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BIOCATÁLISIS EN
MEDIOS NO
CONVENCIONALES
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
1.DISOLVENTES
ORGÁNICOS
2.FLUIDOS
SUPERCRÍTICOS
3.LÍQUIDOS IÓNICOS
Prof. J. M. Sánchez-Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Enzimología en Disolventes
Orgánicos ?
9El
uso de disolventes orgánicos en altas proporciones para
incrementar la solubilidad de reactantes fue examinado en 1975
en la reacción con colesterol oxidasa aislada para producir
colestenona.
Buckland, B.C., Dunnill, P., Lilly, M.D. The enzymatic transformation of
water-insoluble reactants in non aqueous solvents. Conversion of
cholesterol to cholest-4-ene-3-one by a Nocardia sp., Biotechnol. Bioeng.
1975 17, 815-826
9Pero la
síntesis enzimática se creyó que era
incompatible con la mayoría de las síntesis
orgánicas realizadas en medios no acuosos
(DOGMA ).
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9EL DOGMA: La catálisis enzimática solo en medios acuosos
9La
estructura 3D activa de una
enzima depende
de una gran
variedad de factores:
9Exposición
de
residuos
aminoacídicos :
9 Los resíduos hidrofílicos están
(principalmente) expuestos al
disolvente (acuoso).
9Los resíduos hidrofóbicos están
(principalmente) enterrados en el
interior de la enzima.
9Se establece un equilibrio entre
unos y otros
9Si
las propiedades del medio
enzimático se varían de agua a
disolventes mas hidrofóbicos y
menos polares este equilibrio
podría fallar ⇒ desnaturalización.
Lipasa de Rhizomucor miehei
:
Residuos hidrofílicos
Residuos hidrofóbicos
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9Esta situación cambió despues de la publicación de los trabajos
de A. M. KLIBANOVhacia la midad de los 80, cuando mostró
que las ENZiMAS (al menos algunas de ellas) ERAN CAPACES
DE TRABAJAR EN DISOLVENTES ORGÁNICOS
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IMPORTANCIA DE LOS DISOLVENTES
ORGANICOS :
¾Los Químicos Orgánicos comenzaron a usar
enzimas
¾ Los sustratos interesantes para trabajar con
ellos son generalmente insolubles en agua
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BIOTRANSFORMACIONES EN DISOLVENTES
ORGANICOS : VENTAJAS
1.- Mejor recuperación de productos como consecuencia de la
omisión de etapas de extracción durante la purificación.
Los agentes causantes de la formación de emulsiones se
pueden suprimir y la recuperación de producto(s) se
facilita por el uso de disolventes orgánicos de bajo
punto de ebullición.
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Un ejemplo industrial
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2.- Incremento en la solubilidad de los sustratos orgánicos
(no polares), aumentando la velocidad de reacción.
3.- Un medio orgánico es un medio hostil para la vida de las
células, por tanto la contaminación microbiana es
despreciable (decisivo a escala industrial, donde mantener
la esterilidad podría ser un serio problema)
4.La desactivación y/o la inhibición causada por los
sustratos
y/o los productos lipofílicos se reduce al
mínimo puesto que su baja solubilidad en los disolventes
orgánicos conduce a una concentración local reducida en
la superficie de la enzima.
5.- Algunas reacciones secundarias (hidrólisis de grupos
lábiles – e.g., epóxidos o anhídridos - polimerización de
quinonas, racemisación de cianohidrinas) son dependientes
de agua y por tanto suprimidas en medios orgánicos.
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6.- La inmovilización de enzimas es a menudo innecesaria
que pueden ser recuperadas por simple filtración. Si
quiere puede ser suficiente la adsorción sobre
superficie de un soporte barato, como Celita (tierra
diatomeas), sílice o bolas de vidrio (no desorción).
ya
se
la
de
7.-Algunas de las
reacciones responsables de la
desnaturalización de enzimas son mediadas por agua:
Hidrólisis de enlaces peptídicos (especialmente en
asparragina).
Hidrólisis de enlaces amida en cadenas laterales
(asparragina y glutamina).
Eliminación y oxidación (principalmente residuos
cisteína)
Por tanto, las enzimas deberían ser mas estables en un
entorno con bajo contenido en agua
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Oglno, H., Nakagawa, S., Shinya, K., Muto, T., Fujimura, N., Yasuda, M., and Ishlkawa, A.:
Purification and characterization of organic solvent-stable lipase from organic solventtolerant Pseudomonas aeruginosa LST-03. J. Biosci. Bioeng., 89,451-457 (2000).
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Ogino, H., Watanabe, F., Yamada, M., Nakagawa, S., Hirose, T., Nogachi, A., Yasuda, M.,
and Ishikawa, H. Purification and characterization of organic solvent-stable protease
from organic solvent-tolerant Pseudomonas aueruginosa PST-01. J. Biosci. Bioeng., 87,
61-68 (1999).
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8.- Último pero no menos importante: los equilibrios pueden
ser invertidos
O
O
H
N
N
H
H
N
N
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NH
His
HN
NH
His
O
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O
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Ser
O
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N
N
O
R2O
O
HO
O
O
O
C O
R1
O
HN
(Glu)
Ser
H
Asp
HN
(Glu)
HN
HN
O
N
N
O
H
R2O C O
INTERMEDIO
TETRAÉDRICO #1 R1
O
O
HN
O
HN
HN
H2O
MECANISMO DE SERIN HIDROLASAS
EN AGUA
C O
R1
R2O
O
C O
R1
O
R2OH
O
O
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HO C O
R1
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O
Asp
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(Glu)
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H
O
N
N
HN
O
H
O
O
HN
H
O
C O
R1
HN
ENZIMA ACILADA
INTERMEDIO
TETRAÉDRICO #2
O
O
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EN DISOLVENTES ORGANICOS
O
O
H
N
N
H
H
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NH
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INTERMEDIO
TETRAÉDRICO #1 R1
O
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R2-OH
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C O
R1
HN
ENZIMA ACILADA
INTERMEDIO
TETRAÉDRICO #2
O
O
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OTROS SISTEMAS DIFERENTES
1.- AGUA-CO-SOLVENTE MISCIBLE : SISTEMAS MONOFÁSICOS
9La enzima, el sustrato y/o el producto están disueltos en una
disolución monofásica de agua y un co-solvente.
9 Que disolventes?:
9Alcoholes de cadena corta: MeOH, EtOH, PrOH, …
9Disolventes polares: DMSO, DMF, acetona, dioxano, THF…
9Usados para la transformación de sustratos lipofílicos, escasamente
solubles en agua, para acelerar la velocidad de reacción.
9En algunos casos, las selectividades de esterasas y proteasas podría
ser mejorada.
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1.- AGUA-CO-SOLVENTE MISCIBLE : SISTEMAS MONOFÁSICOS
9En general la mayor parte de los cosolventes pueden ser usados hasta
aprox.. 10% (V/V) sin producir problemas en la enzima.
9En algunos casos pueden usarse combinaciones enzima/disolvente de
hasta 50-70%.
9Si la proporción alcanza un cierto umbral, el agua esencial unida es
eliminada conduciendo a la desnaturalización.
9Solo raramente algunas enzimas (inusualmente estables) permanecen
cataliticamente activas en disolventes orgánicos miscibles en agua con
bajo contenido en agua:
9Subtilisina
9Algunas lipasas: eg, CAL (lipasa de
Candida antarctica)
9Estos cosolventes han sido usados para disminuir la temperatura de
congelación de sistemas acuosos para biotransformaciones realizadas a
temperaturas por debajo de 0°C (“crioenzimología”).
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2.-AGUA
DISOLVEN. INMISCIBLE AGUA
SUSTRATO
PRODUCTO
SUSTRATO
PRODUCTO
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Separación espacial del biocatalizador de la fase orgánica.
Concentración limitada de compuestos orgánicos (sustrato y producto)
alrededor de la enzima:
no inhibición.
La eliminación del producto de la superficie de la enzima nos lleva a que se
complete la reacción
La reacción enzimática solo se produce en la fase acuosa :
Una transferencia de masa suficiente de/los reactante/s a los/y
producto/s del catalizador y entre las dos fases es necesaria.
Es crucial agitar o remover:
Suficiente para la transferencia de masa pero puede llevarnos a la
desactivación por procesos químicos o mecánicos.
Comparación de velocidades: La partición no tiene porqué limitar a la
kcat.
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Algunos ejemplos industriales
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3.- DISOLVENTES ORGÁNICOS PUROS
Dos posibilidades:
1) ENZIMAS SUSPENDIDAS (Catálisis heterogénea)
a.- Enzima en polvo (liofilizada)
b.- Cristales de enzima
c.- Enzima adsorbida
soporte poroso
sobre
un
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2) ENZIMAS SOLUBILIZADAS (Catálisis Homogénea)
d.- Enzimas modificadas covalentemente
e.- Enzimas solubilizadas por surfactantes.
f.-Enzimas solubilizadas por polímeros. g.-Enzimas solubilizadas por microemulsiones
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Reemplazando todo el agua (alrededor del 98%) por agua inmiscible en
disolventes orgánicos nos lleva a una suspensión de la enzima sólida en
una disolución orgánica monofásica.
El biocatalizador parece estar “seco” a un nivel macroscópico, pero allí
permanece unido a una cantidad de agua residual.
La superficie total de las enzimas sólidas está en el rango de 1 a 3 x 106
m2/kg, similar a sílice o carbón activo.
Casi uno o dos tercios del volumen total está hueco, con numerosas
cavidades ocupadas por el disolvente, y canales que lo atraviesan dando
lugar a un agregado macroscópico como una esponja.
Si se provee suficiente agitación, el sustrato no solo es transformado por
los centros activos expuestos a la superficie, también por los que están
ocultos.
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3.-DISOLVENTES ORGÁNICOS PUROS
CONSECUENCIA:
LAS PROTEINAS EN DISOLVENTES
HIDROFÓBICOS RETIENEN SU ESTRUCTURA
NATIVA
DOGMA!
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3.-DISOLVENTES ORGANICOS PUROS
Este hecho es causado por un atrapamiento
cinético de la conformación activa por:
1.Fuertes
puentes
de
hidrógeno entre los átomos
de proteína.
2.- Estructura más rígida.
En disolventes hidrofóbicos
immiscibles en agua, cualquier
agua que estuviera presente,
permanecerá en la superficie
de la proteína debido a la
naturaleza
hidrofílica
y
solvofóbica
de
dicha
superficie.
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231 moléculas de agua en el cristal
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Pregunta crucial: Qué cantidad de agua es requerida para
retener la actividad catalítica de las enzimas en esta clase de
disolventes?
Respuesta: Se ha comprobado y aceptado que se requiere un
valor aproximado de 0.2 g H2O / g proteina.
R.M. Daniel, R.V. Dunn, J.L. Finney, and J.C. Smith. The role
of dynamics in enzyme activity. Annu. Rev. Biophys. Biomol.
Struct. 2003, 32:69–92.
Depende mucho del tipo de enzima:
α-quimotripsina necesita solo 50 moléculas de agua por
molecula de proteína para permanecer cataliticamente activa
(mucho menos que una monocapa).
Subtilisina y lipasas son mas o menos similares.
Polifenol oxidasa requiere 3.5 x 107 moléculas de agua.
Como podemos determinar la cantidad de agua necesaria?
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Primera aproximación: controlar la cantidad
de agua
O
O
HN
subtilisin
HN
O
Cl
O
O
n-PrOH, THF
O
Debe ser medida,
y
es
variable
dependiendo de la
naturaleza
del
disolvente
A medida que es
mas
hidrofílico,
mayor la cantidad
de agua retenida
por el disolvente.
Affleck et al. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environtments.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1100-1104
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Aproximación óptima: controlar la ACTIVIDAD DE AGUA
Que es la actividad de agua?
A + B
Keq =
Keq =
aC x aD
C + D
[C] x [D]
[A] x [B]
FALSO !
ai = γiXi
aA x aB γi = coeficiente de actividad
Xi = fracción molar
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Analogía entre a
w
y temperatura
La misma temperatura, pero
diferente cantidad de calor ⇒
diferentes capacidades caloríficas
El calor se
distribuye de
forma
diferente,
pero la
temperatura
es la misma.
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Agua en la fase vapor
Agua en el disolvente
Agua en el microentorno de la enzima
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WATER IN THE ENZYME
WATER IN THE VAPOUR
FIXED WATER ACTIVITY
WATER IN THE SOLVENT
FIXED WATER AMOUNT
The solubility of water: higher in solvent
than in
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9La
concentración de agua alrededor de la enzima, en el
disolvente y en la fase gas será diferente.
9Pero la actividad de agua debería ser la misma en los tres
componentes, una vez que se ha alcanzado el equilibrio.
9Así, los efectos de equilibrio, como la hidratación de la
enzima y el balance entre la hidrólisis y síntesis (en
hidrolasas) dependerán de aw.
9Simplificando, aw puede ser considerado como una medida
de la preferencia del agua para estar en un entorno mejor
que en otro.
9 Las moléculas de agua en un medio a altos valores de aw
se mueven a otro de menor aw. El movimiento resultante
reduce las diferencias entre los valores de aw del medio,
hasta que son iguales en el equilibrio.
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