Download Estudio Antagonismo Patogeno

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS EXACTAS E INGENIERÍAS TITULO DEL PROYECTO Registro: ECO‐2010‐C01‐146049 “Mejora en la salud ocupacional por decremento de incapacidades causadas por enfermedades generales así como evitar costos directos e indirectos derivados de estas mismas incapacidades, por la implementación de alimentos funcionales en comedores industriales” REPORTE TÉCNICO Análisis de efectividad biológica para acción antagónica de microorganismos probióticos en acción simbiótica sinérgica versus microorganismos patógenos propios de enfermedades gastrointestinales generales Mayo 2011 1 TITULO: Análisis de efectividad biológica para acción antagónica de microorganismos probióticos en acción simbiótica sinérgica versus microorganismos patógenos propios de enfermedades gastrointestinales generales. PARTICIPANTES DEL PROYECTO Investigadores de la Universidad de Guadalajara Dr. Raúl Snell Castro, líder del grupo Dra. Mayra Márquez González, colaborador Estudiantes, formación de recursos humanos Adriana Berenice Arias Orozco Mexicana, tesista del Doctorado en Ciencias en Procesos Biotecnológicos Tesis: Diseño y evaluación de un alimento funcional a base de probióticos utilizando técnicas moleculares y de cultivo clásico Participación en el proyecto desde el inicio hasta la fecha. María Lilia Navarro Ventura Mexicana, tesista de la licenciatura en Químico Farmacobiólogía Tema de tesis: Antagonismo de Bifidobacterium animalis BI07 contra Salmonella y E. coli O157:H7 Participa en la primera etapa del proyecto. Estudio de patogenicidad. María de la Luz Reyes Martínez Mexicana, tesista de la licenciatura en Químico Farmacobiólogía Tema de tesis: Antagonismo de Lactobacillus rhamnosus NH001 contra Salmonella y E. coli O157:H7 Participa en la primera etapa del proyecto. Estudio de patogenicidad. Yolanda Berenice Solís Caldera Mexicana, tesista de la licenciatura en Químico Farmacobiólogía Tema de tesis: Antagonismo de Lactobacillus acidophilus NCFM contra Salmonella y E. coli O157:H7 Participa en la primera etapa del proyecto. Estudio de patogenicidad. Además de los tesistas señalados, participan otros estudiantes de las carreras de Ingeniería química, químico farmacobiólogía y licenciatura en química, que prestan su servicio social en el Laboratorio de Microbiología e Inocuidad de los Alimentos del CUCEI de la Universidad de Guadalajara, donde se llevó a cabo el estudio de patogenicidad. 2 INTRODUCCIÓN Los probióticos son microorganismos vivos que administrados en las cantidades adecuadas, confieren beneficios a la salud del hospedador. Debe ser indicada la dosis y duración de su consumo por la empresa que lo produce, y debe ser específica para cada cepa basándose en evidencia científica, así como indicar el consumo mínimo diario requerido para conferir los beneficios a la salud. Esta evidencia debe provenir de estudios in vitro, en animales y en estudios con humanos (FAO/WHO, 2001). El uso más difundido de los microorganismos probióticos es para tratar y prevenir desordenes gastrointestinales. Diversas cepas probióticas han demostrado que inhiben el crecimiento y actividades metabólicas como la adhesión a las células intestinales de bacterias enteropatógenas como Salmonella, Shigella, E. coli o Vibrio cholerae. Los mecanismos por los que logran estos efectos en la microbiota intestinal son que producen la disminución del pH, producción de sustancias antimicrobianas como los ácidos orgánicos (láctico, acético, butírico), peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, aglutinación de microorganismos patógenos, adherencia celular a la superficie de la mucosa y competición por sustratos fermentables o sus receptores, aumentan el efecto de barrera de la mucosa intestinal produciendo metabolitos protectores (arginina, glutamina, ácidos grasos de cadena corta, ácidos linoleicos conjugados), secuestran y metabolizan metabolitos tóxicos, reducen la intolerancia a la lactosa, modulan efectos inmunológicos, regulan la motilidad intestinal y la producción de mucosidad (Vrese y col., 2007). Las cepas utilizadas como probióticos se espera que sean productoras de sustancias antimicrobianas como ácido láctico, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas entre otras. (Brizuela y col., 2001). En diversos estudios se ha demostrado que los probióticos pueden tener efectos terapéuticos y prevenir diarreas de diversas etiologías, permitiendo su clasificación como ingredientes funcionales. En investigaciones clínicas con humanos se han estudiado los efectos de microorganismos probióticos como Lactobacillus rhamnosus GG, L. reuteri, ciertas cepas de L. casei, L. acidophilus, Escherichia coli Nissle 1917, y ciertas bifidobacterias y enterococos (Enterococcus faecium SF68) así como la levadura Saccharomyces boulardii. Sin embargo estos estudios han sido en muestras pequeñas (n=100) y no se conocen datos epidemiológicos de los efectos a largo plazo de los probióticos. Aún así, se ha demostrado su efectividad en diarreas nosocomiales y diarreas provocadas por la administración antibióticos (Vrese y col., 2007). Las cepas Lactobacillus rhamnosus CRL1505 (Lr05) y L. rhamnosus CRL1506 demostraron estimular el sistema inmune y aumentar la resistencia contra patógenos intestinales (Salmonella typhimurium) y patógenos respiratorios (Streptococcus pneumoniae) en un estudio realizado en ratones albinos. Se demostró que aumentó las citoquinas las cuales aumentan la respuesta inmune y que ambas cepas son capaces de aumentar la resistencia contra Salmonella typhimurium, pero solo la cepa Lr05 fue capaz de inducir significativamente el número de S. pneumonie y aumentar las citoquinas específicas. Por lo tanto se concluye que ciertas cepas de 3 bacterias probióticas pueden compartir ciertas propiedades funcionales, pero algunas pueden ser mejores en determinadas propiedades y otras no, por lo tanto es importante desarrollar estudios en cepas específicas de acuerdo a las propiedades terapéuticas utilizadas (Salva, 2010). La capacidad de adherencia de estos microorganismos probióticos al epitelio intestinal, ha demostrado ser un factor que contribuye en el efecto protector contra microorganismos patógenos. Las células intestinales asociadas a macromoléculas juegan un papel muy importante en la adherencia de bacterias del género Lactobacillus. Estas interacciones pueden explicar la exclusión de los microorganismos patógenos o la modulación de las células de defensa, además de influenciar la activación de factores funcionales como las adhesinas (que son proteínas extracelulares muy específicas que interactúan con los sitios receptores de la célula hospedera) producidas por los probióticos (Perea, 2007). OBJETIVOS Objetivo General Evaluar el antagonismo de las bacterias probióticas Bifidobacterum animalis BI07, Lactobacillus acidophilus NCFM y Lactobacillus rhamnosus NH001 contra los patógenos Salmonella typhimurium y Escherichia coli O157:H7. Objetivos particulares • Evaluar la resistencia a antibióticos de las cepas patógenas Salmonella typhimurium y Escherichia coli O157:H7. • Determinar los halos de inhibición causados por el antagonismo de las cepas probióticas por la técnica “agar spot” o técnica de la gota. • Determinar la inhibición de las bacterias patógenas mediante su cultivo en sobrenadantes de las cepas probióticas METODOLOGÍA Evaluación de resistencia a antibióticos Las cepas patógenas utilizadas en estos ensayos, estuvieron involucradas en Enfermedades Transmitidas por Alimentos. En el caso de la cepa de E. coli O157:H7, fue aislada a partir de una carne molida que causó brotes en Estados Unidos y fue donada por el Dr. Alejandro Castillo de la Universidad Texas A&M. La cepa de Salmonella typhimurium fue aislada 4 de las heces fecales de un paciente y fue proporcionada por la M. en C. Corina Mireles de la Secretaría de Salud Jalisco. La susceptibililidad a los antibióticos se determinó según la metodología descrita en el método M100‐S18 del NCCLS el cual es un estándar para realizar pruebas de suceptibilidad a antibióticos y es publicado por el Clinical and Laboratory Standar Institute (CLSI). Las cepas patógenas E. coli O157:H7 y Salmonella typhimurium fueron reactivadas por siembras sucesivas en Caldo soya tripticasa (CST) marca Bioxon incubado a 35°C hasta alcanzar la turbiedad de 0.5 del estándar de MacFarland. A partir de estos cultivos se tomo una sola vez una alícuota con un hisopo de algodón estéril, y se sembró depositándolo en cajas con agar Mueller Hinton. Se procedió a colocar los discos de manera aséptica, con un máximo de 4 discos por caja y se incubaron de forma invertida a 35°C/16‐ 18h. Las zonas (diámetros) fueron determinadas mediante una regla en la caja invertida. Los resultados se interpretaron según la tabla 2A del documento M100‐S18 donde se indica si son Suceptibles (S), Intermediarios (I) o Resistentes (R). (NCCLS, 2003; NCCLS 2008). Determinación de inhibición por técnica “agar spot” Dos tubos de cada cepa probiótica fueron reactivadas en CST incubadas en condiciones aerobias a 35°C/24 h. Posteriormente se sometieron a centrifugación 2 veces a 65000 rpm/15 minutos. El sobrenadante se guardó en tubos estériles y el sedimento fue descartado. Uno de los tubos de sobrenadante fue sometido a filtración con poro de 0.22 µm (Millipore). Se tomaron 100 µl de sobrenadante filtrado y del sobrenadante no filtrado por duplicado y se colocaron por separado en cajas de petri con agar MRS. Una réplica fue incubada en condiciones aerobias y la otra en anaerobias en jarra de anaerobiosis GasPack EZ con sobre de anaerobiósis (Becton Dickson) a 35°C durante 48h. (Schillinger, 1989). Cultivos individuales de las cepas patógenas a concentración aproximada de 5 X 107 fueron inoculados en tubos con 15 ml de Agar Soya Tripticasa (AST) y fueron colocados a manera de sobre las cajas incubadas con las cepas probióticas. Después de incubarlas en condiciones aerobias durante 24 h a 35°C, se revisaron para observar las zonas de inhibición. La inhibición se considera positiva si hay zonas sin crecimiento alrededor de las cepas probióticas de 0.5 mm o más. Todo el estudio se realizó por triplicado (Schillinger, 1989). Antagonismo por cultivo en sobrenadante Las cepas patógenas fueron reactivadas por separado mediante dos siembras sucesivas en CST a 35°C durante 24 h. Los microorganismos se cultivaron individualmente en caldo MRS (Difco). Dos tubos con cultivos de cada cepa fueron sometidos a centrifugación a 65000 rpm 5 durante 15 min a temperatura de 4°C. Uno de los tubos además se sometió a filtración con filtro de poro de 0.22 µm (Millipore). (Fayol‐Messaoudi y col., 2005). El experimento contó además con un control donde el caldo CST fue acidificado con HCl 1N estéril a un pH semejante al obtenido por el crecimiento de cada cepa. En el caso de la cepa de L. rhamnosus se ajustó 3.8‐3.9, L. acidophilus 4.3‐4.4 y B. animalis 5‐6. (Fayol‐Messaoudi y col., 2005). Se inoculó CST estéril con 100 µl de la cepa patógena, posteriormente se hace una dilución 1:1 con los sobrenadante. Cada combinación de sobrenadante con las dos cepas patógenas se incubaron a 35°C durante los tiempos de muestreo. Se tomaron alícuotas en diferentes tiempos de muestreo según la cepa probiótica: para L. acidophilus T0 a T8 cada hora, L. rhamnosus T0 a T6, B. animalis T0, T3, T6, T9, T12 y T24. Posterior a cada toma de alícuota se elaboraron diluciones decimales y se sembraron por superficie en Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV). Las cajas fueron incubadas 24 h a 35°C. Los resultados obtenidos fueron expresados en medias desviaciones estándar. Todo el estudio se realizó por triplicado. (Fayol‐Messaoudi y col., 2005). RESULTADOS Resistencia a antibióticos La cepa control marcada como E. coli ATCC 25922, obtuvo resultados dentro de los rangos establecidos en las tablas de control de calidad incluidas en el inserto del fabricante de los discos impregnados de antibióticos. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Estos resultados muestran que la cepa de Salmonella typhimurim identificada como la cepa 036S1 es multiresistente a antibióticos. La cepa de E. coli O157:H7 presentó resistencia a la Ampicilina y resistencia intermedia a la Tetraciclina. Además de tratarse de cepas patógenas para humanos, el hallazgo de su capacidad a resistir a antibióticos que comúnmente son utilizado en el tratamiento de las enfermedades que produce, hace que sea de sumo interés el efecto antagónico que puedan presentar microorganismos probióticos como un coadyuvante en la prevención de estas enfermedades. Inhibición técnica “agar spot” Los resultados de esta prueba se presentan en la Tabla 2. Las cajas que fueron incubadas en anaerobiosis en general mostraron inhibiciones mayores o iguales a 0.5 mm, con lo cual según Shillinger (1989) la inhibición puede considerarse positiva, no así en las muestras incubadas en aerobiosis, donde solamente la cepa de L. rhamnosus fue capaz de presentar inhibiciones positivas tanto para E. coli como para Salmonella. 6 Antagonismo por cultivo de sobrenadante El efecto antagónico de L. rhamnosus y L. acidophilus (Figura 1 y 2) muestra que ambas cepas son efectivas en reducir las poblaciones de ambas bacterias patógenas, presentándose mayor efecto en la inhibición de Salmonella typhimurium. Así mismo se puede apreciar como los caldos donde se ajustó el pH no muestran reducciones, ya que se encuentran muy cercanas a los recuentos de los controles, que como ya se mencionó consistieron en el cultivo único de las cepas patógenas. El cultivo de las cepas patógenas en sobrenadante B. animalis, no mostró disminución aparente de los cultivos de E. coli O157:H7 ni Salmonella typhimurium, pero así mismo es notable la ausencia de su crecimiento, mientras que en los controles y en el caldo con el pH ajustado se observa un aumento de casi 5 logaritmos. CONCLUSIONES • La cepa patógena de E. coli O157:H7 presenta resistencia a la ampicilina, mientras que la cepa de Salmonella typhimurium presenta resistencia a 7 antibióticos de 13 que fueron probados, por lo que se trata de una cepa multirresistente a antibióticos. • La técnica de antagonismo “agar spot” demuestra que las cepas probióticas Bifidobacterum animalis BI07, Lactobacillus acidophilus NCFM y Lactobacillus rhamnosus NH001 probadas en condiciones anerobias, fueron positivas en la inhibición de las cepas patógenas y solamente L. rhamnosus presentó inhibición positiva en aerobiosis • Los controles de los caldos ajustados a pH de los cultivos de las cepas probióticos, demuestran que el efecto antagónico no está relacionado con la producción de ácido, sino de otro tipo de moléculas, proteínas que presentan funciones de bacteriocinas. PRESPECTIVAS Para tener un panorama más amplio sobre el efecto antagónico de las cepas probióticas, es necesario aislar, identificar y obtener pesos moleculares de las proteínas producidas por las cepas probióticas que tengan funciones de bacteriocinas. Adicionalmente, como parte de esta investigación se desarrollará un protocolo de investigación donde se pruebe el efecto antagónico en co‐cultivo donde se inoculen células 7 probióticas libres de sustancias inhibitorias preexistentes en el medio de cultivo y las cepas patógenas para observar el efecto de la interacción de ambas células. Los resultados de esta primera etapa, serán conjuntados con los datos que se obtengan del estudio de co‐cultivo para preparar un manuscrito que será enviado a una revista científica internacional indexada para su publicación. BIBLIOGRAFÍA Brizuela M. A., Serrano A., Pérez Y. 2001. Studies on Probiotics Properties of Two Lactobacillus Strains. Braz Arch Biol Tech. 44:95‐99. Fayol‐Messaoudi D., C. N. Berger, M. Coconnier‐Polter, V. Liévin‐Le Moal, A. L. Servin. 2005. pH, Lactic Acid‐, and Non‐Lactic Acid‐Dependent Activities of Probiotic Lactobacillus against Salmonella enteric Serovar Thyphimurium. Appl. Environ. Microbiol. 71:6008‐6013. Food and Agriculture Organitation of the United Nations. 2001. Health and Nutricional Properties of Probiotics in Food including Power Milk with Live Lactic Acid Bacterial. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Consultado el 04/02/2011, http://www.who.int/foodsafety/publications/fs_management/en/probiotics.pdf. NCCLS. January 2003. Performance Standars for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standar‐Eight Edition. M2‐A8. Vol 23 No. 1 NCCLS. January 2008. Performance Standars for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement. M100‐S18. Vol 28. No. 1 Perea M., Sigrid C.J. De Keersmaecker y Jos Vanderleyden. 2007. Adherence factors of Lactobacillus in the human gastrointestinal tract. FEMS Microbiol Lett 276 (2007) 140–
148. Salva S., Julio Villena , Susana Alvarez. 2010. Immunomodulatory activity of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from goat milk: Impact on intestinal and respiratory infections. International Journal of Food Microbiology 141, 82–89. Sillinger U., F. Lücke. 1989. Antibacterial Activity of Lactobacillus sake Isolated from Meat. Appl. Envron. Microbiol. 55:1901‐1906. Vrese M., and Philippe R. Marteau. 2007. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. J. Nutr. 137: 803S–811S. 8 Tabla 1. Resultados de la prueba de sensibilidad a antibióticos de las cepas E. coli O157:H7 y Salmonella typhimurium. Antibiótico E. coli O157:H7 EC 003 Salmonella typhimurium 36S1 Ampicilina R R Cefalotina S R Cefoxitina S R Ceftriaxona S R Cloranfenicol S R Ciprofloxacino S S Imipem S S Gentamicina S S Kanamicina S S Ácido nalidíxico S R Streptomicina S R Tetraciclina I R Trimetropin‐sulfametoxazol S S R= resistente; I= intermedio; S= susceptible. 9 Tabla 2. Diámetros de inhibición de las bacterias patógenas Salmonella typhimurium y E. coli O156:H7 obtenidos a partir de la técnica de “agar spot” alrededor de la colonia de la cepa probiótica. E. coli O157:H7 Salmonella typhimurium Diámetro de inhibición de cultivos Diámetro de inhibición de cultivos provióticos incubados en condiciones provióticos incubados en condiciones de de anaerobiosis aerobiosis L. acidophilus L. rhamnosus B. animalis L. acidophilus L. rhamnosus B. animalis 3.7±1.2* 4.1±0.5 0.6±0.1 0.0±0.0 3.1±1.1 0.0±0.0 3.2±0.8 4.1±0.8 0.5±0.1 0.0±0.0 3.5±0.2 0.0±0.0 * Diámetros de inhibición en cm. Cada dato representa el promedio de tres réplicas ± la desviación estándar. 10 Figura 1. Reducción de cepas patógenas mediante cultivo en sobrenadante de L. rhamnosus. A) Reducción de Salmonella typhimurium. B) Reducción de E. coli O157:H7. A 10.0
9.0
Log 10 UFC/ml
8.0
7.0
6.0
control
5.0
4.0
CST pH
3.0
Filtrado
2.0
No filtrado
1.0
0.0
0
2
4
6
8
Tiempo, horas
LOG 10
B 10.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
control
CST pH
Filtrado
No filtrado
0
2
4
6
Tiempo, horas
11 8
Figura 2. Reducción de cepas patógenas mediante cultivo en sobrenadante de L. acidophilus. A) Reducción de Salmonella typhimurium. B) Reducción de E. coli O157:H7. A 10.0
9.0
Log 10 UFC/ml
8.0
7.0
6.0
control
5.0
4.0
CST pH
3.0
Filtrado
2.0
No filtrado
1.0
0.0
0
2
4
6
8
10
Tiempo, horas
B 10.0
9.0
Log 10 UFC/ml
8.0
7.0
6.0
control
5.0
4.0
CST pH
3.0
Filtrado
2.0
No filtrado
1.0
0.0
0
2
4
6
Tiempo, horas
12 8
10
Figura 3. Reducción de cepas patógenas mediante cultivo en sobrenadante de B. animalis. A) Reducción de Salmonella typhimurium. B) Reducción de E. coli O157:H7. A 10.0
9.0
Log 10 UFC/ml
8.0
7.0
6.0
control
5.0
4.0
CST pH
3.0
Filtrado
2.0
No filtrado
1.0
0.0
0
2
4
6
8
Tiempo, horas
B 12.0
Log 10 UFC/ml
10.0
8.0
control
6.0
CST pH
4.0
Filtrado
No filtrado
2.0
0.0
0
2
4
6
Tiempo, horas
13 8