidad
distinto del centro catalítico.
Reconocen las cadenas laterales antes de
la ruptura.
Quimotripsina: aromáticos o voluminosos
z Phe, Tyr, Trp, Leu, Met
Tripsina: grandes, y con carga positiva.
z Lys, Arg
Elastasa: pequeños, hidrofóbicos
Ala
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O
O
H
N
N
H
H
N
N
H
NH
His
HN
NH
His
O
HN
O
O
O
O
Ser
O
H
Asp
H
N
N
O
R2HN
O
C O
R1
R2HN
O
O
C O
R1
O
HN
(Glu)
Ser
H
O
H
N
N
Asp
HN
(Glu)
HN
HO
O
HN
R2HN C O
INTERMEDIO
TETRAÉDRICO #1 R1
O
O
O
HN
HN
H2O
O
C O
R1
O
2
R NH2
O
O
H
N
N
H
NH
His
H
N
N
H
HN
NH
O
His
O
O
O
N
Asp
HN
(Glu)
O
O
Ser
H
N
H
O
INTERMEDIO
TETRAÉDRICO #2
O
O
HO C O
R1
HN
O
HN
Ser
O
Asp
O
HN
(Glu)
H
O
N
N
HN
O
H
O
O
ENZIMA ACILADA
HN
H
O
C O
R1
O
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HN
O
Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serina PASO 1
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PASO 2
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PASO 3
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PASO 4
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PASO 5
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PASO 6
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PASO 7
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Estructuras cristalográficas
Varias enzimas nativas:
Tripsina, quimotripsina, elastasa…
Proteínas pequeñas (15-34 kD), alta resolución (1-2Å)
Varios complejos:
Enzima-Producto (análogos), eg:
L-formamil-L-Trp embebido en la quimotripsina
Enzima-Inhibidores
Enzima-Acilada
Condiciones
sustratos no naturales que deacilen lentamente:
Indolilacriloil-quimotripsina @ pH4
Carbobenzoxi-Ala-elastasa @ -55°C
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Catalisis: Enlaces de H del bolsillo oxianionico
2 enlaces de H con NH193, NH195.
El enlace NH195 es más largi en los
complejos enzima-sustrato o enzima
producto.(3.6Å)
Carbonilo trigonal
Se acorta cuando el carbonilo
piramidaliza
carbon Æ tetrahedral
C==O Æ C—O¯
Favoreciendo el estado de
transición.
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Evidencias que implican los enlaces de H en el oxianión
Thioester substrates less reactive
Longer / weaker H-bonds
Perhaps other effects?
Zymogen (inactive) precursors
Gly193 points away
Main chain H-bonds being used
Design for rigidity?
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S2
Otros enlaces de H del esqueleto peolipeptídico.
H
N
O
S'1
R2
H
N
O
R' 1
N
N
Los tres resíduos antes del enlace que se corta (S1,
H
H
R3
O
R1
O
S2, S3) están unidos por enlaces de H a la enzima
S1
Se forma un a modo de “complejo enzima sustrato tipo S3
HIDROLISIS
lámina beta)
CO214 con NHR1
Catalytic triad
NH216 con COR3.
Asp102 His57 Ser195
cleaved bond
CO216 con NHR3.
R2
oxyanion hole
Se mantiene una estructura rígida
substrate peptide
H
N
O
R' 2
S'2
R1
(in specificity
pocket)
215
R3
227
216
226
Non-specific
H-bonding to
backbone
189
Residues important
for specificity
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Triada catalítica
¾El Nε del resíduo His57 actúa
como una base
¾La protonación de la histidina
es vital
¾No – proton stabilized on Nδ by
Asp102.
¾La atraccion del Hδ por el
Asp102 aumenta su pKa.
¾ Si se transfiere por completo,
existe un relé de carga.
¾ Cuando se devuelve el protón
Hε,, el Asp102 devuelve el Hδ:
¾Asp102/His57: buffer protónico
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SINTESIS de AMIDAS
R3
O
NH 2
R1
+
HN
O
OH
R2
OH
R3
HIDROLASE
ORGANIC SOLVENT
R1
O
R2
R2
O
R3
NH2
R
NH
LIPASE
Acyl Donor
NH2
+
R1
HN
NH2
NH
R3
NH-Acyl
+
R
R
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SÍNTESIS PEPTÍDICA
La síntesis peptídica catalizada por enzimas se puede llevar a cabo de tres
maneras: AMIDACÍON (reverso de la hidrólisis), TRANSPEPTIDACIÓN (menos
frecuente) y AMINOLISIS DE ESTERES.
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SÍNTESIS PEPTÍDICA
CONTROL TERMODINÁMICO: en condiciones fisiológicas (entornos acuosos) el
equilibrio está muy desplazado hacia la proteólisis. Por tanto, hemos de “tirar”
del equilibrio en sentido de la síntesis:
¾Usar
algún reactivo en exceso
¾Eliminar
los productos:
¾ PÉPTIDO
¾ formacion
de
un
derivado
insoluble
por complejación.
¾ Extracción
del
producto
con
un
cosolvente
inmiscible.
¾ AGUA
¾ Evaporación
en
contínuo
¾ Disminución de aw
usando
un
cosolvente miscible.
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SÍNTESIS PEPTÍDICA
CONTROL CINÉTICO: la aminólisis de ésteres supone un proceso
irreveresible donde dos nucleófilos (agua y amina) compiten por el intermedio
acil-enzima.
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SÍNTESIS PEPTÍDICA
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SÍNTESIS PEPTÍDICA
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EJEMPLO 1:
SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UNA ENCEFALINA
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EJEMPLO 2: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met- o Leu-ENCEFALINA
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EJEMPLO 3: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met-ENCEFALINA
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EJEMPLO 4: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UN UNDECAPÉPTIDO
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EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
SÍNTESIS PEPTÍDICA:
ESTEREO y REGIOSELECTIVA
X
NH
X
NH
NH2
+ HO
O
OMe
(D,L)-fenilalaninato
de metilo
O
termolisina
O
OH
O
Ácido aspártico
(N-protegido)
NH2
O
+
OMe
(D)-fenilalaninato
de metilo
OH
NH
O
O
OMe
α-aspartamo
(N-protegido)
Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido
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X
NH
X
NH
NH2
+ HO
O
OMe
(D,L)-fenilalaninato
de metilo
O
termolisina
O
OH
O
Ácido aspártico
(N-protegido)
NH2
O
+
OMe
(D)-fenilalaninato
de metilo
OH
NH
O
O
OMe
α-aspartamo
(N-protegido)
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X
NH
X
NH
NH2
+ HO
O
OMe
(D,L)-fenilalaninato
de metilo
O
termolisina
O
OH
O
Ácido aspártico
(N-protegido)
NH2
O
+
OMe
(D)-fenilalaninato
de metilo
O
OH
NH
O
OMe
α-aspartamo
(N-protegido)
Principal problema en la síntesis química: formación del β−aspartamo (AMARGO), que
habría que separar.
VENTAJAS DEL PROCESO ENZIMÁTICO:
•No se produce nada del isómero beta (100 % REGIOSELECCIÓN)
•La enzima es completamente enantioselectiva (se puede partir del ester racémico)
•La reacción tiene lugar en medio acuoso, en condiciones suaves.
•La termolisina se obtiene de Bacillus proteoliticus, un microorganismo termófilo aislado en
una fuente termal (Rokko Hot Spring) en Japón, por lo que puede trabajar hasta 60ºC.
Al ser un equilibrio hay que eliminar los productos para desplazarlo. Se añade exceso de
fenilaninato de metilo (inocuo para la enzima), por lo que se forma el carboxilato del alfaaspartamo, que precipita en el medio de reacción, y se aisla facilmente.
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The global market volume for this peptide sweetener, with a sweetening
power about 200 times that of sucrose, has been estimated at 14,000–
15,000 tons in 2003 (Ajinomoto 2003).
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PROTEASAS PARA LA OBTENCIÓN DE
INSULINA
Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de perro.
Secuencia identificada por Sanger en 1955.
Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el
tratamiento de la diabetes mellitus (aprox. 5% población
occidental).
Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis)
Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina:
1. Extracción de páncreas humano
2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales
3. Conversión de insulina porcina en humana
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados
genéticamente
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3. Conversión de insulina porcina en humana
Cadena A
Cadena B
Proteasa de Achromobacter lyticus
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4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (Novo
Nordisk)
Pro-insulina
Obtenida a través de fermentación
de células de S. cerevisiae modificadas
genéticamente
Ester de la insulina humana
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4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadas
genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY)
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Pro-Arg -insulina
Conversión: sobre 70 %.
Reactor tipo batch
Mono/di-Arg -insulina
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Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
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4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas
genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst Marion
Roussel)
Pre-pro-Arginsulina
Mono/di-Arg -insulina
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Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
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EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
O
OEt
EtO
O
O
O
subtilisina
EtO
ONa
(R)
+
EtO
OEt
(S)
O
O
Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO
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O
OEt
EtO
O
O
subtilisin
ONa
(R)
EtO
+
O
O
O
20% emulsion en 30 mM
NaHCO3 acuoso en un sistema
bifásico con tolueno
OEt
(S)
EtO
Separación
&
Extracción
HCl
O
O
EtO
OH
(R)
EtO
OEt
(S)
O
O
Secado del tolueno
&
NaOEt / Δ
Sintón para la obtención de
inhibidores de colagenasa
(osteoartritis)
O
OEt
EtO
O
Rend. global: 87%
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 50
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
Azul: enantiómero convertido
Rojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 51
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 52
Peptidomiméticos inhibidores
de renina
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 53
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
ENANTIÓMERO BUSCADO
Azul: enantiómero convertido
Rojo: enantiómero no convertido
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 54
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 55
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 56
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
ENANTIÓMERO BUSCADO
Azul: enantiómero convertido
Rojo: enantiómero no convertido
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM 57
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
Compañía: PGG Industries, USA
Utilidad: sintón para la obtención de LY333531, un
inhibidor de la protein Kinasa C
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