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Fidel Olmos-Vilchis1.1, Daniel L. Ochoa-Martínez1.2, Moisés Pérez-Rojas1.3, Antonio TalaveraVillarreal2.1 y Amado Pérez-Rodríguez1*. 1Colegio REVISTA MEXICANA DE FITOSANIDAD de Postgraduados. Campus Montecillo. Carretera México-Texcoco km 36.5. Montecillo, Texcoco, estado de México. C.P. 56230. 2Departamento de Producción Agrícola-Centro Universitario de la Costa Sur. Universidad de Guadalajara. Av. Independencia Nacional #151. C.P. 48900, Autlán, Jalisco, México. *Autor para correspondencia: [email protected] Sección Artículo científico. Pp. 29−36 Fecha de publicación: 30-abril-2017. Recibido: 07-11-2017 Aceptado: 17-02-2017 Correos electrónicos [email protected] [email protected] 1.3 [email protected] [email protected] RESUMEN: En 2012 se observaron en la zona productora de nopal verdura (Opuntia ficus-indica) de San Martín de las Pirámides, Estado de México, cladodios de la variedad “Atlixco” con halos cloróticos irregulares de diferente tamaño alrededor de las espinas, alteración denominada localmente como “Pinto” del nopal. Los cladodios que muestran estos síntomas adquieren una coloración cobriza en 24 ó 48 h después de cortados, lo cual impide su venta generando importantes pérdidas económicas para el productor. Debido al desconocimiento de la causa de este problema, el objetivo de la presente investigación fue conocer al agente causal asociado al “Pinto”. No se detectaron deficiencias nutrimentales en tejido de plantas con síntomas y asintomáticas así como en el suelo donde éstas crecieron. Se obtuvo un purificado parcial de virus (PPV) a partir de cladodios con síntomas de “Pinto” con el cual se inocularon mecánicamente diez plantas indicadoras; sólo en Chenopodium amaranticolor y C. quinoa se observaron lesiones locales cloróticas mientras que en Nicotiana clevelandii, N. glutinosa y N. tabacum var. xanthi se tuvieron lesiones locales necróticas. Por otro lado, se inocularon mecánicamente 21 cladodios sanos con el PPV, los cuales presentaron lesiones cloróticas a los 30 días después de la inoculación. En rejillas preparadas con el PPV se observaron a microscopio electrónico partículas virales con forma de varilla rígida con una longitud de 335 + 5 nm X 14 + 2 nm de diámetro. Se encontraron inclusiones amorfas y paracristalinas citoplásmicas en células de C. quinoa inoculadas con el PPV que mostraron lesiones locales cloróticas. Se extrajo RNA total de cladodios con síntomas de “Pinto” y se realizó RT-PCR con iniciadores universales para Potexvirus, Allexivirus y Tobamovirus sin obtener los fragmentos esperados. Palabras clave: Opuntia ficus-indica, plantas indicadoras, partículas virales, inclusiones virales. ISSN: en tramite Edita Sociedad Mexicana de Fitosanidad. Calle Amado Nervo s/n, Tepatepec. Francisco I. Madero, Hidalgo. C. P. 42660 Índice, resúmenes, abstracts, vols., en: www.revimexfito.com.mx © 2017 - Revista Mexicana de Fitosanidad Etiology of "Pinto" of Prickly Pear in the Eastern of Mexico State ABSTRACT: In the year of 2012 they were observed in a nopal (Opuntia ficus-indica) producing area of San Martin de las Pirámides, Estado de México, cladodes on the “Atlixco” variety with irregular chlorotic halos of different sizes around their thorns, that alteration is locally called as “Pinto” nopal. Cladodes that shows these symptoms acquire a coppery color in 24 or 48 h after of have been cutted, which impedes its sale, generating significant economic losses to producers. Due to ignorance of the cause of this problem, the objective of this research was to know the associated agent with the “Pinto”. No nutritional deficiencies in symptomatic and asymptomatic plants, either in the soil were they grow there were detected. It was isolated partially purified virus (PPV) from cladodes wiht “Pynto” symptoms, in wich then it was inoculated indicator plants; only in Chenopodium amaranticolor and C. quinoa were observed chlorotic local lessions, while in Nicotiana clevelandii, N. glutinosa and N. tabacum var. xanthi, it was observed local necrotic lessions. In the other hand, there were inoculated 21 healthy clododes with PPV, they were observed with an electron microscope viral particles rigid rode shaped with a length of 335 + 5 nm X 14 + 2 nm in diameter. Amorphous cytoplasmatic inclusions and para-crystalline cells were observed in C. quinoa inoculated wiht PPV showing chlorotic local lessions. Total RNA cladodes with “Pinto” symptomes was extracted and it was performed an RT-PCR using universal primers for Potexvirus, Allexivirus and Tobamovirus, wihtout obtaining the expected fragments. control. However, those treated with acetylsalicylic acid had the highest benefit / cost ratio. Key words. Opuntia ficus-indica, indicator plants, viral particles, viral inclusions. 29 Olmos-Vilchis et al., Etiología del pinto del nopal en el estado de México. INTRODUCCIÓN Las cactáceas son nativas del continente americano, particularmente de la zona tropical, incluidas en aproximadamente 200 géneros. Esta familia presenta un alto grado de endemismo y comprende un gran número de especies, de las cuales Opuntia ficus-indica es la de mayor importancia económica en el mundo (INE, 2007). México es el país donde existe la más amplia diversidad de nopales, tanto silvestres como cultivados con 15 especies usadas para forraje, seis para producción de tuna y tres para nopal verdura. En este último caso, las más importantes son la Criolla tipo Italiana, Criolla, Tlaconopal, Copena F1, Atlixco y Milpa Alta. El consumo de nopal verdura se ha incrementado en los últimos años, pasando de ser un alimento de consumo estacional a tener un consumo constante durante todo el año (INIFAP, 2007). Además se cultiva como hospedante de la grana cochinilla (Reyes et al., 2005), siendo la principal fuente de ingresos de muchas familias al generar más de 65,000 mil empleos directos en todo su proceso productivo (SAGARPA, 2012). En México las dos principales entidades productoras son Distrito Federal y Morelos, seguidas del Estado de México, Baja California, Michoacán y Puebla (SIAP, 2015). Se han reportado en el nopal poco más de 22 enfermedades de tipo fungoso, bacteriano y viral (Monroy, 2010). En San Martín de las Pirámides, Estado de México, se cultiva nopal tunero y nopal verdura, este último bajo invernadero y micro-túneles (Rodríguez et al., 2008). A principios de 2012 se detectaron cladodios de nopal verdura variedad “Atlixco” con halos cloróticos alrededor de las espinas, los cuales reducen su vida de anaquel (de 8 a 3 días en promedio) una vez que se cortan y se les eliminan las espinas ocasionando pérdidas económicas para los productores de la región. Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar al agente asociado al “Pinto” del nopal. MATERIALES Y MÉTODOS Colecta de material vegetal. En una huerta comercial de nopal verdura variedad “Atlixco” perteneciente a San Pablo Ixquitlán, municipio de San Martín de las Pirámides, Estado de México, se colectaron cladodios de diez plantas con síntomas de “Pinto”, consistentes en manchas cloróticas irregulares o circulares de diferente tamaño alrededor de las espinas; como testigo se colectaron cladodios de 10 plantas asintomáticas. Todos los cladodios colectados se dejaron secar a temperatura ambiente por 10 días, al término de los cuales se sembraron en macetas de 12 pulgadas con suelo estéril y se mantuvieron en invernadero. Contenido nutrimental en tejido vegetal. Se colectaron cinco cladodios con los síntomas antes descritos y cinco asintomáticos, los cuales se analizaron por separado en el Laboratorio Central Universitario de la Universidad Autónoma Chapingo en donde se determinó el contenido de macro y micronutrientes. Análisis de suelo. De cinco plantas con sin síntomas y cinco asintomáticas se colectaron muestras de suelo a 30 cm de profundidad; se obtuvo una muestra compuesta para cada caso y se enviaron al Laboratorio Central Universitario de la Universidad Autónoma Chapingo para su análisis físico y químico. Aislamiento de hongos y bacterias. Se cortaron trozos de cladodios con síntomas de “Pinto” de un centímetro cuadrado de la zona de avance de las manchas cloróticas, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1 % y se dejaron secar en papel absorbente estéril durante 14 horas. Pasado este tiempo, los trozos de tejido se sembraron en cajas Petri estériles con PDA (5 trozos/caja), se sellaron con parafilm y se mantuvieron en laboratorio a temperatura ambiente. Como testigo se sembraron trozos de cladodios asintomáticos desinfestados y mantenidos en las condiciones antes descritas. Las cajas se observaron diariamente por un periodo de 30 días después de la siembra. Purificación parcial de virus. A partir de cladodios con síntomas de “Pinto” se realizó una purificación parcial de virus (PPV) siguiendo el protocolo propuesto por Lastra et al. (1976). Inoculación en plantas indicadoras. Se inocularon mecánicamente plantas de Datura metel, D. stramonium, Nicotiana glutinosa, N. rustica, N. benthamiana, N. tabacum var. Xanthi, 30 Rev. Mex. Fitosanidad, 1(1): 29−36, 2017. Nicotiana tabacum var. Samsum, N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor y C. quinoa previamente espolvoreadas con carborundum 600 mallas. En cada caso se frotaron dos hojas de cada planta con un hisopo impregnado con el PPV. Como testigo se tuvieron plantas de las especies antes indicadas tratadas de la misma manera pero frotadas únicamente con buffer de fosfatos 0.1 M pH 7.0. Todas las plantas se mantuvieron en invernadero y se observaron cada 72 horas para registrar la aparición de síntomas durante 30 días. Inoculación de cladodios. Se plantaron 21 cladodios de nopal asintomáticos de la variedad “Atlixco” en macetas de 6 pulgadas y 15 días después se inocularon mecánicamente ocho cladodios previamente espolvoreados con carborundum 600 mallas y buffer de fosfatos 0.1 M pH 7.0. Cinco cladodios se inyectaron con 2 ml de una solución preparada con 5 ml del PPV + 5 ml buffer de fosfatos 0.1 M pH 7.0; se realizaron cuatro pinchaduras/cladodio en la parte apical y media. El resto de los cladodios se tuvieron como testigos (solamente con buffer). Los cladodios inoculados mecánicamente o inyectados con el PPV se observaron cada 72 horas durante 60 días después de la inoculación (ddi). Microscopía electrónica. Sobre un pedazo de parafilm se mezclaron 10 µl del PPV con 10 µl de ácido fosfotúngstico al 1 %, posteriormente con unas pinzas tipo relojero se tomaron rejillas de cobre de 300 mallas cubiertas con formvar y se pusieron en contacto con la mezcla hasta cubrir completamente su superficie; posteriormente se colocaron en papel filtro para su secado y posterior observación al microscopio electrónico de transmisión en la Universidad Autónoma Metropolitana campus Azcapotzalco. Inclusiones virales. Con unas pinzas de punta fina se tomó epidermis del envés de las hojas de C. amaranticolor inoculadas con el PPV que mostraron lesiones locales cloróticas y se sumergieron en etanol al 75 % durante tres min. Posteriormente, fragmentos de epidermis se colocaron en Azure-A y otros en rodamina verde de metilo durante cinco min después de lo cual se enjuagaron con agua para quitar el exceso de colorante. La epidermis teñida con cada colorante se colocó por separado sobre una gota de glicerina depositada en un portaobjetos y se observó en el microscopio óptico a 100X (American Optical©One–Ten). Como referencia se tuvo epidermis de hojas de plantas no inoculadas de esta misma especie teñidas con ambos colorantes de la manera antes indicada. Extracción de RNA total. En este caso se siguió el protocolo de Harris (2002), utilizando 0.3 gramos de epidermis de cladodios con síntomas de “Pinto” macerados en nitrógeno líquido. El RNA obtenido se cuantificó en Nanodrop ® (ND -100) y la electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 1 % durante 40 minutos a 90V. RT–PCR. Con base en el tamaño y forma de las partículas virales observadas en microscopía electrónica, se realizó RT-PCR con primers generales para a) Potexvirus (VanderVlugt y Berendsen, 2002), Potex 1RC, Potex 2RC y 5RC que amplifican un fragmento de 600 pb. Como testigo positivo se tuvo RNA de una planta de papa infectada con el Potato virus X; b) Allexivirus (Chen et al., 2003) con el par de primers Allex-CP (+) y NABP (-) que amplifican un fragmento de 750 pb y c) Tobamovirus (Dovas, 2004), con los iniciadores TobRT up1, TobRT do2,TobN up3, TobN do4 y TobN do4G que amplifican un fragmento de 400 pb; el testigo positivo consistió en RNA de una planta de jitomate infectada con Tobacco mosaic virus. En todos los casos se tuvo agua como testigo negativo. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Techne® TC-512 y los productos de amplificación obtenidos se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) teñido con bromuro de etidio en amortiguador TAE 1X a 95 V por 40 minutos. El marcador de peso molecular empleado como referencia fue de 1 Kb (Promega®). Las imágenes se observaron en un fotodocumentador Gel Doc 2000 (BioRad©) con el programa QuantityOne 4.1.1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Contenido nutrimental en tejido vegetal. No se tuvieron diferencias importantes en los contenidos de nutrimentos entre cladodios con síntomas de “Pinto” y cladodios asintomáticos (Cuadro 1). Los valores de N, P, K, Ca y Mg de 31 Olmos-Vilchis et al., Etiología del pinto del nopal en el estado de México. Cuadro 1. Contenido de macro y micro nutrientes en cladodios con síntomas de “Pinto” y cladodios asintomáticos. N P K Ca Mg Fe Cu Zn Mn B Cladodios (%) (%) (%) (%) (%) (mg Kg-1) (mg Kg-1) (mg Kg-1) (mg Kg-1) (mg Kg-1) Con “Pinto” 1.5 0.3 4.5 2.7 1.3 672.5 48 55 392.5 135.2 Asintomáticos 1.8 0.3 4.7 2.7 1.3 237.5 33 70 192.5 154.1 ambos tejidos se encuentran dentro de los rangos óptimos señalados por Blanco et al., (2006) para Opuntia ficus-indica. Adicionalmente se encontró que la concentración de Fe en cladodios con síntomas es muy alta con respecto de la de cladodios asintomáticos. Sin embargo, no puede decirse si estos valores son normales ya que no se encontraron datos específicos de este elemento para O. ficus-indica. El hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre (Lindsay, 1979; Benavides, 2000), es un micronutrimento esencial para las plantas ya que participa en la fotosíntesis (Miller et al., 1984; Marchner, 1995), además de ser responsable de la morfología, estructura y mantenimiento de los cloroplastos (Abadía, 1992; Marschner, 1995). La deficiencia de Fe provoca una reducción en la síntesis de pigmentos (clorofilas), por eso, los pigmentos amarillos (xantofilas y carotenos) predominan y son responsables del amarillamiento foliar (Seibert, 1993). El aumento del pH en una sola unidad puede disminuir la solubilidad de este elemento hasta 1000 veces (Lindsay, 1995). Por otro lado, se sabe que concentraciones elevadas de Zn2+ y Mn2+ en el medio interfieren con la absorción de Fe2+ por la raíz (Cohen et al., 1998; Foy et al., 1998; Izaguierre-Mayoral y Sinclair, 2005; Adiloglu, 2006; Aref, 2011; Shanmugam et al., 2011). En la actualidad se desconocen las concentraciones óptimas de Fe++ en tejido de nopal; sin embargo, el alto contenido de este elemento en plantas con síntomas de “Pinto” con respecto de las asintomáticas (Cuadro 1) es muy marcada, lo cual puede ser una respuesta de la planta para corregir esta clorosis. Asimismo, no hay información disponible de los contenidos óptimos de Cu, Zn, Mn y B para nopal por lo que no puede establecerse si hay suficiencia o deficiencia de los mismos en las muestras analizadas y su posible relación con los síntomas de “Pinto”. Análisis de suelo. De acuerdo a los resultados, la textura del suelo donde se colectaron las plantas de nopal con síntomas de “Pinto” y plantas asintomáticas fue franca (Cuadro 2). Asimismo, el pH en ambos casos fue ligeramente alcalino (Cuadro 3). Se sabe que las plantas de nopal prefieren suelos calcáreos con pH alcalino aunque también es posible obtener altos rendimientos en suelos ligeramente ácidos. El rango de pH del suelo recomendado para nopal va de 6.8 a 8.2, con un óptimo de 7.5 (FAO, 1994). El contenido de materia orgánica del suelo donde crecen las plantas de nopal con síntomas de “Pinto” es ligeramente menor comparado con el del suelo donde crecen las plantas asintomáticas. La materia orgánica, al igual que el pH, determinan la disponibilidad de nutrimentos en el suelo. En el caso particular del suelo donde crecen los nopales con síntomas de “Pinto” y asintomáticos, los valores de los dos primeros se consideran adecuados para el nopal (Sainz et al., 2011). Se observó que la concentración en el suelo de Fe++ (Cuadro 3) tiene un comportamiento similar con respecto a la concentración de este elemento en el tejido (Cuadro 1). Es posible que la alta concentración de este elemento en aquellos cladodios que muestran halos cloróticos se deba a una alteración en el funcionamiento de la planta ya que al presentarse una reducción en su capacidad fotosintética absorbe grandes cantidades de este elemento para corregir el problema (Lindsay, 1979; Benavides, 2000). Considerando lo anterior, los halos cloróticos observados en cladodios con “Pinto” no pueden asociarse a una deficiencia de Fe++ en el suelo o a un bajo contenido en la planta. Aislamiento de hongos y bacterias. No se tuvo crecimiento de hongos y bacterias en trozos de cladodios de nopal con síntomas de “Pinto” y de cladodios asintomáticos como lo reportado por Barrera et al. (2014) quienes realizaron el mismo procedimiento en nopal asociado a síntomas causados por virus. Inoculación en plantas indicadoras. En Nicotiana glutinosa, N. tabacum var. Xanthi y 32 Rev. Mex. Fitosanidad, 1(1): 29−36, 2017. Cuadro 2. Porcentaje de arena, limo, arcilla y textura de suelo donde crecen plantas de nopal con síntomas de “Pinto” y plantas asintomáticas. Muestras de suelo Con “Pinto” Asintomático % arena 25.6 25.6 % limo 47.7 49.0 % arcilla 26.7 25.4 Textura Franca Franca Cuadro 3. Valores de pH, materia orgánica (MO), contenido de macro y micronutrimentos (mg Kg -1) de suelo donde crecen plantas de nopal con síntomas de “Pinto” y plantas asintomáticas. Muestra de suelo pH MO N P K Ca Mg Fe Cu Zn Mn B Con “Pinto” 7.6 1.8 9.3 62.6 732 3490 1109 6.1 2.9 3.1 2.8 0.9 Asintomático 7.9 2.9 11.6 86.0 922 3268 1092 6.2 3.2 3.2 2.4 1.1 Nicotiana clevelandii se observaron lesiones locales necróticas en las hojas inoculadas con el PPV (Fig. 2A, B y C), mientras que en el caso de Chenopodium amaranticolor y C. quinoa se obtuvieron lesiones locales. Las enfermedades provocadas por virus en cactáceas no han sido suficientemente estudiadas en México; a nivel mundial se reportan virus pertenecientes a cinco géneros afectando diversas especies de cactáceas: Potexvirus, Tobamovirus, Carmovirus, Tospovirus y Carlavirus (Mudrak et al., 2008). Inoculación de cladodios. Aquellos cladodios inoculados mecánicamente solo con carborundum y buffer de fosfatos no mostraron síntomas. Los cladodios inoculados mediante inyección con el PPV, comenzaron a presentar clorosis alrededor de las espinas 20 días después de la inoculación (ddi) (Fig. 1B). En contraste con lo documentado por Barrera et al., (2014), que inocularon un PPV en cladodios de nopal mecánicamente y observaron síntomas a los siete ddi. A los 50 ddi se observó una clorosis en casi toda la superficie del cladodio la cual fue haciéndose menos evidente conforme avanzaba el tiempo (Fig. 1D). Microscopía electrónica. En PPV obtenido a partir de cladodios con síntomas de “Pinto” se observaron partículas virales en forma de varilla rígida con una longitud de 320-350 nm de largo por 12.8-14 nm de diámetro (Fig. 3A). De igual manera, en los cladodios inoculados con el PPV que presentaron síntomas similares al “Pinto”, se observaron partículas virales con una longitud de 320 – 360 nm por 13 -16 nm de diámetro (Fig. 3B). Las partículas virales en forma de varilla rígida observadas en el PPV obtenido de cladodios con síntomas de “Pinto” son muy parecidas en forma y tamaño (335 + 5 nm de longitud X 14 + 2 nm de ancho) a las del género Tobamovirus (Fauquet et al., 2005). El virus asociado al “Pinto” del nopal verdura estudiado en esta investigación tiene una longitud similar (320-350 nm) pero a diferencia de lo reportado por De la Torre et al. (2007) indujeron lesiones locales cloróticas en C. quinoa. El Tobamovirus Cactus mild mottle virus posee una partícula con una longitud de 320 X 18 nm de diámetro pero infecta solamente a Chenopodium quinoa y C. amaranticolor (Min et al., 2006) mientras que el virus asociado al “Pinto” infecta además a Nicotiana glutinosa, N. tabacum var. xanthi y N. clevelandii. Inclusiones virales. En epidermis de hojas de Chenopodiumam aranticolor inoculadas con el purificado parcial de virus y teñida con azufreA se observaron inclusiones citoplásmicas alargadas en forma de huso (Fig. 3C) y en aquellas teñidas con rodamina verde de metilo se presentaron cuerpos amorfos (Fig. 3D). Estas estructuras no se observaron en epidermis de hojas de plantas no inoculadas de esta misma especie. Se sabe que los Tobamovirus inducen comúnmente la formación dos tipos de inclusiones virales: cristalinas y paracristalinas (Christie y Edwarson, 1977), siendo estas últimas observadas en epidermis de plantas de Chenopodium amaranticolor inoculadas mecánicamente con el PPV. No obstante, la presencia de inclusiones citoplásmicas amorfas en este mismo tejido no corresponde con lo reportado por los anteriores autores, por lo que no es posible asociarlo al “Pinto”. Extracción de RNA total. El RNA total obtenido de las muestras procesadas tuvo una concentración promedio de 116 ng/µl, la cual 33 Olmos-Vilchis et al., Etiología del pinto del nopal en el estado de México. C B A D E Figura 1. Síntomas observados en cladodios inoculados con el purificado parcial de virus (PPV) obtenido a partir de A) Cladodios con halos cloróticos alrededor de las espinas (“Pinto” del nopal) colectados en campo. B) Halos cloróticos a los 20 días después de la inoculación (ddi). C) Manchas cloróticas a los 30 ddi. D) Clorosis y manchas anulares cloróticas a los 50 ddi. E) Cladodio tratado con buffer de fosfatos (Testigo). A B C D E Figura 2. Síntomas observados en plantas indicadoras inoculadas con el purificado parcial de virus (PPV) obtenido de cladodios de nopal con síntomas de “Pinto”. Lesiones locales necróticas en A) Nicotiana glutinosa, B) N. tabacum var. Xanthi y C) N. clevelandii. D) Chenopodium amaranticolor y E) lesiones locales cloróticas en C. quinoa cloróticas (Figuras 2D y E); el resto de las diferenciales no mostraron síntomas. A B C D Figura 3. Partículas virales observadas en el A) purificado parcial de virus (PPV) obtenido de cladodios con síntomas de “Pinto” colectados en campo y B) obtenido de cladodios inoculados con PPV. C) Epidermis de hojas de Chenopodium amaranticolor inoculadas con el PPV obtenido de cladodios con síntomas de “Pinto” mostrando una inclusión viral paracristalina (E=Estoma, N=núcleo, I= Inclusión viral) y D) amorfa (N=núcleo, I=inclusión viral). se considera adecuada si se toma en cuenta que la extracción de RNA en nopal es difícil debido al mucílago que posee (Nobel et al., 1992). Los valores de pureza oscilaron de 1.90 a 2.05 que indican una presencia mínima de contaminantes como fenoles, péptidos y otros componentes que podrían interferir en la reacción de PCR (Tapia et al, 2005) (Fig. 4.4). A pesar de esto último, se procedió a realizar RT PCR con primers específicos para el transcrito del gen 18S que amplifican un 34 Rev. Mex. Fitosanidad, 1(1): 29−36, 2017. fragmento de 300 pb aproximadamente y determinar que dichos compuestos no afectaban la reacción. RT-PCR. No se observó amplificación en la RT-PCR a partir de RNA de cladodios con síntomas de “Pinto” utilizando primers universales para Potexvirus (Fig. 4B). A diferencia de lo reportado por Barrera et al., A B (2014), quienes si amplificaron un fragmento de RNA correspondiente a una especie del género Potexvirus. Con los primers universales para Allexivirus se obtuvo una banda no esperada de 750-800 pb en la muestra 3 (Fig. 4C), mientras que con los primers universales para Tobamovirus se amplificó una banda de 400 pb; muestra (Fig. 4D). C D Figura 4. Productos obtenidos de RT- PCR a partir de RNA total de cladodios con síntomas de “Pinto” utilizando los siguientes primers: A) específicos para el gen 18S (300 pb aproximadamente); B) primers universales para Potexvirus, M; marcador molecular 1kb (PROMEGA®); carriles 2-5 muestras de nopal con síntomas de “Pinto”; carril 6; RNA de papa infectada con Potato virus X. C) primers universales para Allexivirus, M; marcador molecular; 1kb (PROMEGA®); carriles M1-M9: muestras de cladodios con síntomas de “Pinto”; carril TN: testigo negativo (agua). D) primers universales para Tobamovirus, M; marcador molecular 1kb (PROMEGA®), carrilles M-3 y M7: RNA de cladodios con síntomas de “Pinto”; TMV RNA de planta de jitomate infectada con Tobacco mosaic virus. CONCLUSIONES La sintomatología presentada en cladodios de nopal en forma de halos cloróticos alrededor de las espinas no está asociado a alguna deficiencia de nutrientes. Se descarta la asociación de algún hongo o bacteria fitopatógena con el síntoma denominado “Pinto”. El virus asociado al “Pinto” del nopal no pertenece al género Potexvirus o Allexivirus y posiblemente se trate de un Tobamovirus. LITERATURA CITADA ABADÍA, J. 1992. Leaf Responses to Fe deficiency: a review. J. Plant Nutr., 15: 1699−1713. ADILOGLU, S. 2006. 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