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Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Mecanismo de la actividad enzimática
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
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Departamento de Biotecnología
Clasificación de las enzimas
1. Oxidoreductasas: Oxidación – Reducción
2. Transferasas: Transferencia de grupos C, N, o P
3. Hidrolasas: Desdoblamiento de enlaces por agua
4. Liasas: Separación de enlaces C-C, C-S, y ciertos enlaces
C-N
5. Isomerasas: Racemización de isómeros geométricos
(re-arreglos intra-moleculares)
6. Ligasas: Formación de enlaces entre carbono y O, S, N
acoplados a la hidrólisis de enlaces fosfato de alta
energía
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1. Óxido - reductasas (deshidrogenasas)
Catalizan la oxidación o reducción de sustratos
Glucosa oxidasa
Peroxidasas
Lactato deshidrogenasa
Ciclohexanona monooxigenasa
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El mayor número de oxidorreductasas llevan a cabo la
reacción:
AH2 + B ↔ A + BH2
Donde: B es el aceptor de elctrones: NAD+, NADP+, ferricitocromo, etc.
Nota: Esta reacción ocurre bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas
Lactato deshidrogenasa
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Lactato deshidrogenasa [(S)-L-Lactato:NAD+ oxidoreductasa, EC 1.1.1.27]
Contiene cuatro sitios activos por molécula; esto es, cada subunidad polipeptídica
contiene el equivalente a un sitio activo. No hay efecto cooperativo entre los 4
sitios activos.
Mecanismo: Bi Bi secuencial ordenado
NAD+
Piruvato
Lactato
NADH
E-NAD+•L
E
E-NAD+
E-NADH••P
E-NADH
E
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2. Transferasas
Catalizan la transferencia de un grupo de un compuesto a otro, los grupos que son
transferidos son C, residuos aldehídicos y cetónicos, acil, glicosil, alkil, nitrogenados,
fósforo y grupos que contienen azufre.
Most transaminases share a common substrate and product (glutamate and oxoglutarate) with glutamate dehydrogenase, and
this permits a combined nitrogen excretion pathway for individual amino acids that is commonly described as "trans-deamination".
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Mecanismo: Bi Bi Ping-Pong
Alanine transaminase
(EC 2.6.1.2)
A
E
B
P
EA-FP
F
Q
FB-EQ
E
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3. Hidrolasas
Catalizan las reacciones de hidrólisis donde el agua es el aceptor del grupo
transferido
Ejemplos: Amilasas, celulasas, β-galactosidasas, lipasas, Proteasas
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Mediante gráficas de Lineweaver-Burk
Enzima libre:
Vmax = 26.2 mol mg-1 min-1
kcat = 29 s-1
KM = 1.35 mol dm-3
Enzima inmovilizada:
Vmax = 5.2 mol mg-1 min-1
kcat = 5.7 s-1
KM = 0.2 mol dm-3
Ho-Shing Wu, Ming-Ju Tsai . 2004. Kinetics of tributyrin hydrolysis by lipase. Enzyme and Microbial Technology, 35 : 488–493
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4. Liasas
Catalizan la lisis de un substrato, generando un doble enlace en una eliminación
no-hidrolítica, no-oxidativa (Sintetasas catalizan la adición a un doble enlace, la
reacción inversa de una liasa)
Pyruvate decarboxylase
(EC 4.1.1.1)
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Active site of pyruvate decarboxylase with
selected amino acids: Glu-51, Glu-477, Asp-444,
and Asp-28. Also displayed are cofactors TPP and
Mg2+.
Susane Lowe and J. Gregorzye Ikus. 1992. Purification and
characterization of pyruvate decarboxylase from Sarcina
ventriculi. Journal of General Microbiology , 138: 803-807
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5. Isomerasas
Catalizan las reacciones de isomerización
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6. Ligasas (sintetasas)
Catalizan la formación de enlaces entre dos compuestos usando la energía derivada
del desdoblamiento de un enlace pirofosfato tal como se encuentra en el ATP
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Características de las Enzimas
•
•
•
•
Tasas catalíticas extremadamente altas
Condiciones de reacción suaves
Especificidad de reacción
Regulación
Las enzimas (catalizadores biológicos) son efectivas en
pequeñas cantidades
Permanecen sin cambios después de la reacción
No afectan el equilibrio de una reacción reversible,
simplemente incrementan la velocidad a la cual el equilibrio
se alcanza
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Especificidad de las enzimas
Especificidad de substrato
El resultado del reconocimiento molecular
• El substrato (pequeño) se enlaza a la enzima
(grande) vía fuerzas débiles: Enlaces-H, van der
Waals, iónicas (algunas veces interacciones
hidrofóbicas)
• El sitio de enlace de un sustrato es generalmente
una hendidura sobre la superficie de la enzima que es
complementaria para el substrato
- en forma (geométricamente complementarios)
- en características químicas
(complementariedad electrónica) al substrato
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Especificidad de las enzimas
• Especificidad absoluta:
• Especificidad relativa:
Quimoselectividad
Regioselectividad
•Estereoespecificidad:
•Inespecificidad
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Especificidad absoluta
Cataliza la reacción de un substrato único a un producto particular
Existen enzimas que sólo aceptan una molécula como sustrato, ejemplos:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Uricasa, la cual actúa solamente sobre ácido úrico
Arginasa, la cual actúa solamente sobre arginina
Carbonic anhidrasa, la cual actúa solamente sobre ácido carbónico
Lactasa, la cual actúa solamente sobre lactosa
Sucrasa, la cual actúa solamente sobre sucrosa
Maltasa, la cual actúa sobre maltosa
acetilcolinesterasa que actúa solamente sobre los ésteres de colina
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Especificidad relativa
Ciertas enzimas muestran especificidad relativa, ya que actúan sobre muchos
compuestos que poseen un rasgo estructural común. Por ejemplo, la fosfatasa del
riñón cataliza la hidrólisis de ésteres fosfato del ácido fosfórico a diferentes
velocidades, la amilasa hidroliza el almidón independiente de su origen. Las
proteasas y lipasas hidrolizan proteinas y lípidos.
Es decir, catalizan el mismo tipo de reacción con varios sustratos; pero que tienen en
común un mismo grupo químico (amino, fosfato, metil), el cual es el directamente
modificado en la reacción, ejemplo esterasa que actúa sobre los grupos éster.
Quimoselectividad
Es la capacidad de catalizar reacciones con otros grupos funcionales como por
ejemplo hidrólisis o síntesis de un enlace amida (aminólisis).
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Regioselectividad
Es la capacidad para discriminar entre las posiciones externas sn-1,3 ó la posición
interna sn-2.
Lipasa sn-2
selectiva
Lipasa sn-1,3
selectiva
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Estereoespecificidad
Es la capacidad de diferenciar entre moléculas
de sustrato que posean enantioisómeros
cuando se trata de sustratos quirales.
H
O
O
O
Ciclohexanona
Monooxigenasa
O2 ,NADPH, H+
H
O
H
H2O, NADP+
+
O
H
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A
Stereo Specificity
sp3
D
B
Enzyme surface
C
The tetrahedral structure
of carbon orbital has rigid
steric strain which makes
the basic building unit of
protein conformation
D
B
C
C
B
D
These two triangles are
not identical
Juang RH (2004) BCbasics
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Amplia especificidad
(La excepción a la regla)
Catalizando un amplio rango de compuestos y reacciones
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Chymotrypsin Has A Site for Specificity
O
O
N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C
R
H R’
OC
Ser
Specificity
Catalytic Site
Site
Active Site
Juang RH (2004) BCbasics
Planta Piloto de
Specificity
ofFermentaciones
Ser-Protease Family
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cut at Lys, Arg
Deep and negatively
charged pocket
O
O
–C–N–C–C–N–
C
C
C
C
NH3
+
COOC
Asp
Chymotrypsin
Elastase
cut at Trp, Phe, Tyr
cut at Ala, Gly
O
O
–C–N–C–C–N–
C
O
O
–C–N–C–C–N–
CH3
Shallow and
non-polar
pocket
Non-polar
pocket
Active Site
Juang RH (2004) BCbasics
Trypsin
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Algunos otros términos importantes
• Cofactores
– Iones metálicos
– Móleculas orgánicas (coenzimas)—usualmente derivados de
vitaminas
• FAD
• NAD/H
• Grupos Prostéticos—Cofactores enlazados covalentemente
• Apoenzima/holoenzima
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Cofactores y Coenzimas
Son pequeñas moléculas que se asocian con enzimas para facilitar
las reacciones que amino ácidos no pueden hacer solos
Ejemplo: oxidación – reducción
• Iones metálicos que actúan como cofactores - Cu2+, Fe3+, y Zn2+
• Cofactores orgánicos son generalmente referidos como coenzimas
- NAD+ y CoA
• Cosubstratos - cofactores que están solamente asociados
transientemente con la enzima
• Grupos prostéticos - cofactores que están permanentemente
asociados con la enzima
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Con y sin Cofactor/Coenzima
• Haloenzima – Una enzima catalíticamente activa con su cofactor
• Apoenzima - enzima sin el cofactor
Apoenzima + cofactor ↔ haloenzima
(inactive)
(active)
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Regeneración de Coenzimas
• Las coenzimas son cambiadas químicamente en la reacción en la cual
participan
• Las coenzimas deben ser regeneradas para poder completar el ciclo
catalítico
• En las reacciones catalizadas por NADH, NAD+ es reducido a NADH. El
NADH debe ser nuevamente oxidado NAD+ para permitir que ocurran
múltiples ciclos de la reacciones
• Para los cofactores unidos transientemente, algunas veces la
regeneración es realizada por otra enzima
• En el caso de grupos prostéticos, la regeneración ocurre en una fase
separada de la misma secuencia de reacciones enzimáticas
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Coenzimas
Adenosine Triphosphate (ATP)
Nicotinamide Adenine
Dinucleotide (NAD+)
Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Phosphate (NADP+)
Flavin Adenine Dinucleotide (FAD)
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Metales y oligoelementos importantes como
cofactores enzimáticos
Metal
Ejemplo de enzima
Función del metal
Fe
Citocromo oxidasa
Oxidación reducción
Cu
Ácido ascórbico oxidasa
Oxidación-reducción
Zn
Alcohol deshidrogenasa
Facilita la unión de NAD+
Mn
Histidina amoniaco liasa
Facilita la catálisis mediante la
extracción de electrones
Co
Glutamato mutasa
El Co forma parte de la coenzima
cobalamina
Ni
Ureasa
Lugar catalítico
Mo
Xantina oxidasa
Oxidación-reducción
V
Nitrato reductasa
Oxidación-reducción
Se
Glutatión peroxidasa
Sustituye al S en una cisteína del
lugar activo