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Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnología
Reacciones enzimáticas
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
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Síntesis de compuestos orgánicos
aturaleza
Industria química
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La naturaleza de las enzimas
1) La reacción química se lleva a cabo
bajo condiciones suaves
2) Acción específica de acuerdo a la
clase de enzima
3) Tasas de reacción muy rápidas
4) Numerosas enzimas para diferentes
objetivos
Enzymes at work (www.novozymes.com)
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Enzimas típicas usadas en procesos industriales
Clase
Enzimas Industriales
1. Oxidoreductasas
Peroxidasas, catalasas, glucosa
oxidasas, lacasas
2. Transferasas
Fructosil-transferasas, glucosiltransferasas
3. Hidrolasas
Amilasas, celulasas, lipasas,
pectinasas, proteasas, pululanasas
4. Liasas
Pectato-liasas, α-acetolactato
decarboxilasas
5. Isomerasas
Glucosa isomerasa
6. Ligasas
o son usadas actualmente
Enzymes at work (www.novozymes.com)
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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos
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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos
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Mercado mundial de enzimas industriales
($1,500,000 USD en el año 2000)
(McCoy, 2000)
10 %
25 %
65 %
Enzimas técnicas (Industrias: Detergentes, almidón, textil, curtidos, pulpa y
papel, y cosméticos
Enzimas en la industria alimentaria: láctea, cerveza, vinos y jugos, grasas y
aceites, y panificación.
Enzimas en alimentación animal
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Puntos principales de la aplicación comercial de
un catalizador enzimático
• Velocidad de reacción
(actividad catalítica)
• Extensión de la reacción
(constante de equilibrio)
• Duración de la actividad
(estabilidad)
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Energía de activación
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Diseño de biorreactores
Balance de materia
F (S i − S o ) = v r V reactor
F, S0
F, Si
donde:
νr = velocidad de reacción
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Leyes fundamentales de la cinética
• Velocidad de la reacción
[P]
[A]0
v0
t
• Orden de la reacción
d[P]
---- = v
dt
=k
Orden cero
A
P
d[P]
---- = v
dt
= k CA
Orden uno
A
P
d[P]
---- = v
dt
= k CA CB
Orden dos
A+ B
P
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Consideraciones al definir el orden de una reacción
• No se puede decir que todas las
reacciones poseen un cierto orden
(Reacciones complejas)
• No se debe intentar deducir el orden de
una reacción de su ecuación
estequiométrica
(Depende del mecanismo de la reacción)
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Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato
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Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato
Efecto de proximidad y efecto de orientación
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Modelo de ajuste inducido
Hexoquinasa
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Modelo llave-cerradura
S
P
k1
k cat
ES
E
EE
k -1
k1
E+S
k cat
ES
k -1
E+P
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Los experimentos cinéticos revelan propiedades
enzimáticas
Cinética química
• Los experimentos examinan la cantidad de producto
(P) formado por unidad de tiempo (∆
∆[P] / ∆t)
• Velocidad (v) – la tasa de una reacción
(varía con la concentración de reactante)
• Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o
eficiencia de una reacción
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Cinética enzimática
• Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado
cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la
enzima
E + S
ES
E+P
• Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de
substrato (la enzima esta saturada con el substrato)
• Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E],
y la reacción es pseudo-primer orden
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Velocidad inicial (vo)
• La velocidad al inicio de una reacción catalizada
enzimáticamente es
vo (velocidad inicial)
• k1 y k-1 representan una rápida asociación
/disociación no covalente de substrato del sitio
activo de la enzima
• kcat = constante de la tasa para formación de
producto de ES
E+S
k1
k-1
kcat
ES
E+P
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Curva de progreso para una reacción catalizada
enzimáticamente
• La velocidad inicial (vo) es la
pendiente de la porción lineal
inicial de la curva
• La tasa de la reacción se duplica
cuando se usa el doble de
enzima
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Leonor Michaelis
1875-1949
Maud Menten
1879-1960
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Consideraciones de equilibrio rápido
(Ecuación de Henri-Michaelis-Menten)
1. Reacciones involucradas
k1
E+S
k -1
ES
2. Balance de masa
[E ]t = [E ] + [ES ]
3. Velocidad limitante
v = kcat [ES ]
4. Dividir por [E]t
k [ES ]
v
= cat
[E]t [E] + [ES]
5. Expresión de equilibrio
KS =
[E ][S ] ,∴ [ES ] = [S ] [E ]
[ES ]
KS
[S ] [E]
k
cat
6. Sustituir en términos de [E]
KS
v
=
[E]t [E] + [S ] [E]
KS
v
7. Donde Vmax = kcat [E]t
Vmax
k cat
=
[S ]
K S + [S ]
E+P
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Briggs
JBS Haldane
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Consideraciones de estado estacionario
(Ecuación de Briggs-Haldane)
k1
k cat
E+P
1. Reacciones involucradas
E+S
ES
k -1
d [ES ]
2. Balance de masa
= k1 [E ]⋅ [S ] − (k −1 + kcat ) ⋅ [ES ]
dt
3. En estado estacionario
4. Constante de Michaelis
d [ES ]
=0
dt
[E ]⋅ [S ] = k−1 + kcat
[ES ]
k1
5. Velocidad limitante
v = k cat [ES ]
6. Dividir por [E]t
k [ES ]
v
= cat
[E ]t [E ] + [ES ]
7. Sustituyendo [ES]
[S ] [E ]
v
KM
=
kcat [E ]t [E ] + [S ] [E ]
KM
v
8. Donde Vmax = kcat [E]t
Vmax
=
[S ]
K M + [S ]
= KM
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Cinética de Michaelis-Menten
ν
Vmax
ν =
Vmax [S]
KM + [S]
Vmax
2
KM
[S]
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La ecuación de Michaelis-Menten
• La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está
saturada con el substrato (alta [S])
• A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden
cero con respecto a S)
• A bajas [S] la reacción es de primer orden con respecto a S
• La forma de una curva vo versus [S] es una hipérbola
rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima
conforme [S] se incrementa
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Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S]
(a) Cada punto vo vs [S] se obtiene
de un experimento cinético
(b) La constante de Michaelis (KM)
iguala la concentración de
substrato necesario para
alcanzar ½ de la velocidad
máxima
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El significado de KM
• KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax
• KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación
enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1
• Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado
será el enlace del substrato
• KM puede ser una medida de la afinidad de E for S
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KM y concentraciones de substrato fisiológicas
• Los valores de KM para las
enzimas son típicamente
arriba de [S], tal que las
tasas enzimáticas son
sensibles a pequeños
cambios en [S]
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Las constantes cinéticas indican la actividad
enzimática y la especificidad
• La constante catalítica (kcat) – constante de la tasa de orden uno
para la conversión de complejo ES a E + P
• kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con
S
• La relación kcat /KM , llamada también coeficiente de
especificidad, es una constante de segundo orden para
E+S
a bajas concentraciones de [S]
E+P
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Significados de kcat y kcat/KM
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Ejemplos de constantes catalíticas
Enzyme
kcat(s-1)
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Valores of kcat/KM
• kcat/KM puede aproximar la tasa de
encuentro de dos moléculas no cargadas
en solución (108 to 109 M-1s-1)
• kcat/KM es también una medida de la
especificidad de la enzima por diferentes
substratos (constante de especificidad)
• Aceleración de la tasa = kcat/KM
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Cálculo de KM y Vmax
La gráfica doblerecíproca
Lineweaver-Burk es
una transformación
lineal de la gráfica de
Michaelis-Menten
(1/vo versus 1/[S])
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Reacciones reversibles
k1
E+S
k2
ES
k -1
E+P
k -2
Consideración de estado estacionario
V max d
v neta =
[S ]
K ms
1+
− V maxr
[S ]
K ms
+
[P ]
[P ]
K mp
K mp
Donde:
V maxd = k 2 [E ]t
K ms
k + k −1
= 2
k1
V maxr = k −1 [E ]t
K mp =
k 2 + k −1
k −2
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Inhibición por substrato
(Consideración de equilibrio rápido)
KS
E+S
1. Reacciones involucradas
k cat
ES
+
S
E+P
KI
ES2
2. Balance de masa
[E ] t = [E ] + [ES ]+[ΕS2]
3. Velocidad limitante
v = k cat [ES ]
4. Dividir por [E]t
5. Expresiones de equilibrio
v = k cat [ES ]
[E ] t [E ] + [ES ] + [ES2]
[E ][S ] ,
KS =
[ES ]
k cat
6. Sustituir en términos de [E]
7. Donde Vmax = kcat [E]t
[ES ][S
KI =
[ ES2 ]
]
[S] [E ]
KS
v =
[E ] t [E ] + [S ] [E ] + [S ]2 [E ]
KS
K S KI
v
V max
=
KS
[S ]
+ [S ]
+ [S ]2
KI
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Vmax [S ]
v=
K M + [S ] +
1 KM 1
1
1
[S ]
=
+
+
v Vmax [S ] Vmax Vmax K I
[S ]
2
Ki
0.25
25.0000
0.2
20.0000
0.15
1/v
V nmol/l*min
Inhibición por substrato
15.0000
0.1
10.0000
5.0000
0.05
[S]max
0
0.00E+00
0.0000
0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06
5.00E-06
1.00E-05
1.50E-05
1/[S]
[S] nM
1/V
1 KM 1
1
=
+
v Vmax [S ] Vmax
KI se calcula de:
[S ]max =
K M Ki
1/Vmax
-1/KM
KM/Vmax
1/[S]
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Inhibición enzimática
Los inhibidores de enzimas son importantes por varias
razones
1) Pueden ser usados para obtener información acerca de la forma del sitio
activo de la enzima y los residuos de amino ácidos en el sitio activo
2) Pueden ser usados para obtener información acerca del mecanismo químico
3) Pueden ser usados para obtener información acerca de la regulación o control
de una vía metabólica
4) Pueden ser muy importantes en el diseño de medicamentos
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Sistemas de inhibición simple
• Inhibición competitiva
• inhibición no competitiva
• Inhibición acompetitiva
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Modelo de inhibición competitiva
I
P
S
KS
kp
ES
E
E
KS
Ki
E+S
+
I
Ki
EI
EI
kp
ES
E+P
Consideración de equilibrio rápido
v
Vmax
=
[S ]

[
I]
1 +
 + [S ]
KS 

K i 
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Inhibición competitiva
1/v0
Incremento de
[I]
KM aumenta
Vmax no cambia
1/Vmax
-1/KM
1/[S]
Pend.
-KI
[I]
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Modelo de inhibición no competitiva
S
KS
E
ES
E+P
I
Ki
Ki
KS
EI
ESI
KS
E + S
+
I
Ki
KS
EI + S
E+P
ES
+
I
Consideración de equilibrio rápido
v
V max
Ki
ESI

[I ] 
1 +
K i 

[
S]
=
K S + [S ]
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Inhibición no competitiva
1/v0
Incremento de
[I]
KM no cambia
Vmax disminuye
1/Vmax
-1/KM
1/[S]
Inter.
-KI
[I]
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Modelo de inhibición acompetitiva
+ S
E
ES
kcat
E+P
KS
+ I
Ki
ESI
KS
E+S
ES
kcat
Ki
ESI
E+P
Consideración de equilibrio rápido
[S ]
v
=
Vmax
Km
+ [S ]

[I ]  1 + [I ] 
1 +
K i  
K i 

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Inhibición acompetitiva
1/v0
Incremento de
[I]
KM disminuye
Vmax disminuye
1/Vmax
1/[S]
-1/KM
Inter.
-KI
[I]
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Equilibrio rápido en sistemas bi y tri-reactantes
E +A+B
EAB
E+P
donde:
B = Sustrato
A = Cosustrato, coenzima o coactivador
E = Enzima
otas:
1. La aproximación de equilibrio rápido es útil y válida
para los sistemas de enlace aleatorio
2. La mayoría de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones
ordenadas se prefiere la aproximación de estado estacionario
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Sistemas bi-reactantes aleatorios
KB
EB
+
A
E+B
+
A
α KA
KA
α KB
EA + B
kp
EAB
Consideración de equilibrio rápido
[A ] ⋅ [B ]
v
V max
α ⋅ K AK B
=
1+
[A ] + [B ] + [A ] ⋅ [B ]
KA
KB
α ⋅ K AK B
E+P
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Sistemas bi-reactantes ordenados
EA + B
E +A
EAB
Consideración de equilibrio rápido
[A ] ⋅ [B ]
v
V max
K AK B
=
[
A ] [A ] ⋅ [B ]
1+
+
KA
K AK B
E+P
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Sistemas tri-reactantes aleatorios
EAB
+C
α β KC
EABC
+C
EA
β KC
EAC
E+P+ Q+R
EB
+C
EBC
α KC
E
v
Vmax
+C
KC
EC
Consideración de equilibrio rápido
[A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ]
α ⋅ β ⋅ γ ⋅ K AK B KC
=
[A ] + [B ] + [C ] + [A ] ⋅ [B ] + [A ] ⋅ [C ] + [B ] ⋅ [C ] + [A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ]
1+
K A K B KC γ ⋅ K AK B β ⋅ K AKC α ⋅ K B KC α ⋅ β ⋅ γ ⋅ K AK B KC
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Sistemas tri-reactantes ordenados
Sistema Ter Ter ordenado
KP
KA
KB
E
EA EAB
KC
kp
(EABC
EPQR)
EQR
Consideración de equilibrio rápido
[A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ]
v
V max
K AK B KC
=
[A ] + [A ] ⋅ [B ] + [A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ]
1+
KA
K AK B
K AK B KC
KQ
KR
ER
E
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Multisitios de enlace de sustrato
Sitios de enlace no cooperativos
v
V max
[S ] 1 + [S ] 
n −1
K S 
K S 
=
n

[
S] 
1 +

KS 

v
V max
[
S]
=
K S + [S ]
Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzina de un
sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una
molécula de n sitios de enlace
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Enzimas alostéricas
1.0
0.9
(a)
0.8
0.7
0.6
v
0.5
(b)
0.4
0.3
Enzima alostérica
0.2
0.1
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
[S]
Comparación de curvas de velocidad.
(a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal
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Enzimas alostéricas
Sitios de enlace cooperativos
(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)
Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace
KS
E+S
+
S
ES
+
S
P+ E
α KS
SE + S
E+P
α KS
KS
kp
kp
SES
kp
ES + P
SE + P
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Enzimas alostéricas
Sitios de enlace cooperativos
(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)
Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace
Consideración de equilibrio rápido
v
V max
[S ] + 3[S ]2
=
KS
aK S2
[S ]
3[S ]
+ 2
+
a bK S3 a 3b 2cK S4
3
4
S]
4[S ] 6[S ]
4[S ]
[
+
+ 2
+ 3 2 4
1+
2
3
KS
aK S
a bK S a b cK S
2
donde:
3
Vmax = 4 kp [E]t
4
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Enzimas alostéricas
Ecuación simplificada para enzimas alostéricas
(Ecuación de Hill)
Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato
es muy marcada
v
V max
[
S]
=
n
K '+[S ]
n
Donde:
n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima
K’ = Constante que involucra los factores de interacción y a la constante
de disociación intínseca