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Programa de Doctorado de Bioingeniería Curso de Doctorado: Avances en Genética El síndrome de Rett, una enfermedad peculiar ligada al cromosoma X, causada por defectos en la estructura de la cromatina y relacionada con fenómenos de impronta génica Antonio Vera 21 de enero de 2005 -1966: descrito por vez primera por el austriaco Andreas Rett en un estudio en 22 pacientes -1983: primera publicación en inglés - Síndrome severo del desarrollo del sistema nervioso Autismo progresivo. Pérdida de movimientos voluntarios de la mano, aparición de estereotipias de lavado de manos, ataxia, microcefalia. Pérdida progresiva de capacidades intelectuales. Niñas con desarrollo psicomotor normal hasta los 6-18 meses. Regresión -Pérdida del balbuceo. No llegan a desarrollar el lenguaje oral -Alteraciones del EEG -Escoliosis -Crisis epilépticas Perímetro normal al nacer ↓ Microcefalia adquirida (de 3 meses a 4 años) - Segunda causa de retraso mental en mujeres tras el síndrome de Down España: menos de 300 pacientes 1/10.0000 niñas Xq28 → 1999 MECP2 Mayoría de afectadas: mutaciones en la región codificante Casos atípicos: mutaciones en regiones reguladoras y otros genes Mutaciones de novo: Cada familia una mutación nueva no presente en los progenitores Patrón de herencia dominante ligado al cromosoma X XR Xr x Xr Y X R Xr XR Y Xr Xr Xr Y Síndrome exclusivo de mujeres 2 ♀ : 1 ♂ de no ser letal Datos de pacientes afectadas y modelos de ratón Lyonización Inactivación aleatoria y sesgo Gran variabilidad en la intensidad de los síntomas 1999: Clonación del gen “responsable” del síndrome de Rett MECP2 (Metil Citosín Proteína 2) Primera proteína reguladora humana clonada causante de una enfermedad 2001: Modelos de ratón mediante el sistema Cre/LoxP Expresión ubicua e isoformas diferentes en cerebro y en fibroblastos y linfoblastos MECP2 se une a “islas” CpG y atrae o induce la formación de complejos de silenciamiento local de la cromatina Regulador general de la transcripción sujeto a inactivación del cromosoma X, tanto en ratones como en la especie humana Mayoría de las mutaciones puntuales: transiciones C→T en lugares ricos en CpG por desaminación de 5mC en la línea germinal masculina que está densamente metilada España, más del 60% De origen paterno Metilasas→MBCP→HDAC→Compactación de la cromatina Metilasas→MBCP→Metilación de histonas→Compactación de la cromatina Consecuencias funcionales de las mutaciones en MECP2/Mecp2 Inicialmente: represor general de la transcripción Fenotipos neuronales específicos y ausencia de desregulación génica generalizada Modelos de ratón y líneas celulares y muestras cerebrales de pacientes afectados con síndrome de Rett Mecp2: aumenta su expresión asociada a la maduración neuronal del hipocampo, cortex y cerebelo BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) ¿Una diana específica? Mecp2 se une al promotor de Bdnf en neuronas en reposo pero la despolarización de la membrana lleva a la defosforilación dependiente de calcio Control de un importante factor en el desarrollo de las sinapsis y la platicidad neuronal Pacientes con síndrome de Rett con un gen MECP2 intacto HETEROGENEIDAD GENÉTICA Genes del cromosoma X y autosómicos MUTACIONES EN MECP2 → OTROS CUADROS CLÍNICOS Prader-Willi y Angelman Impronta génica Síndrome de Prader-Willi. Microdeleción en 15q. 40% de los casos sin deleción en 15q Ambas copias del cromosoma 15 son de origen materno. Disomía uniparental. Síndrome de Angelman. Microdeleción en 15q. Obsérvese la postura característica “síndrome del muñeco feliz” Ambas copias del cromosoma 15 son de origen paterno. Síndrome de Beckwith-Wiedemann El 15% de los casos son familiares Hemihipertrofia. Anormalidades del tracto genital. Predisposición a tumores infantiles. Fisura lateral del pabellón auditivo. Microcefalia y onfalocele. Lengua grande y muy protuberante. Citomegalia adrenal en cortex fetal. Obsérvese el tamaño del núcleo central 11p15.5 IGF2 H19 impronta materna impronta paterna Pérdida de la impronta (LOI, Loss of Imprinting) Células de Tumor de Wilms IGF2: dos copias activas Glándulas adrenales grandes y lobuladas En el fenómeno de PÉRDIDA DE IMPRONTA no se pierde ni la copia paterna ni la materna de la región cromosómica afectada Horike et al. (2005) Nature Genet 37, 31- 40. Otros autores: análisis de genes previamente conocidos como sujetos a impronta → ninguna diferencia Ratones con KO de Mecp2 Cerebro y células T de afectadas con Rett Presunción de partida: los genes objetivo de la regulación por Mecp2 deben estar cerca de sus lugares de unión in vivo MBS Sistema urea-ChIP Cromosoma 6 de ratón, 7q21-22 Cromatina entrecruzada con formaldehido y purificada mediante ultracentrifugación en gradiente de urea, se eliminan RNA y proteínas unidas inespecíficamente → Sau3AI → suero ant-Mecp2 → Purificar DNA Adaptadores y PCR → 100 fragmentos MBS10 y MBS11 Eliminación de Mecp2 → x2 transcripción en cortex de ratón Nuevos genes con impronta en ratones y en la especie humana Dlx5 y Dlx6 Familia de genescon homeobox de Drosophila (Distal-less, Dll), desarrollo de apéndices y neurogénesis Comprobación: ¿se debe el aumento de la transcripción a la variación del status de impronta en esos genes originada por la deficiencia en Mecp2? Cruce de estirpes polimórficas (SNPs en regiones UTR 3’) El polimorfismo determina la aparición o no de una diana para HindIII Digestión de los productos de PCR F1: transcrpción de alelos específica de progenitor En el cortex frontal de ratón Dlx5 es transcrito bialélicamente pero preferentemente a partir del alelo materno Impronta laxa o relajada Especie humana: transcripción moalélica de origen materno En ratones KO de Mecp2 el nivel de transcripción es el mismo para los dos alelos Pérdida de la impronta de DLX5: LCL y cerebro Pacientes Rett e individuos sanos cualitativamente igual que en ratones No se altera la impronta en IGF2 (y otros) Las islas CpG de Dlx5 no están metiladas No se ve afectado el nivel de metilación de DNA en ausencia de Mecp2 Los MBS no coinciden con zonas ricas en CpG Resultados equivalentes en LCL DLX5, impronta absoluta Dlx5, impronta laxa o relajada Regiones correspondientes CpG sin metilar Deben ser otros los lugares desde donde MECP2/Mecp2 regula la expresión de DLX5/Dlx5 Sistema urea-ChIP de alta resolución y RT-PCR Cerebro de ratón Digestión con Sau3A1 Región de 70 kb: no hay metilación en las regiones CpG o no hay diferencia entre alelos ni entre ratones silvestres y mutantes. Igual sucede con las regiones ortólogas humanas. Azul: ratones silvestres Rojo: ratones KO Mecp2 Sistema urea-ChIP de alta resolución y RT-PCR ¿Funciona Mecp2 en la modificación de histonas en regiones específicas? Acetilación: H3 Lys9 H4 Lys14 Metilación: H3 Lys9 dimetilada Azul: ratones silvestres Rojo: ratones KO Mecp2 ¿Participa Mecp2 en la formación de bucles de cromatina específicos? Secuencias alejadas linealmente que se aproximan como resultado de pliegues de la cromatina Digestión, ligación y PCR Pliegue de 11 Kb en ratones silvestres exclusivamente Se reproducen los mismos resultados seleccionando fragmentos con anticuerpos contra la histona H3 dimetilada Genes Dlx → Síntesis de enzimas de la ruta del GABA Maduración de las neuronas “GABAérgicas” del cortex La neurotransmisión del GABA está relacionada con otros desórdenes del desarrollo nervioso Síndrome de Angelman: similitud clínica en algunos rasgos Alteración del quilibrio dinámico de los genes DLX Desarreglos neurológicos y osteoporosis Regiones cromosómicas relacionadas con el autismo DLX1, 2 DLX5,6 BIBLIOGRAFÍA 1. R. E. Amir, Ignatia B. Van den Veyver, Mimi Wan, Charles Q. Tran, U. Francke, & H. Y. Zoghbi. (1999). Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein.Nature Genet 37, 185- 188. 2. Hendrich, B. And Bickmore, W. (2001). Human diseases with underlying defects in chromatin structure and modification. Hum. Mol. Genet. 10, 2233-2242. 3. Horike, S.-H., Cai, S., Miyano, M., Cheng, J.-F. and Kohwi-Shigematsu, T. (2005) Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nature Genet 37, 31- 40. 4. Weaving, L.S., Ellaway, C.J., Gécz and Christodoulou, J. (2005). Rett syndrome: Clinical review and genetic update. J. Med. Genet. 42, 1-7. 5. http://www.rettsyndrome.org