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Fidel Olmos-Vilchis1.1, Daniel L. Ochoa-Martínez1.2, Moisés Pérez-Rojas1.3, Antonio TalaveraVillarreal2.1 y Amado Pérez-Rodríguez1*.
1Colegio
REVISTA
MEXICANA DE
FITOSANIDAD
de Postgraduados. Campus Montecillo. Carretera México-Texcoco km 36.5.
Montecillo, Texcoco, estado de México. C.P. 56230.
2Departamento de Producción Agrícola-Centro Universitario de la Costa Sur.
Universidad de Guadalajara. Av. Independencia Nacional #151.
C.P. 48900, Autlán, Jalisco, México.
*Autor para correspondencia: [email protected]
Sección
Artículo científico.
Pp. 29−36
Fecha de publicación:
30-abril-2017.
Recibido:
07-11-2017
Aceptado:
17-02-2017
Correos electrónicos
[email protected]
[email protected]
1.3
[email protected]
[email protected]
RESUMEN:
En 2012 se observaron en la zona productora de nopal verdura (Opuntia ficus-indica) de San
Martín de las Pirámides, Estado de México, cladodios de la variedad “Atlixco” con halos cloróticos
irregulares de diferente tamaño alrededor de las espinas, alteración denominada localmente como
“Pinto” del nopal. Los cladodios que muestran estos síntomas adquieren una coloración cobriza en
24 ó 48 h después de cortados, lo cual impide su venta generando importantes pérdidas económicas
para el productor. Debido al desconocimiento de la causa de este problema, el objetivo de la presente
investigación fue conocer al agente causal asociado al “Pinto”. No se detectaron deficiencias
nutrimentales en tejido de plantas con síntomas y asintomáticas así como en el suelo donde éstas
crecieron. Se obtuvo un purificado parcial de virus (PPV) a partir de cladodios con síntomas de
“Pinto” con el cual se inocularon mecánicamente diez plantas indicadoras; sólo en Chenopodium
amaranticolor y C. quinoa se observaron lesiones locales cloróticas mientras que en Nicotiana
clevelandii, N. glutinosa y N. tabacum var. xanthi se tuvieron lesiones locales necróticas. Por otro
lado, se inocularon mecánicamente 21 cladodios sanos con el PPV, los cuales presentaron lesiones
cloróticas a los 30 días después de la inoculación. En rejillas preparadas con el PPV se observaron a
microscopio electrónico partículas virales con forma de varilla rígida con una longitud de 335 + 5
nm X 14 + 2 nm de diámetro. Se encontraron inclusiones amorfas y paracristalinas citoplásmicas en
células de C. quinoa inoculadas con el PPV que mostraron lesiones locales cloróticas. Se extrajo
RNA total de cladodios con síntomas de “Pinto” y se realizó RT-PCR con iniciadores universales
para Potexvirus, Allexivirus y Tobamovirus sin obtener los fragmentos esperados.
Palabras clave: Opuntia ficus-indica, plantas indicadoras, partículas virales, inclusiones virales.
ISSN: en tramite
Edita
Sociedad Mexicana de
Fitosanidad.
Calle Amado Nervo s/n,
Tepatepec.
Francisco I. Madero,
Hidalgo. C. P. 42660
Índice,
resúmenes,
abstracts, vols., en:
www.revimexfito.com.mx
© 2017 - Revista Mexicana
de Fitosanidad
Etiology of "Pinto" of Prickly Pear in the Eastern of Mexico State
ABSTRACT:
In the year of 2012 they were observed in a nopal (Opuntia ficus-indica) producing area of San
Martin de las Pirámides, Estado de México, cladodes on the “Atlixco” variety with irregular chlorotic
halos of different sizes around their thorns, that alteration is locally called as “Pinto” nopal. Cladodes
that shows these symptoms acquire a coppery color in 24 or 48 h after of have been cutted, which
impedes its sale, generating significant economic losses to producers. Due to ignorance of the cause
of this problem, the objective of this research was to know the associated agent with the “Pinto”. No
nutritional deficiencies in symptomatic and asymptomatic plants, either in the soil were they grow
there were detected. It was isolated partially purified virus (PPV) from cladodes wiht “Pynto”
symptoms, in wich then it was inoculated indicator plants; only in Chenopodium amaranticolor and
C. quinoa were observed chlorotic local lessions, while in Nicotiana clevelandii, N. glutinosa and
N. tabacum var. xanthi, it was observed local necrotic lessions. In the other hand, there were
inoculated 21 healthy clododes with PPV, they were observed with an electron microscope viral
particles rigid rode shaped with a length of 335 + 5 nm X 14 + 2 nm in diameter. Amorphous
cytoplasmatic inclusions and para-crystalline cells were observed in C. quinoa inoculated wiht PPV
showing chlorotic local lessions. Total RNA cladodes with “Pinto” symptomes was extracted and it
was performed an RT-PCR using universal primers for Potexvirus, Allexivirus and Tobamovirus,
wihtout obtaining the expected fragments. control. However, those treated with acetylsalicylic acid
had the highest benefit / cost ratio.
Key words. Opuntia ficus-indica, indicator plants, viral particles, viral inclusions.
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Olmos-Vilchis et al., Etiología del pinto del nopal en el estado de México.
INTRODUCCIÓN
Las cactáceas son nativas del continente
americano, particularmente de la zona tropical,
incluidas en aproximadamente 200 géneros. Esta
familia presenta un alto grado de endemismo y
comprende un gran número de especies, de las
cuales Opuntia ficus-indica es la de mayor
importancia económica en el mundo (INE, 2007).
México es el país donde existe la más amplia
diversidad de nopales, tanto silvestres como
cultivados con 15 especies usadas para forraje,
seis para producción de tuna y tres para nopal
verdura. En este último caso, las más importantes
son la Criolla tipo Italiana, Criolla, Tlaconopal,
Copena F1, Atlixco y Milpa Alta. El consumo de
nopal verdura se ha incrementado en los últimos
años, pasando de ser un alimento de consumo
estacional a tener un consumo constante durante
todo el año (INIFAP, 2007). Además se cultiva
como hospedante de la grana cochinilla (Reyes et
al., 2005), siendo la principal fuente de ingresos
de muchas familias al generar más de 65,000 mil
empleos directos en todo su proceso productivo
(SAGARPA, 2012). En México las dos
principales entidades productoras son Distrito
Federal y Morelos, seguidas del Estado de
México, Baja California, Michoacán y Puebla
(SIAP, 2015). Se han reportado en el nopal poco
más de 22 enfermedades de tipo fungoso,
bacteriano y viral (Monroy, 2010). En San Martín
de las Pirámides, Estado de México, se cultiva
nopal tunero y nopal verdura, este último bajo
invernadero y micro-túneles (Rodríguez et al.,
2008). A principios de 2012 se detectaron
cladodios de nopal verdura variedad “Atlixco”
con halos cloróticos alrededor de las espinas, los
cuales reducen su vida de anaquel (de 8 a 3 días
en promedio) una vez que se cortan y se les
eliminan las espinas ocasionando pérdidas
económicas para los productores de la región. Por
lo anterior, el objetivo del presente estudio fue
determinar al agente asociado al “Pinto” del
nopal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de material vegetal. En una huerta
comercial de nopal verdura variedad “Atlixco”
perteneciente a San Pablo Ixquitlán, municipio de
San Martín de las Pirámides, Estado de México,
se colectaron cladodios de diez plantas con
síntomas de “Pinto”, consistentes en manchas
cloróticas irregulares o circulares de diferente
tamaño alrededor de las espinas; como testigo se
colectaron cladodios de 10 plantas asintomáticas.
Todos los cladodios colectados se dejaron secar a
temperatura ambiente por 10 días, al término de
los cuales se sembraron en macetas de 12
pulgadas con suelo estéril y se mantuvieron en
invernadero.
Contenido nutrimental en tejido vegetal. Se
colectaron cinco cladodios con los síntomas antes
descritos y cinco asintomáticos, los cuales se
analizaron por separado en el Laboratorio Central
Universitario de la Universidad Autónoma
Chapingo en donde se determinó el contenido de
macro y micronutrientes.
Análisis de suelo. De cinco plantas con sin
síntomas y cinco asintomáticas se colectaron
muestras de suelo a 30 cm de profundidad; se
obtuvo una muestra compuesta para cada caso y
se enviaron al Laboratorio Central Universitario
de la Universidad Autónoma Chapingo para su
análisis físico y químico.
Aislamiento de hongos y bacterias. Se cortaron
trozos de cladodios con síntomas de “Pinto” de un
centímetro cuadrado de la zona de avance de las
manchas cloróticas, se desinfestaron con
hipoclorito de sodio al 1 % y se dejaron secar en
papel absorbente estéril durante 14 horas. Pasado
este tiempo, los trozos de tejido se sembraron en
cajas Petri estériles con PDA (5 trozos/caja), se
sellaron con parafilm y se mantuvieron en
laboratorio a temperatura ambiente. Como testigo
se sembraron trozos de cladodios asintomáticos
desinfestados y mantenidos en las condiciones
antes descritas. Las cajas se observaron
diariamente por un periodo de 30 días después de
la siembra.
Purificación parcial de virus. A partir de
cladodios con síntomas de “Pinto” se realizó una
purificación parcial de virus (PPV) siguiendo el
protocolo propuesto por Lastra et al. (1976).
Inoculación en plantas indicadoras. Se
inocularon mecánicamente plantas de Datura
metel, D. stramonium, Nicotiana glutinosa, N.
rustica, N. benthamiana, N. tabacum var. Xanthi,
30
Rev. Mex. Fitosanidad, 1(1): 29−36, 2017.
Nicotiana tabacum var. Samsum, N. clevelandii,
Chenopodium amaranticolor y C. quinoa
previamente espolvoreadas con carborundum 600
mallas. En cada caso se frotaron dos hojas de cada
planta con un hisopo impregnado con el PPV.
Como testigo se tuvieron plantas de las especies
antes indicadas tratadas de la misma manera pero
frotadas únicamente con buffer de fosfatos 0.1 M
pH 7.0. Todas las plantas se mantuvieron en
invernadero y se observaron cada 72 horas para
registrar la aparición de síntomas durante 30 días.
Inoculación de cladodios. Se plantaron 21
cladodios de nopal asintomáticos de la variedad
“Atlixco” en macetas de 6 pulgadas y 15 días
después se inocularon mecánicamente ocho
cladodios previamente espolvoreados con
carborundum 600 mallas y buffer de fosfatos 0.1
M pH 7.0. Cinco cladodios se inyectaron con 2 ml
de una solución preparada con 5 ml del PPV + 5
ml buffer de fosfatos 0.1 M pH 7.0; se realizaron
cuatro pinchaduras/cladodio en la parte apical y
media. El resto de los cladodios se tuvieron como
testigos (solamente con buffer). Los cladodios
inoculados mecánicamente o inyectados con el
PPV se observaron cada 72 horas durante 60 días
después de la inoculación (ddi).
Microscopía electrónica. Sobre un pedazo de
parafilm se mezclaron 10 µl del PPV con 10 µl de
ácido fosfotúngstico al 1 %, posteriormente con
unas pinzas tipo relojero se tomaron rejillas de
cobre de 300 mallas cubiertas con formvar y se
pusieron en contacto con la mezcla hasta cubrir
completamente su superficie; posteriormente se
colocaron en papel filtro para su secado y
posterior observación al microscopio electrónico
de transmisión en la Universidad Autónoma
Metropolitana campus Azcapotzalco.
Inclusiones virales. Con unas pinzas de punta
fina se tomó epidermis del envés de las hojas de
C. amaranticolor inoculadas con el PPV que
mostraron lesiones locales cloróticas y se
sumergieron en etanol al 75 % durante tres min.
Posteriormente, fragmentos de epidermis se
colocaron en Azure-A y otros en rodamina verde
de metilo durante cinco min después de lo cual se
enjuagaron con agua para quitar el exceso de
colorante. La epidermis teñida con cada colorante
se colocó por separado sobre una gota de glicerina
depositada en un portaobjetos y se observó en el
microscopio óptico a 100X (American
Optical©One–Ten). Como referencia se tuvo
epidermis de hojas de plantas no inoculadas de
esta misma especie teñidas con ambos colorantes
de la manera antes indicada.
Extracción de RNA total. En este caso se
siguió el protocolo de Harris (2002), utilizando
0.3 gramos de epidermis de cladodios con
síntomas de “Pinto” macerados en nitrógeno
líquido. El RNA obtenido se cuantificó en
Nanodrop ® (ND -100) y la electroforesis se
realizó en un gel de agarosa al 1 % durante 40
minutos a 90V.
RT–PCR. Con base en el tamaño y forma de las
partículas virales observadas en microscopía
electrónica, se realizó RT-PCR con primers
generales para a) Potexvirus (VanderVlugt y
Berendsen, 2002), Potex 1RC, Potex 2RC y 5RC
que amplifican un fragmento de 600 pb. Como
testigo positivo se tuvo RNA de una planta de
papa infectada con el Potato virus X; b)
Allexivirus (Chen et al., 2003) con el par de
primers Allex-CP (+) y NABP (-) que amplifican
un fragmento de 750 pb y c) Tobamovirus (Dovas,
2004), con los iniciadores TobRT up1, TobRT
do2,TobN up3, TobN do4 y TobN do4G que
amplifican un fragmento de 400 pb; el testigo
positivo consistió en RNA de una planta de
jitomate infectada con Tobacco mosaic virus. En
todos los casos se tuvo agua como testigo
negativo. La amplificación se llevó a cabo en un
termociclador Techne® TC-512 y los productos
de amplificación obtenidos se visualizaron
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%
(p/v) teñido con bromuro de etidio en
amortiguador TAE 1X a 95 V por 40 minutos. El
marcador de peso molecular empleado como
referencia fue de 1 Kb (Promega®). Las imágenes
se observaron en un fotodocumentador Gel Doc
2000 (BioRad©) con el programa QuantityOne
4.1.1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Contenido nutrimental en tejido vegetal. No
se tuvieron diferencias importantes en los
contenidos de nutrimentos entre cladodios con
síntomas de “Pinto” y cladodios asintomáticos
(Cuadro 1). Los valores de N, P, K, Ca y Mg de
31
Olmos-Vilchis et al., Etiología del pinto del nopal en el estado de México.
Cuadro 1. Contenido de macro y micro nutrientes en cladodios con síntomas de “Pinto” y cladodios asintomáticos.
N
P
K
Ca
Mg
Fe
Cu
Zn
Mn
B
Cladodios
(%) (%) (%) (%) (%) (mg Kg-1)
(mg Kg-1)
(mg Kg-1)
(mg Kg-1)
(mg Kg-1)
Con “Pinto”
1.5
0.3
4.5
2.7
1.3
672.5
48
55
392.5
135.2
Asintomáticos 1.8
0.3
4.7
2.7
1.3
237.5
33
70
192.5
154.1
ambos tejidos se encuentran dentro de los rangos
óptimos señalados por Blanco et al., (2006) para
Opuntia ficus-indica. Adicionalmente se encontró
que la concentración de Fe en cladodios con
síntomas es muy alta con respecto de la de
cladodios asintomáticos. Sin embargo, no puede
decirse si estos valores son normales ya que no se
encontraron datos específicos de este elemento
para O. ficus-indica. El hierro es el cuarto
elemento más abundante en la corteza terrestre
(Lindsay, 1979; Benavides, 2000), es un
micronutrimento esencial para las plantas ya que
participa en la fotosíntesis (Miller et al., 1984;
Marchner, 1995), además de ser responsable de la
morfología, estructura y mantenimiento de los
cloroplastos (Abadía, 1992; Marschner, 1995). La
deficiencia de Fe provoca una reducción en la
síntesis de pigmentos (clorofilas), por eso, los
pigmentos amarillos (xantofilas y carotenos)
predominan
y
son
responsables
del
amarillamiento foliar (Seibert, 1993). El aumento
del pH en una sola unidad puede disminuir la
solubilidad de este elemento hasta 1000 veces
(Lindsay, 1995). Por otro lado, se sabe que
concentraciones elevadas de Zn2+ y Mn2+ en el
medio interfieren con la absorción de Fe2+ por la
raíz (Cohen et al., 1998; Foy et al., 1998;
Izaguierre-Mayoral y Sinclair, 2005; Adiloglu,
2006; Aref, 2011; Shanmugam et al., 2011). En la
actualidad se desconocen las concentraciones
óptimas de Fe++ en tejido de nopal; sin embargo,
el alto contenido de este elemento en plantas con
síntomas de “Pinto” con respecto de las
asintomáticas (Cuadro 1) es muy marcada, lo cual
puede ser una respuesta de la planta para corregir
esta clorosis. Asimismo, no hay información
disponible de los contenidos óptimos de Cu, Zn,
Mn y B para nopal por lo que no puede
establecerse si hay suficiencia o deficiencia de los
mismos en las muestras analizadas y su posible
relación con los síntomas de “Pinto”.
Análisis de suelo. De acuerdo a los resultados,
la textura del suelo donde se colectaron las plantas
de nopal con síntomas de “Pinto” y plantas
asintomáticas fue franca (Cuadro 2). Asimismo, el
pH en ambos casos fue ligeramente alcalino
(Cuadro 3). Se sabe que las plantas de nopal
prefieren suelos calcáreos con pH alcalino aunque
también es posible obtener altos rendimientos en
suelos ligeramente ácidos. El rango de pH del
suelo recomendado para nopal va de 6.8 a 8.2, con
un óptimo de 7.5 (FAO, 1994).
El contenido de materia orgánica del suelo
donde crecen las plantas de nopal con síntomas de
“Pinto” es ligeramente menor comparado con el
del suelo donde crecen las plantas asintomáticas.
La materia orgánica, al igual que el pH,
determinan la disponibilidad de nutrimentos en el
suelo. En el caso particular del suelo donde crecen
los nopales con síntomas de “Pinto” y
asintomáticos, los valores de los dos primeros se
consideran adecuados para el nopal (Sainz et al.,
2011). Se observó que la concentración en el suelo
de Fe++ (Cuadro 3) tiene un comportamiento
similar con respecto a la concentración de este
elemento en el tejido (Cuadro 1). Es posible que
la alta concentración de este elemento en aquellos
cladodios que muestran halos cloróticos se deba a
una alteración en el funcionamiento de la planta
ya que al presentarse una reducción en su
capacidad
fotosintética
absorbe
grandes
cantidades de este elemento para corregir el
problema (Lindsay, 1979; Benavides, 2000).
Considerando lo anterior, los halos cloróticos
observados en cladodios con “Pinto” no pueden
asociarse a una deficiencia de Fe++ en el suelo o a
un bajo contenido en la planta.
Aislamiento de hongos y bacterias. No se tuvo
crecimiento de hongos y bacterias en trozos de
cladodios de nopal con síntomas de “Pinto” y de
cladodios asintomáticos como lo reportado por
Barrera et al. (2014) quienes realizaron el mismo
procedimiento en nopal asociado a síntomas
causados por virus.
Inoculación en plantas indicadoras. En
Nicotiana glutinosa, N. tabacum var. Xanthi y
32
Rev. Mex. Fitosanidad, 1(1): 29−36, 2017.
Cuadro 2. Porcentaje de arena, limo, arcilla y textura de suelo donde crecen plantas de
nopal con síntomas de “Pinto” y plantas asintomáticas.
Muestras de suelo
Con “Pinto”
Asintomático
% arena
25.6
25.6
% limo
47.7
49.0
% arcilla
26.7
25.4
Textura
Franca
Franca
Cuadro 3. Valores de pH, materia orgánica (MO), contenido de macro y micronutrimentos (mg Kg -1) de suelo donde crecen
plantas de nopal con síntomas de “Pinto” y plantas asintomáticas.
Muestra de suelo
pH MO
N
P
K
Ca
Mg
Fe
Cu
Zn
Mn
B
Con “Pinto”
7.6
1.8
9.3 62.6 732 3490
1109
6.1
2.9
3.1
2.8
0.9
Asintomático
7.9
2.9 11.6 86.0 922 3268
1092
6.2
3.2
3.2
2.4
1.1
Nicotiana clevelandii se observaron lesiones
locales necróticas en las hojas inoculadas con el
PPV (Fig. 2A, B y C), mientras que en el caso
de Chenopodium amaranticolor y C. quinoa se
obtuvieron lesiones locales. Las enfermedades
provocadas por virus en cactáceas no han sido
suficientemente estudiadas en México; a nivel
mundial se reportan virus pertenecientes a cinco
géneros afectando diversas especies de
cactáceas: Potexvirus, Tobamovirus, Carmovirus,
Tospovirus y Carlavirus (Mudrak et al., 2008).
Inoculación de cladodios. Aquellos
cladodios inoculados mecánicamente solo con
carborundum y buffer de fosfatos no mostraron
síntomas. Los cladodios inoculados mediante
inyección con el PPV, comenzaron a presentar
clorosis alrededor de las espinas 20 días
después de la inoculación (ddi) (Fig. 1B). En
contraste con lo documentado por Barrera et al.,
(2014), que inocularon un PPV en cladodios de
nopal mecánicamente y observaron síntomas a
los siete ddi. A los 50 ddi se observó una
clorosis en casi toda la superficie del cladodio
la cual fue haciéndose menos evidente
conforme avanzaba el tiempo (Fig. 1D).
Microscopía electrónica. En PPV obtenido a
partir de cladodios con síntomas de “Pinto” se
observaron partículas virales en forma de
varilla rígida con una longitud de 320-350 nm
de largo por 12.8-14 nm de diámetro (Fig. 3A).
De igual manera, en los cladodios inoculados
con el PPV que presentaron síntomas similares
al “Pinto”, se observaron partículas virales con
una longitud de 320 – 360 nm por 13 -16 nm de
diámetro (Fig. 3B). Las partículas virales en
forma de varilla rígida observadas en el PPV
obtenido de cladodios con síntomas de “Pinto”
son muy parecidas en forma y tamaño (335 + 5
nm de longitud X 14 + 2 nm de ancho) a las del
género Tobamovirus (Fauquet et al., 2005). El
virus asociado al “Pinto” del nopal verdura
estudiado en esta investigación tiene una
longitud similar (320-350 nm) pero a diferencia
de lo reportado por De la Torre et al. (2007)
indujeron lesiones locales cloróticas en C.
quinoa. El Tobamovirus Cactus mild mottle
virus posee una partícula con una longitud de
320 X 18 nm de diámetro pero infecta
solamente a Chenopodium quinoa y C.
amaranticolor (Min et al., 2006) mientras que
el virus asociado al “Pinto” infecta además a
Nicotiana glutinosa, N. tabacum var. xanthi y
N. clevelandii.
Inclusiones virales. En epidermis de hojas de
Chenopodiumam aranticolor inoculadas con el
purificado parcial de virus y teñida con azufreA se observaron inclusiones citoplásmicas
alargadas en forma de huso (Fig. 3C) y en
aquellas teñidas con rodamina verde de metilo
se presentaron cuerpos amorfos (Fig. 3D). Estas
estructuras no se observaron en epidermis de
hojas de plantas no inoculadas de esta misma
especie. Se sabe que los Tobamovirus inducen
comúnmente la formación dos tipos de
inclusiones virales: cristalinas y paracristalinas
(Christie y Edwarson, 1977), siendo estas
últimas observadas en epidermis de plantas de
Chenopodium
amaranticolor
inoculadas
mecánicamente con el PPV. No obstante, la
presencia de inclusiones citoplásmicas amorfas
en este mismo tejido no corresponde con lo
reportado por los anteriores autores, por lo que
no es posible asociarlo al “Pinto”.
Extracción de RNA total. El RNA total
obtenido de las muestras procesadas tuvo una
concentración promedio de 116 ng/µl, la cual
33
Olmos-Vilchis et al., Etiología del pinto del nopal en el estado de México.
C
B
A
D
E
Figura 1. Síntomas observados en cladodios inoculados con el purificado parcial de virus (PPV) obtenido a partir de A)
Cladodios con halos cloróticos alrededor de las espinas (“Pinto” del nopal) colectados en campo. B) Halos cloróticos a los
20 días después de la inoculación (ddi). C) Manchas cloróticas a los 30 ddi. D) Clorosis y manchas anulares cloróticas a los
50 ddi. E) Cladodio tratado con buffer de fosfatos (Testigo).
A
B
C
D
E
Figura 2. Síntomas observados en plantas indicadoras inoculadas con el purificado parcial de virus (PPV) obtenido de
cladodios de nopal con síntomas de “Pinto”. Lesiones locales necróticas en A) Nicotiana glutinosa, B) N. tabacum var. Xanthi
y C) N. clevelandii. D) Chenopodium amaranticolor y E) lesiones locales cloróticas en C. quinoa cloróticas (Figuras 2D y
E); el resto de las diferenciales no mostraron síntomas.
A
B
C
D
Figura 3. Partículas virales observadas en el A) purificado parcial de virus (PPV) obtenido de cladodios con síntomas de
“Pinto” colectados en campo y B) obtenido de cladodios inoculados con PPV. C) Epidermis de hojas de Chenopodium
amaranticolor inoculadas con el PPV obtenido de cladodios con síntomas de “Pinto” mostrando una inclusión viral
paracristalina (E=Estoma, N=núcleo, I= Inclusión viral) y D) amorfa (N=núcleo, I=inclusión viral).
se considera adecuada si se toma en cuenta que la
extracción de RNA en nopal es difícil debido al
mucílago que posee (Nobel et al., 1992). Los
valores de pureza oscilaron de 1.90 a 2.05 que
indican una presencia mínima de contaminantes
como fenoles, péptidos y otros componentes que
podrían interferir en la reacción de PCR (Tapia et
al, 2005) (Fig. 4.4). A pesar de esto último, se
procedió a realizar RT PCR con primers específicos
para el transcrito del gen 18S que amplifican un
34
Rev. Mex. Fitosanidad, 1(1): 29−36, 2017.
fragmento de 300 pb aproximadamente y
determinar que dichos compuestos no afectaban la
reacción.
RT-PCR. No se observó amplificación en la
RT-PCR a partir de RNA de cladodios con
síntomas de “Pinto” utilizando primers
universales para Potexvirus (Fig. 4B). A
diferencia de lo reportado por Barrera et al.,
A
B
(2014), quienes si amplificaron un fragmento de
RNA correspondiente a una especie del género
Potexvirus. Con los primers universales para
Allexivirus se obtuvo una banda no esperada de
750-800 pb en la muestra 3 (Fig. 4C), mientras
que con los primers universales para Tobamovirus
se amplificó una banda de 400 pb; muestra (Fig.
4D).
C
D
Figura 4. Productos obtenidos de RT- PCR a partir de RNA total de cladodios con síntomas de “Pinto” utilizando los siguientes
primers: A) específicos para el gen 18S (300 pb aproximadamente); B) primers universales para Potexvirus, M; marcador
molecular 1kb (PROMEGA®); carriles 2-5 muestras de nopal con síntomas de “Pinto”; carril 6; RNA de papa infectada con
Potato virus X. C) primers universales para Allexivirus, M; marcador molecular; 1kb (PROMEGA®); carriles M1-M9:
muestras de cladodios con síntomas de “Pinto”; carril TN: testigo negativo (agua). D) primers universales para Tobamovirus,
M; marcador molecular 1kb (PROMEGA®), carrilles M-3 y M7: RNA de cladodios con síntomas de “Pinto”; TMV RNA de
planta de jitomate infectada con Tobacco mosaic virus.
CONCLUSIONES
La sintomatología presentada en cladodios de
nopal en forma de halos cloróticos alrededor de
las espinas no está asociado a alguna deficiencia
de nutrientes.
Se descarta la asociación de algún hongo o
bacteria fitopatógena con el síntoma denominado
“Pinto”.
El virus asociado al “Pinto” del nopal no
pertenece al género Potexvirus o Allexivirus y
posiblemente se trate de un Tobamovirus.
LITERATURA CITADA
ABADÍA, J. 1992. Leaf Responses to Fe deficiency: a
review. J. Plant Nutr., 15: 1699−1713.
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