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Programa de Doctorado de Bioingeniería
Curso de Doctorado: Avances en Genética
El síndrome de Rett, una enfermedad peculiar
ligada al cromosoma X, causada por defectos
en la estructura de la cromatina y relacionada
con fenómenos de impronta génica
Antonio Vera
21 de enero de 2005
-1966: descrito por vez primera
por el austriaco Andreas Rett
en un estudio en 22 pacientes
-1983: primera publicación en inglés
- Síndrome severo del desarrollo
del sistema nervioso
Autismo progresivo. Pérdida de
movimientos voluntarios de la mano,
aparición de estereotipias de lavado de
manos, ataxia, microcefalia.
Pérdida progresiva de capacidades
intelectuales.
Niñas con desarrollo psicomotor normal
hasta los 6-18 meses. Regresión
-Pérdida del balbuceo. No llegan a desarrollar
el lenguaje oral
-Alteraciones del EEG
-Escoliosis
-Crisis epilépticas
Perímetro normal al nacer
↓
Microcefalia adquirida
(de 3 meses a 4 años)
- Segunda causa de retraso mental en
mujeres tras el síndrome de Down
España: menos de 300 pacientes
1/10.0000 niñas
Xq28 → 1999 MECP2
Mayoría de afectadas: mutaciones en la región codificante
Casos atípicos: mutaciones en regiones reguladoras
y otros genes
Mutaciones de novo:
Cada familia una
mutación nueva no
presente en los
progenitores
Patrón de herencia dominante ligado al cromosoma X
XR Xr
x
Xr Y
X R Xr XR Y Xr Xr Xr Y
Síndrome exclusivo de mujeres
2 ♀ : 1 ♂ de no ser letal
Datos de pacientes
afectadas y modelos
de ratón
Lyonización
Inactivación
aleatoria y sesgo
Gran variabilidad
en la intensidad de
los síntomas
1999: Clonación del gen “responsable” del síndrome de Rett
MECP2 (Metil Citosín Proteína 2)
Primera proteína reguladora humana clonada causante
de una enfermedad
2001: Modelos de ratón mediante el sistema Cre/LoxP
Expresión ubicua e
isoformas diferentes en
cerebro y en fibroblastos
y linfoblastos
MECP2 se une a “islas”
CpG y atrae o induce la
formación de complejos
de silenciamiento local
de la cromatina
Regulador general de la transcripción sujeto a
inactivación del cromosoma X, tanto en ratones
como en la especie humana
Mayoría de las mutaciones
puntuales: transiciones C→T
en lugares ricos en CpG por
desaminación de 5mC en la
línea germinal masculina
que está densamente metilada
España, más del 60%
De origen paterno
Metilasas→MBCP→HDAC→Compactación de la cromatina
Metilasas→MBCP→Metilación de histonas→Compactación
de la cromatina
Consecuencias funcionales de las mutaciones
en MECP2/Mecp2
Inicialmente: represor general de la transcripción
Fenotipos neuronales específicos y ausencia de
desregulación génica generalizada
Modelos de ratón y líneas celulares y muestras
cerebrales de pacientes afectados con síndrome
de Rett
Mecp2: aumenta su expresión asociada a la maduración
neuronal del hipocampo, cortex y cerebelo
BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor)
¿Una diana específica?
Mecp2 se une al promotor de
Bdnf en neuronas en reposo
pero la despolarización de
la membrana lleva a la
defosforilación dependiente
de calcio
Control de un importante
factor en el desarrollo de
las sinapsis y la platicidad
neuronal
Pacientes con síndrome de Rett
con un gen MECP2 intacto
HETEROGENEIDAD GENÉTICA
Genes del cromosoma X y autosómicos
MUTACIONES EN MECP2 → OTROS CUADROS CLÍNICOS
Prader-Willi y Angelman
Impronta génica
Síndrome de Prader-Willi.
Microdeleción en 15q.
40% de los casos sin
deleción en 15q
Ambas copias del cromosoma 15
son de origen materno.
Disomía uniparental.
Síndrome de Angelman.
Microdeleción en 15q.
Obsérvese la postura
característica
“síndrome del muñeco feliz”
Ambas copias del cromosoma 15
son de origen paterno.
Síndrome de Beckwith-Wiedemann
El 15% de los casos son familiares
Hemihipertrofia. Anormalidades del tracto genital.
Predisposición a tumores infantiles. Fisura lateral
del pabellón auditivo. Microcefalia y onfalocele.
Lengua grande y muy protuberante.
Citomegalia adrenal en cortex
fetal. Obsérvese el tamaño
del núcleo central
11p15.5
IGF2
H19
impronta materna
impronta paterna
Pérdida de la impronta
(LOI, Loss of Imprinting)
Células de Tumor de Wilms
IGF2: dos copias activas
Glándulas adrenales grandes
y lobuladas
En el fenómeno de PÉRDIDA DE IMPRONTA no
se pierde ni la copia paterna ni la materna de la
región cromosómica afectada
Horike et al. (2005) Nature Genet 37, 31- 40.
Otros autores: análisis de genes previamente conocidos
como sujetos a impronta → ninguna diferencia
Ratones con KO de Mecp2
Cerebro y células T de afectadas con Rett
Presunción de partida: los genes objetivo de la
regulación por Mecp2 deben estar cerca de sus
lugares de unión in vivo
MBS
Sistema urea-ChIP
Cromosoma 6 de ratón, 7q21-22
Cromatina entrecruzada con formaldehido y purificada mediante
ultracentrifugación en gradiente de urea, se eliminan RNA y proteínas
unidas inespecíficamente → Sau3AI → suero ant-Mecp2 → Purificar
DNA
Adaptadores y PCR → 100 fragmentos
MBS10 y MBS11
Eliminación de Mecp2 → x2 transcripción en cortex de ratón
Nuevos genes con
impronta en ratones
y en la especie
humana
Dlx5 y Dlx6
Familia de genescon homeobox de Drosophila
(Distal-less, Dll), desarrollo de apéndices y neurogénesis
Comprobación: ¿se debe
el aumento de la
transcripción a la
variación del status de
impronta en esos genes
originada por la
deficiencia en Mecp2?
Cruce de estirpes
polimórficas (SNPs
en regiones UTR 3’)
El polimorfismo
determina la
aparición o no de
una diana para
HindIII
Digestión de los
productos de PCR
F1: transcrpción
de alelos específica
de progenitor
En el cortex frontal de ratón Dlx5 es transcrito
bialélicamente pero preferentemente a partir del
alelo materno
Impronta laxa o relajada
Especie humana:
transcripción moalélica
de origen materno
En ratones KO de Mecp2
el nivel de transcripción
es el mismo para los
dos alelos
Pérdida de la impronta de DLX5: LCL y cerebro
Pacientes Rett
e individuos sanos
cualitativamente
igual que en ratones
No se altera la
impronta en
IGF2 (y otros)
Las islas CpG de Dlx5 no están metiladas
No se ve afectado el nivel de metilación de DNA en
ausencia de Mecp2
Los MBS no
coinciden con
zonas ricas
en CpG
Resultados
equivalentes
en LCL
DLX5, impronta absoluta
Dlx5, impronta laxa o relajada
Regiones correspondientes CpG sin metilar
Deben ser otros los lugares desde donde
MECP2/Mecp2 regula la expresión de DLX5/Dlx5
Sistema urea-ChIP de alta
resolución y RT-PCR
Cerebro de ratón
Digestión con Sau3A1
Región de 70 kb: no hay metilación
en las regiones CpG o no hay
diferencia entre alelos ni entre
ratones silvestres y mutantes.
Igual sucede con las regiones
ortólogas humanas.
Azul: ratones silvestres
Rojo: ratones KO Mecp2
Sistema urea-ChIP de alta
resolución y RT-PCR
¿Funciona Mecp2 en la
modificación de histonas
en regiones específicas?
Acetilación: H3 Lys9
H4 Lys14
Metilación: H3 Lys9
dimetilada
Azul: ratones silvestres
Rojo: ratones KO Mecp2
¿Participa Mecp2 en la
formación de bucles de
cromatina específicos?
Secuencias alejadas linealmente
que se aproximan como resultado
de pliegues de la cromatina
Digestión, ligación y PCR
Pliegue de 11 Kb
en ratones silvestres
exclusivamente
Se reproducen los
mismos resultados
seleccionando
fragmentos con
anticuerpos contra
la histona H3
dimetilada
Genes Dlx → Síntesis de enzimas de la ruta del GABA
Maduración de las neuronas “GABAérgicas” del cortex
La neurotransmisión del GABA está relacionada con
otros desórdenes del desarrollo nervioso
Síndrome de Angelman: similitud clínica en algunos rasgos
Alteración del quilibrio dinámico de los genes DLX
Desarreglos neurológicos y osteoporosis
Regiones cromosómicas relacionadas con el autismo
DLX1, 2
DLX5,6
BIBLIOGRAFÍA
1.
R. E. Amir, Ignatia B. Van den Veyver, Mimi Wan, Charles Q. Tran,
U. Francke, & H. Y. Zoghbi. (1999). Rett syndrome is caused by mutations in
X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein.Nature Genet 37, 185- 188.
2.
Hendrich, B. And Bickmore, W. (2001). Human diseases with underlying defects in
chromatin structure and modification. Hum. Mol. Genet. 10, 2233-2242.
3.
Horike, S.-H., Cai, S., Miyano, M., Cheng, J.-F. and Kohwi-Shigematsu, T. (2005)
Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett
syndrome. Nature Genet 37, 31- 40.
4.
Weaving, L.S., Ellaway, C.J., Gécz and Christodoulou, J. (2005). Rett syndrome:
Clinical review and genetic update. J. Med. Genet. 42, 1-7.
5.
http://www.rettsyndrome.org